የአሁኑ†የአሁኑ አድራሻ፡ OX11 0DE፣ UK፣ Diamond Building፣ Harwell Science and Innovation Park፣ Dietcote፣ Oxfordshire፣ UK፣ Diamond Light Source Co., Ltd.፣ የኤሌክትሮኒክስ ባዮሎጂካል ኢሜጂንግ ማዕከል።
የምላሽ ማዕከል ብርሃን-አሰባሰብ ውስብስብ 1 (RC-LH1) ሐምራዊ የፎቶትሮፊክ ባክቴሪያዎች ዋና ፎቶሲንተቲክ አካል ነው። ከሮዶፕሴዩዶሞናስ ፓሉስትሪስ የRC-LH1 ውስብስብ ሁለት ክሪዮ-ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ አወቃቀሮችን አስተዋውቀናል። የRC-LH114-W ውስብስብ 2.65-Å ጥራት መዋቅር RCን የሚከቡ 14 ንዑስ ክፍል LH1 ሉፖችን ያቀፈ ሲሆን ይህም በፕሮቲን W የተቋረጠ ሲሆን ፕሮቲን-W የሌለው ውስብስብ ደግሞ በRC የተከበበ ነው። 16 ንዑስ ክፍል LH1 ዑደት ተዘግቷል። የእነዚህ መዋቅሮች ንጽጽር በRC-LH1 ውስብስብ ውስጥ ስለ ኩዊኖን ተለዋዋጭነት ግንዛቤ ይሰጣል፣ ይህም በRC QB ጣቢያ ላይ ኩዊኖን ሲያስሩ ቀደም ሲል ያልታወቁ የቅርጽ ለውጦችን እንዲሁም ረዳት ኩዊኖን ማያያዣ ቦታዎችን ቦታ ያካትታል፣ ይህም ወደ RC እንዲተላለፉ ይረዳል። የW ፕሮቲን ልዩ መዋቅር የLH1 ሉፕ እንዳይዘጋ ይከላከላል፣ በዚህም የኩዊኖን/ኩዊኖሎን ልውውጥን ለማፋጠን የሚያስችል ቻናል ይፈጥራል።
ፎቶሲንተሲስ የሚሰጠው ኃይል በምድር ላይ ያለውን ሕይወት በሙሉ ማለት ይቻላል ሊቀጥል ይችላል፣ እና ለፀሐይ ባዮቴክኖሎጂ ትልቅ አቅም አለው። ዓለም አቀፍ ፎቶሲንተሲስን ሲያስተዋውቁ፣ ሐምራዊ ፎቶትሮፊክ ባክቴሪያዎች የተለያዩ የኃይል ሁነታዎችን እና የሜታቦሊክ ችሎታዎችን ያሳያሉ። በጨለማ ውስጥ ሄትሮትሮፊክ ባክቴሪያዎች ሲኖሩ ፎቶሲንተሲስን ማስወገድ እና ማደግ ይችላሉ፣ ናይትሮጅን እና ካርቦን ዳይኦክሳይድን ማስተካከል፣ ሃይድሮጂን ማምረት እና የአሮማቲክ ውህዶችን ማበላሸት ይችላሉ (1-3)። ለእነዚህ ሂደቶች ኃይል ለማቅረብ፣ ብርሃን በፍጥነት እና በብቃት ወደ ኬሚካል ኃይል መለወጥ አለበት። ይህ ሂደት የሚጀምረው የብርሃን ማጥመጃ አንቴና ውስብስብ ብርሃንን ሲስብ እና የተጣበቀውን ኃይል ወደ ምላሽ ማዕከል (RC) ሲያስተላልፍ ሲሆን በዚህም የኃይል መለያየት ይጀምራል (4-7)። በሐምራዊ ፎቶትሮፊክ ባክቴሪያዎች ውስጥ ያለው የፎቶሲንተሲስ መሰረታዊ ክፍል በብርሃን መሰብሰብ ውስብስብ 1 (LH1) የተከበበ ሲሆን የ RC-LH1 ኮር ውስብስብ ይፈጥራል። LH1 የሚፈጠረው በተጠማዘዙ αβ ሄትሮዲመሮች ድርድር ሲሆን እያንዳንዳቸው ሁለት የባክቴሪያ ክሎሮፊል (BChl) ሞለኪውሎችን እና አንድ ወይም ሁለት ካሮቲኖይድ (8-12) ያስራሉ። በጣም ቀላሉ የLH1 አንቴና RC (9-13)ን በተዘጋ ዑደት የሚከቡ 16 ወይም 17 αβ ሄትሮዲመሮችን ያቀፈ ሲሆን በሌሎች ዋና ዋና ውህዶች ውስጥ ግን የትራንስሜምብራን ፔፕታይዶች በዙሪያው ያለውን LH1 ቀጣይነት ያቋርጣሉ፣ በዚህም በRC እና በሳይቶክሮም bc1 ውስብስብ መካከል ያለውን የኩዊኖል/ኩዊኖን ስርጭት ያበረታታሉ (11፣ 13-15)። ሐምራዊው የፎቶትሮፊክ ተክል ሮዶፕሴዩዶሞናስ (Rps.) ፎቶሲንተሲስን የሚደግፍ ኃይልን እና የኤሌክትሮን ዝውውርን የሚረዳ የሞዴል ኦርጋኒክ ነው። የRps የመጀመሪያው ክሪስታል መዋቅር። የፓሉስትሪስ RC-LH1 ውስብስብ ሞዴል RC ሲሆን በ15 ሄትሮዲሜሪክ LH1 ሉፖች የተከበበ ሲሆን እነዚህም “ፕሮቲን W” (14) በሚባል ባልታወቀ ፕሮቲን የተቋረጡ ናቸው። ፕሮቲን-W በመቀጠል RPA4402 ተብሎ ተለይቷል፣ ይህም ሶስት የተተነበዩ ትራንስሜምብራን ሄሊስ (TMH) ያለው ያልተለየ 10.5kDa ፕሮቲን ነው (16)። የ RC-L፣ M (pufL፣ pufM) እና LH1α፣ β (pufA፣ pufB) ንዑስ ክፍሎችን ለሚገልጹ ጂኖች ጥቅም ላይ ከሚውለው የስም ዝርዝር ጋር የሚስማማ እንዲሆን የrpa4402 ጂን ኢንኮዲንግ ፕሮቲን W ወደ pufW እንደገና ለመሰየም ሀሳብ እናቀርባለን። የሚገርመው ነገር፣ ፕሮቲን-W የሚገኘው በ RC-LH1 10% አካባቢ ብቻ ሲሆን፣ Rps. palustris ሁለት የተለያዩ የ RC-LH1 ውስብስብ ነገሮችን ያመነጫል። እዚህ፣ የሁለት ዋና ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ ውስብስብ አወቃቀርን ሪፖርት እናደርጋለን፣ አንደኛው ፕሮቲን W እና 14 αβ heterodimers ያለው፣ ሌላኛው ያለ ፕሮቲን W እና የተዘጋ 16 Heterodimer LH1 loop። አወቃቀራችን የ Rps. palustris RC-LH1 ውስብስብ ግንዛቤ ላይ የደረጃ ለውጥን ይወክላል፣ ምክንያቱም የእያንዳንዱን ልዩነት ተመሳሳይነት ያለው ህዝብ ተንትነናል እና እያንዳንዱን ፔፕታይድ እና የታሰሩ ቀለሞችን እና ተዛማጅ ቅባቶችን እና ኩዊኖኖችን በግልጽ ለመመደብ በቂ ጥራት ስላለን ነው። የእነዚህ መዋቅሮች ንጽጽር እንደሚያሳየው እስካሁን ድረስ በሌላ የRC-LH1 ውስብስብ ውስጥ ያልተገኙት ሶስት የTMH ፕሮቲኖች-W የኩዊን/ኩዊንሎን ልውውጥን ለማፋጠን የኩዊንኖን ቻናል ያመነጫሉ። በርካታ የተጠበቁ የሊፒድ እና የኩዊን ማያያዣ ቦታዎች ተለይተዋል፣ እና ከኩዊን እና RC ጥምረት በኋላ አዲስ የቅርጽ ለውጥ ገልጸናል፣ ይህም ለኦክሲጅን የተሞሉ የፎቶትሮፊክ ህዋሳት ፎቶሲስተም II (PSII) RC ተስማሚ ሊሆን ይችላል። ግኝቶቻችን በሐምራዊ ፎቶትሮፊክ ባክቴሪያ RC-LH1 ኮር ውስብስብ ውስጥ የኩዊን/ኩዊንኖሎን ማያያዣ እና ልውውጥ ኪነቲክስን በተመለከተ አዲስ ግንዛቤዎችን ይሰጣሉ።
በ Rps. palustris ውስጥ የሚገኙትን ሁለት ውስብስብ ነገሮች ዝርዝር ጥናት ለማመቻቸት፣ እያንዳንዱን RC-LH1 በባዮኬሚካላዊ ዘዴዎች እንለያያለን። የፕሮቲን W-የጎደለው ውስብስብ (ከዚህ በኋላ ΔpufW ተብሎ የሚጠራው) የpufW ጂን ከሌለው ዝርያ (16) ተጠርጓል፣ እና አንድ የ RC-LH1 ውስብስብ ብቻ ሊመረት ይችላል። የፕሮቲን W-የያዘው ውስብስብ በዘር ይመረታል። የዚህ ዝርያ ፕሮቲን W በC-terminus ላይ በ10x His tag ተሻሽሏል፣ ስለዚህ ፕሮቲን W-የያዘው ውስብስብ ከአብዛኛዎቹ የጎደለው ፕሮቲን W ጋር በብረት በማገድ ውጤታማ በሆነ መንገድ ሊጣመር ይችላል። ውህዱ በብቃት ተለያይቷል (16) የአፊኒቲ ክሮማቶግራፊ (IMAC)።
በስእል 1 ላይ እንደሚታየው፣ ሁለቱም ውህዶች በLH1 አንቴና የተከበቡ ሶስት ንዑስ አሃድ RC (RC-L፣ RC-M እና RC-H) ይዘዋል። ፕሮቲን-W የሌለው ውስብስብ 2.80-A መዋቅር 16 αβ ሄተርዲመሮችን ያሳያል፣ ሙሉ በሙሉ RCን የሚከበብ የተዘጋ LH1 ዑደት ይፈጥራል፣ ከዚህ በኋላ RC-LH116 ውስብስብ ተብሎ ይጠራል። የፕሮቲን-W የያዘው ውስብስብ 2.65Å መዋቅር በፕሮቲን-W የተቋረጠ 14-ሄተርዲመር LH1 አለው፣ ከዚህ በኋላ RC-LH114-W ይባላል።
(A እና B) የውህዱ የገጽታ ውክልና። (C እና D) በበትሮች የተገለጹ የተሳሰሩ ቀለሞች። (E እና F) ከሳይቶፕላዝማክ ወለል የሚታዩት ውስብስብ ነገሮች በካርቱን ውስጥ የተወከሉት ፔፕታይዶች እና LH1 ንዑስ ክፍሎች አሏቸው፣ እና ከፕሮቲን-W ክፍተት በሰዓት አቅጣጫ ተቆጥረዋል [ከRba ቁጥር ጋር የሚስማማ። sphaeroides ውስብስብ (13)]። ለLH1-α፣ የፕሮቲን ንዑስ ክፍል ቀለም ቢጫ ነው፤ ለLH1-β፣ የፕሮቲን ንዑስ ክፍል ቀለም ሰማያዊ ነው፤ ለፕሮቲን-W፣ ፕሮቲን ቀይ ነው፤ ለRC-H፣ ሲያን ነው፤ ለRC-L፣ ብርቱካናማ ነው፤ ለRC-M፣ ማጀንታ። ኮፋክተሮች በበትሮች ይወከላሉ፣ አረንጓዴ BChl እና BPh a ሞለኪውሎችን ይወክላል፣ ወይንጠጅ ቀለም ካሮቲኖይድን ይወክላል፣ እና ቢጫ UQ10 ሞለኪውሎችን ይወክላል። (G እና H) በRC-LH114-W ውስብስብ (G) እና RC-LH116 ውስብስብ (H) ተመጣጣኝ ክልል ውስጥ የፕሮቲን-W ክፍተትን የሚያጎላ እይታ። ኮፋክተሮች በቦታ ሙሌት መልክ ይታያሉ፣ ኬላቴድ ኩዊኖን በሰማያዊ ይታያል። የፕሮቲን-W ክፍተት በሰማያዊ የተቆራረጠ መስመር በ(G) ውስጥ ይታያል፣ እና ኩዊኖን/ኩዊኖሎል በLH116 ቀለበት ላይ የሚሰራጭባቸው ትናንሽ ቀዳዳዎች በ(H) ውስጥ ባለ ጥቁር የተቆራረጠ መስመር ይደምቃሉ።
ምስል 1 (A እና B) በክፍት ወይም በተዘጉ የLH1αβ ሄትሮዲመሮች የተከበበውን RC ያሳያል፣ እያንዳንዳቸው ሁለት BChl እና አንድ ካሮቲኖይድ ያያይዛሉ (ምስል 1፣ C እና D)። ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች Rps የLH1 ውስብስብ መሆኑን አሳይተዋል። በስፒሩሊና ዛንቲን ባዮሲንተቲክ መንገድ ውስጥ፣ እነዚህ ዝርያዎች የተደባለቁ የካሮቲኖይድ ህዝቦችን ይይዛሉ (17)። ሆኖም፣ ስፒሮፒሮክሳንቲን ዋነኛው ካሮቲኖይድ ሲሆን ጥግግቱ አጥጋቢ ነው። ስለዚህ፣ በሁሉም የLH1 ማያያዣ ቦታዎች ላይ ስፒሮክሳንቲንን ሞዴል ለማድረግ መርጠናል። የአልፋ እና የቤታ ፖሊፔፕታይዶች አጭር ሽፋን ያላቸው ውጫዊ ክልሎች ያላቸው ነጠላ TMHዎች ናቸው (ምስል 1፣ A፣ B፣ E እና F)። በC-terminus ላይ የ17 ቅሪቶች ጥግግት ባይታይም፣ የአልፋ ፖሊፔፕታይድ በሁለቱም ውህዶች ከMet1 ወደ Ala46 ተከፍሏል። β ፖሊፔፕታይድ በRC-LH116 ከGly4 ወደ Tyr52 እና በRC-LH114-W ከSer5 ወደ Tyr52 ቀንሷል። የ3 ወይም 4 N-ተርሚናል ወይም 13 C-ተርሚናል ቅሪቶች ጥግግት አልታየም (ምስል S1)። ከዱር ዓይነት ዝርያ የተዘጋጀውን የተደባለቀ የRC-LH1 ውስብስብ የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ትንተና እንደሚያሳየው የጎደለው ክልል የእነዚህ ፔፕታይዶች ሄትሮሎግየስ መለያየት ውጤት ነው (ምስል S1 እና S2)። የα-Met1 N-ተርሚናል ፎርሜሽንም ታይቷል (f)። ትንታኔው እንደሚያሳየው α-peptide ከAsp42/Ala46/Ala47/Ala50 ቅሪቶች fMet1 ጋር የተዋሃደ ሲሆን β-peptide ደግሞ ከዝቅተኛ የሙቀት መጠን EM ጥግግት ካርታ ጋር በጥሩ ሁኔታ የሚስማማውን ከSer2 እስከ Ala53 ቅሪቶች ያካትታል።
የα-His29 እና ​​β-His36 ቅንጅት BChlsን ፊት ለፊት ያደርገዋል፤ እያንዳንዱ αβ heterodimer ከጎረቤቶቹ ጋር ይሰበሰባል እና በRC ዙሪያ ክፍት ዑደት (RC-LH114-W) ወይም የተዘጋ ዑደት (RC-LH116) ይፈጥራል። የኤክሳይቶን የተጣመረ የቀለም ድርድር (ምስል 1፣ C እና D)። ከRC-LH114-W 877 nm ባንድ ጋር ሲነጻጸር፣ የRC-LH116 880 nm የመምጠጥ ቀይ ሽግግር 3 nm ነው (ምስል 2A)። ሆኖም፣ ክብ ቅርጽ ያለው ዲክሮይዝም ስፔክትረም ከሞላ ጎደል ተመሳሳይ ነው (ምስል 2B)፣ ምንም እንኳን በክፍት እና በተዘጉ ሉፖች መካከል ግልጽ የሆነ ልዩነት ቢኖርም፣ የBChls የአካባቢ አካባቢ በጣም ተመሳሳይ ነው። የመምጠጥ ቀይ ሽግግር በተዘጋው ዑደት ላይ የሙቀት እንቅስቃሴ መቀነስ እና በተዘጋው ዑደት ላይ የጨመረ መረጋጋት ውጤት ሊሆን ይችላል (18፣ 19)፣ በተዘጋው ዑደት (20፣ 21) ምክንያት የሚመጣው የቀለም ትስስር ለውጥ ወይም የእነዚህ ሁለት ውጤቶች ጥምረት (11)።
(ሀ) አልትራቫዮሌት/የሚታይ/በአቅራቢያ የሚገኝ የኢንፍራሬድ መምጠጥ ስፔክትረም፣ ጫፎቹ በተዛማጅ ቀለሞች ምልክት የተደረገባቸው እና በ775 nm ወደ BPh ጫፍ መደበኛ የተደረጉ ናቸው። (ለ) ክብ ዳይክሮይዝም ስፔክትረም በ805 nm ወደ BChl መምጠጥ መደበኛ ሆኗል። (C እና D) የRC-LH114-W ውስብስብ (C) እና የRC-LH116 ውስብስብ (D) በጊዜ የተፈታ የመምጠጥ ስፔክትራ የተመረጡ ΔA ስፔክትራ። ለተሻለ ንጽጽር፣ ሁሉም ስፔክትራዎች በ0.2 ps ወደ ∆A of −A መደበኛ ይሆናሉ። (E) የተለያዩ የUQ2 ክምችቶች ባሉበት ጨረር ከጨረር በኋላ የሳይቶክሮም c2 ኦክሳይድ መጠን (ጥሬ መረጃ ለማግኘት ምስል S8ን ይመልከቱ)። (F) በዝቅተኛ፣ መካከለኛ ወይም ከፍተኛ ጥንካሬ ብርሃን (10፣ 30 ወይም 300μMm-2 s-1 በቅደም ተከተል)፣ በተጣራው ውስብስብ እና በተለየው የሽፋን ጥምርታ ውስጥ በሚበቅሉ ሴሎች ውስጥ፣ የፕሮቲን W እና የRC-L ንዑስ ክፍሎች (10፣ 30 ወይም 300μMm-2 s-1 በቅደም ተከተል)፣ በተጣራው ውስብስብ እና በተለየው የሽፋን ጥምርታ ውስጥ ያሉ የፕሮቲን W እና የRC-L ንዑስ ክፍሎች። የፕሮቲን ደረጃውን በSDS-polyacrylamide ጄል ኤሌክትሮፎረሲስ እና ኢሚውኖአሳይ ይወስኑ (ጥሬ መረጃ ለማግኘት ምስል S9ን ይመልከቱ)። ከተጣራው RC-LH114-W ውስብስብ ጋር ሲነጻጸር ጥምርታውን ይወስኑ። የውህዱ RC-L እና ፕሮቲን-W ስቶይቺዮሜትሪክ ጥምርታ 1:1 ነው።
በRC-LH114-W በተበላሸ αβ14 ዑደት (ምስል 1፣ A፣ C እና E) ውስጥ በቦታ 1 ላይ ያሉት BChls በRC-LH116 ውስጥ ካሉት ተመጣጣኝ BChls (ምስል 1፣ B፣ D እና F እና ምስል S3) ጋር ሲነጻጸር ከRC ዋና ለጋሽ (P) በ6.8Å ቅርብ ናቸው፤ ሆኖም ግን፣ የሁለቱ ውስብስብ ነገሮች ጊዜያዊ የመምጠጥ ኪነቲክስ ለRC-LH114-W እና RC-LH116፣ ከLH1 ወደ RC የሚነሱት የማነቃቂያ ኃይል ማስተላለፊያ ጊዜ ቋሚዎች 40 ±4 እና 44±3 ps መሆናቸውን ያሳያሉ (ምስል 2)።፣ C እና D፣ ምስል S4 እና ሰንጠረዥ S2)። በRC ውስጥ በኤሌክትሮኒክ ዝውውር ላይም ምንም ጉልህ ልዩነት የለም (ምስል S5 እና ተዛማጅ ተጨማሪ ጽሑፍ)። በLH1 እና RC-P መካከል ያለው የኃይል ማስተላለፊያ ጊዜ የጠበቀ ትስስር በሁለቱ LH1 ዙሮች ውስጥ ካለው የአብዛኛው BChl ርቀት፣ አንግል እና እምቅ ኃይል ጋር ተመሳሳይ ነው ብለን እንገምታለን። ዝቅተኛውን ርቀት ለመድረስ የLH1 የኃይል ንድፍን መመርመር ከዝቅተኛ ቦታዎች ወደ RC ከሚደረገው ቀጥተኛ የኃይል ዝውውር ፈጣን አይደለም። በRC-LH114-W ውስጥ ያለው ክፍት-ሉፕ LH1 ሉፕ ለመዋቅራዊ ትንተና በዝቅተኛ የሙቀት ሁኔታዎች ውስጥ አነስተኛ የሙቀት እንቅስቃሴ ሊያጋጥመው ይችላል፣ እና በRC 1 ቦታ ላይ ካለው የβBChls የቀለም ርቀት በክፍል ሙቀት ውስጥ ረዘም ያለ የαβ14 ቀለበት ቅርፅ አለ።
የRC-LH116 ውስብስብ 32 BChls እና 16 ካሮቲኖይድስን ይይዛል፣ እና አጠቃላይ አቀማመጡ ከThermochromatium (Tch.) pidpidum [የፕሮቲን ዳታ ባንክ (PDB) ID 5Y5S] (9)፣ Thiorhodovibrio (Trv.) 970 ዝርያ (PDB ID 7C9R) (12) እና አረንጓዴ አልጌ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) ከተገኘው ጋር ተመሳሳይ ነው። ከተስተካከለ በኋላ፣ በαβ heterodimers አቀማመጥ ላይ ትናንሽ ልዩነቶች ብቻ ታይተዋል፣ በተለይም 1-5፣ 15 እና 16 (ምስል S6)። የፕሮቲን-W መኖር በLH1 አወቃቀር ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራል። ሦስቱ TMHs በአጭር ዑደቶች የተገናኙ ናቸው፣ N-ተርሚናል በኮምብሌቱ ሉመን ጎን እና C-ተርሚናል በሳይቶፕላስሚክ ጎን (ምስል 1A እና 3፣ A እስከ D)። ፕሮቲን-ደብሊው በአብዛኛው ሃይድሮፎቢክ ነው (ምስል 3ቢ)፣ እና TMH2 እና TMH3 ከ LH1αβ-14 ጋር ይገናኛሉ፣ ይህም የትራንስሜምብራን ወለል ይፈጥራል (ምስል 3፣ B እና E ወደ G)። በይነገጹ በዋናነት በትራንስሜምብራን ክልል ውስጥ ከሚገኙት የ Phe፣ Leu እና Val ቅሪቶች የተዋቀረ ነው። እነዚህ ቅሪቶች በሃይድሮፎቢክ አሚኖ አሲዶች እና αβ-14 ቀለሞች የተደረደሩ ናቸው። አንዳንድ የዋልታ ቅሪቶችም ለግንኙነት አስተዋጽኦ ያደርጋሉ፣ ይህም በውስብስብ ክፍተት ወለል ላይ በ W-Thr68 እና β-Trp42 መካከል ያለውን የሃይድሮጂን ትስስር ያካትታል (ምስል 3፣ F እና G)። በሳይቶፕላዝም ወለል ላይ፣ Gln34 ከ αβ-14 ካሮቲኖይድ ኬቶ ቡድን አጠገብ ይገኛል። በተጨማሪም፣ n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ሞለኪውል ተፈትቷል፣ እና ሃይድሮፎቢክ ጅራቱ በፕሮቲን-W እና αβ-14 መካከል ወዳለው ግንኙነት ተዘርግቷል፣ እና የሊፒድ ጅራቱ በሰውነት ውስጥ ሊኖር ይችላል። በተጨማሪም የፕሮቲን W እና RCH የC-ተርሚናል ጥራት ክልሎች በጣም ቅርብ መሆናቸውን አስተውለናል፣ ነገር ግን የተወሰኑ ግንኙነቶችን ከመፍጠር ወሰን ውስጥ አይደሉም (ምስል 1፣ A እና E)። ሆኖም፣ በእነዚህ ሁለት ፕሮቲኖች ያልተፈቱ የC-ተርሚናል አሚኖ አሲዶች ውስጥ መስተጋብር ሊኖር ይችላል፣ ይህም በRC-LH114-W ውስብስብ ስብሰባ ወቅት ፕሮቲን-Wን ለመመልመል የሚያስችል ዘዴ ሊያቀርብ ይችላል።
(ሀ) ፕሮቲን-ደብሊው፣ በካርቱን መልክ ከLH1αβ14 ጋር ያለውን በይነገጽ የሚመለከተው፣ በኤሌክትሮስታቲክ እምቅ ዲያግራም ክፍል ውስጥ የሚታየው በትር ቅርጽ ያለው የጎን ሰንሰለት (ቀይ) አለው (0.13 የሆነ የቅርጽ ደረጃ ያለው ግልጽ ግራጫ ወለል)። (ለ) ፕሮቲን-ደብሊው በሃይድሮፎቢክ ባለቀለም ወለል የተወከለ። የፖላር እና የተሞሉ ቦታዎች በሲያን ይታያሉ፣ ሃይድሮፎቢክ አካባቢዎች በነጭ ይታያሉ፣ እና ጠንካራ ሃይድሮፎቢክ አካባቢዎች በብርቱካናማ ይታያሉ። (ሐ እና መ) ፕሮቲን-ደብሊው በካርቱን ውስጥ የተወከለው፣ አቀማመጡ በ(A) (C) ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይ ነው፣ እና በ180° (D) ይሽከረከራል። በቅደም ተከተል ውስጥ ባለው አቀማመጥ መሠረት፣ የሚለዩት ቅሪቶች የቀስተ ደመና ቀለም ንድፍን ይቀበላሉ፣ N-ተርሚናል ሰማያዊ እና C-ተርሚናል ቀይ ነው። (ሠ) ፕሮቲን-ደብሊው በ(A) ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይ እይታ፣ እና በፕሮቲን-ደብሊው:LH1 በይነገጽ ላይ ያሉት ቅሪቶች በተያያዙ ምልክቶች በተያያዙ ዘንጎች ይወከላሉ። (F) ፕሮቲን-ደብሊው በካርቱን ውክልና ውስጥ ከ (E) እና LH1αβ14 ጋር ሲነጻጸር 90° እና በባር ውክልና ውስጥ ካሉት የበይነገጽ ቅሪቶች አንጻር ይሽከረከራል። ከቤታ ፖሊፔፕታይድ የተደረደሩ ቅሪቶች መለያ ተሰጥቷቸዋል። ኮፋክተሩ ከምስል 1 ቀለም ጋር የሚዛመድ ባር ሆኖ ይታያል፣ የተበታተነው β-DDM በግራጫ ይታያል፣ እና ኦክስጅን በቀይ ይታያል። (G) በ(F) ውስጥ ያለው እይታ 180° ሲሆን፣ ከተሰየመው የአልፋ ፖሊፔፕታይድ ግልጽ ቅሪቶች ጋር።
ፕሮቲን-ደብሊው የαβ ሄተርዲመርን (በምስል 1F ውስጥ 15ኛውን) ይተካል፣ በዚህም የሉፕ መዘጋትን ይከላከላል እና የመጀመሪያዎቹን ሶስት αβ ሄተርዲመሮች ያዘንባል። የመጀመሪያው αβ-1 ሄተርዲመር ከፊልሙ መደበኛ ጋር ሲነጻጸር ከፍተኛው የማዘንበል አንግል ከ25° እስከ 29° እንደነበር ተስተውሏል (ምስል 1፣ A እና E)፣ ይህም በRC A ስለታም ንፅፅር-LH116 (ምስል 1፣ B እና F) ውስጥ ባለው αβ-1 ከ2° እስከ 8° ዝንባሌ የተፈጠረ ነው። ሁለተኛው እና ሦስተኛው ሄተርዲመሮች በቅደም ተከተል ከ12° እስከ 22° እና ከ5° እስከ 10° ያዘንባሉ። በRC ስቴሪክ እንቅፋት ምክንያት፣ የαβ-1 ማዘንበል ሁለተኛውን የαβ ጥንድ አያካትትም (ይህም በምስል 1F ውስጥ ካለው 16ኛው αβ ጋር ይዛመዳል)፣ በዚህም በLH1 ቀለበት ውስጥ ግልጽ የሆነ ክፍተት ይፈጥራል (ምስል 1፣ A እና E)። ሁለት αβ ሄትሮዳይመሮች ባለመኖራቸው፣ አራት BChl እና ሁለት ካሮቲኖይድ በመጥፋታቸው፣ ከካሮቲኖይድ ውስጥ አንዳቸውም ከተጠማዘዘው αβ-1 ንዑስ ክፍል ጋር አይገናኙም፣ በዚህም ምክንያት 13 ካሮቲኖይድ ቬጀቴሪያን እና 28 BChls የያዘ የLH114-W ቀለበት ተፈጠረ። በαβ1 እስከ 7 ክልሎች ውስጥ ያሉት ሁለት ውስብስብ ነገሮች የአካባቢ ጥራት ግምቶች ከቀሪው የLH1 ዑደት ያነሱ ናቸው፣ ይህም ከRC QB ጣቢያ አጠገብ ያለውን የLH1 ንዑስ ክፍል ውስጣዊ ፕላስቲክነትን ሊያንፀባርቅ ይችላል (ምስል 4)።
የRC-LH114-W (A እና B) እና RC-LH116 (C እና D) ስዕሎች ከምስል 1 (B እና D) ተመሳሳይ የላይኛው እይታ/የጎን እይታ (A እና B) (A እና C) እና የክፍተት ወለል ይታያሉ። ባለቀለም ቁልፎቹ በቀኝ በኩል ይታያሉ።
1፡14 የሆነ የስቶይቺዮሜትሪክ ጥምርታ ያለው ሌላኛው ባህሪ ያለው ኮር ኮምፕሌክስ የሮዶኮከስ ስፓሮይድስ (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13) ነው። ሆኖም፣ ፕሮቲን W እና PufX ግልጽ የሆነ ተመሳሳይነት የላቸውም፣ እና በየራሳቸው LH1 አወቃቀሮች ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራሉ። PufX ከ Rps. palustris LH116αβ-16 ጋር በሚዛመድ ቦታ ላይ ከ RC-H ንዑስ ክፍል (13) ሳይቶፕላዝሚክ ጎን ጋር የሚገናኝ N-ተርሚናል ሳይቶፕላዝሚክ ጎራ ያለው ነጠላ TMH ነው። PufX በ RC-LH1 እና በሳይቶክሮም bcl ውስብስብ መካከል ለኩዊኖን/ኩዊኖሎን ልውውጥ ቻናል ይፈጥራል እና በሁሉም Rba. sphaeroides ኮር ኮምፕሌክስ (13) ውስጥ ይገኛል። የሞኖመር-ሞኖመር በይነገጽ በ Rba ውስጥ ቢሆንም። ስፓሄሮይድስ RC-LH1-PufX ዲመር በRC-LH114-W ውስጥ ባለው የፕሮቲን W ትስስር ቦታ ላይ የሚገኝ ሲሆን በPufX እና በፕሮቲን-W የተፈጠረው ክፍተት በተመሳሳይ ቦታ ላይ ነው (ምስል S7A)። በRC-LH114-W ውስጥ ያለው ክፍተት ከፕሴዩሞናስ ሮዛ LH1 መላምታዊ የኩዊኖን ቻናል (8) ጋር የተጣጣመ ሲሆን ይህም ከፕሮቲን W ወይም PufX ጋር ባልተያያዙ ፔፕታይዶች የተፈጠረ ነው (ምስል S7B)። በተጨማሪም፣ በBlc ውስጥ ያለው የኩዊኖን ቻናል። አንድ γ ንዑስ ክፍል (7) በማግለል የተፈጠረው ኤመራልድ አረንጓዴ LH1 በተመሳሳይ ቦታ ላይ ይገኛል (ምስል S7C)። ምንም እንኳን በተለያዩ ፕሮቲኖች የተማከለ ቢሆንም፣ በRC-LH1 ውስብስብ ውስጥ የእነዚህ የኩዊኖን/ኩዊኖሎል ቻናሎች መታየት የኮንቬንቴንት ዝግመተ ለውጥ ምሳሌ ይመስላል፣ ይህም በፕሮቲን W የተፈጠረው ክፍተት እንደ ኩዊኖን ቻናል ሆኖ ሊያገለግል እንደሚችል ያሳያል።
በLH114-W ዑደት ውስጥ ያለው ክፍተት በ RC-LH114-W ውስብስብ ውስጣዊ ክፍተት እና በጅምላ ሽፋን (ምስል 1ጂ) መካከል ቀጣይነት ያለው የሜምብሬን ክልል እንዲፈጠር ያስችላል፣ ይህም በፕሮቲኖች ውስጥ እንዳሉት ሁለቱን ጎራዎች በፕሮቲን ቀዳዳ በኩል ከማገናኘት ይልቅ። የ RC-LH116 ውስብስብ ከዝግ Tch. መርፌ መሰል ውስብስብ (22) ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 1H)። በሜምብሬን በኩል የኩዊኖን ስርጭት በጠባቡ የፕሮቲን ቻናል በኩል ከሚሰራጭበት ፍጥነት የበለጠ ስለሆነ፣ ክፍት የሆነው LH114-W ዑደት ከተዘጋው LH116 ዑደት የበለጠ ፈጣን የ RC ለውጥ ሊፈቅድ ይችላል፣ እና የኩዊኖን ስርጭት ወደ RC የበለጠ የተገደበ ሊሆን ይችላል። ፕሮቲን W የኩዊኖኖችን በ RC በኩል መለወጥ ላይ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ለመፈተሽ፣ በተወሰነ የ UBIQUINONE 2 (UQ2) ክምችት (አጭር አይሶፕሬን ጅራት ያለው የተፈጥሮ UQ10 አናሎግ) ላይ የሳይቶክሮም ኦክሳይድ ምርመራ አድርገናል (ምስል 2E)። የኬላቴድ ኩዊኖን መኖር ግልጽ የሆነውን የሚካኤሊስ ቋሚ (RC-LH114-W እና RC-LH116 በቅደም ተከተል ለ0.2±0.1μM እና 0.5±0.2μM ተስማሚ ቢሆኑም)፣ ከፍተኛው የRC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) መጠን ከRC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) በ28±5% ይበልጣል።
መጀመሪያ ላይ ፕሮቲን-W በዋናው ውስብስብ 10% አካባቢ ውስጥ እንደሚገኝ ገምተናል (16)፤ እዚህ ላይ፣ የዝቅተኛ ብርሃን፣ መካከለኛ ብርሃን እና ከፍተኛ ብርሃን ያላቸው የእድገት ሴሎች የመኖር መጠን በቅደም ተከተል 15±0.6%፣ 11±1% እና 0.9±0.5 ነው (ምስል 2F)። የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ቁጥራዊ ንፅፅር እንደሚያሳየው የሂስቲዲን መለያ መጨመር ከዱር ዓይነት ዝርያዎች ጋር ሲነጻጸር የፕሮቲን-W አንጻራዊ ብዛትን እንዳልቀነሰ ያሳያል (P = 0.59)፣ ስለዚህ እነዚህ ደረጃዎች የተሻሻለ ፕሮቲን-W ቅርስ አይደሉም (ምስል S10)። ሆኖም፣ በRC-LH1 ውስብስብ ውስጥ ያለው ይህ ዝቅተኛ የፕሮቲን-W መኖር አንዳንድ RCዎች በተፋጠነ ፍጥነት እንዲገለበጡ ሊፈቅድላቸው ይችላል፣ በዚህም በRC-LH116 ውስብስብ ውስጥ ያለውን ቀርፋፋ የኩዊኖን/ኩዊኖሎን ልውውጥ ይቀንሳል። ከፍተኛ የብርሃን መኖር መጠን ከቅርብ ጊዜ የትራንስክሪፕቶሚክስ መረጃ ጋር የማይጣጣም መሆኑን አስተውለናል፣ ይህም የpufW ጂን አገላለጽ በጠንካራ ብርሃን ስር እንደሚጨምር ያሳያል (ምስል S11) (23)። በ pufW ግልባጭ እና በ RC-LH1 ውስብስብ ውስጥ የፕሮቲን-W ውህደት መካከል ያለው ልዩነት ግራ የሚያጋባ ሲሆን የፕሮቲን ውስብስብ ቁጥጥርን ሊያንፀባርቅ ይችላል።
በRC-LH114-W ውስጥ፣ 6 ካርዲዮሊፒን (CDL)፣ 7 ፎስፋቲዲልኮሊን (POPC)፣ 1 ፎስፋቲዲልግሊሰሮል (POPG) እና 29 β-DDM ሞለኪውሎች 6 CDLዎች፣ 24 POPCዎች፣ 2 POPGዎች እና 12 βDDMዎች ተመድበው ሞዴሊንግ ተደርገዋል። RC-LH116 (ምስል 5፣ A እና B)። በእነዚህ ሁለት መዋቅሮች ውስጥ፣ CDL ማለት ይቻላል በኮምብሊኩ ሳይቶፕላዝም ጎን ላይ የሚገኝ ሲሆን POPC፣ POPG እና β-DDM በአብዛኛው በብርሃን በኩል ይገኛሉ። ሁለት የሊፒድ እና የሳሙና ሞለኪውሎች በRC-LH114-W ኮምፕሌክስ αβ-1 እስከ αβ-6 ክልል ውስጥ ተለይተዋል (ምስል 5A)፣ እና አምስቱ በRC-LH116 ተመጣጣኝ ክልል ውስጥ ተለይተዋል (ምስል 5B)። ተጨማሪ ቅባቶች በውስብስቡ ማዶ፣ በዋናነት CDL፣ በRC እና αβ-7 እስከ αβ-13 መካከል የተከማቹ ነበሩ (ምስል 5፣ A እና B)። ሌሎች በመዋቅር የተፈቱ ቅባቶች እና ሳሙናዎች ከLH1 ቀለበት ውጭ ይገኛሉ፣ እና በደንብ የተፈቱ የአሲል ሰንሰለቶች በLH1 ንዑስ ክፍሎች መካከል ይዘልቃሉ፣ በRC-LH114-W ውስጥ β-DDM ተብሎ በጊዜያዊነት የተሰየሙ እና በRC A ውስጥ β-DDM እና POPC-LH116 ድብልቅ ውስጥ β-DDM ተብለው ይገለጻል። በእኛ መዋቅር ውስጥ ያሉ የቼላቲንግ ሊፒዶች እና ሳሙናዎች ተመሳሳይ አቀማመጥ ፊዚዮሎጂያዊ ተዛማጅነት ያላቸው ማያያዣ ቦታዎች መሆናቸውን ያመለክታሉ (ምስል S12A)። በTch ውስጥ ያሉ ተመጣጣኝ ሞለኪውሎች አቀማመጥም ጥሩ ወጥነት አለው። ገር እና ትሬቭ። ውጥረት 970 RC-LH1ዎች (ምስል S12፣ B እስከ E) (9፣ 12) እና የሊፒድ ራስ ቡድን የሃይድሮጂን ትስስር ቅሪቶች በቅደም ተከተል አሰላለፍ ውስጥ በጣም ጥሩ ጥበቃ አሳይተዋል (ምስል S13)፣ ይህም ከ RC (24) ጋር የሚገናኝ የተከማቸ CDL እነዚህ ቦታዎች በ RC-LH1 ውስብስብ ውስጥ ሊጠበቁ እንደሚችሉ ያሳያል።
(A እና B) RC-LH114-W (A) እና RC-LH116 (B) ፔፕታይዶች በካርቱን ይወከላሉ፣ እና ቀለሞች በሥዕል 1 ላይ ባለው የቀለም መርሃ ግብር በመጠቀም በሮዶች ይወከላሉ። ሊፒዶች በቀይ ይታያሉ፣ እና ሳሙናዎች በግራጫ ይታያሉ። UQ ከRC QA እና QB ቦታዎች ጋር የተሳሰሩ ቢጫ ሲሆኑ፣ የተገለለው UQ ደግሞ ሰማያዊ ነው። (C እና D) ከ(A) እና (B) ጋር ተመሳሳይ እይታዎች፣ ሊፒዶች ተወግደዋል። (E እስከ G) ከRC-LH116 የQ1(E)፣ Q2(F) እና Q3(G) ሰፊ እይታ፣ እርስ በእርስ የሚነኩ የጎን ሰንሰለቶች። የሃይድሮጂን ትስስሮች እንደ ጥቁር የተነጠፉ መስመሮች ይታያሉ።
በRC-LH116 ውስጥ፣ በቻርጅ መለያየት ሂደት ውስጥ በኤሌክትሮን ዝውውር ውስጥ የሚሳተፉት ሁለቱም የRC QA እና የQB UQ በማያያዝ ቦታዎቻቸው ውስጥ ይፈርሳሉ። ሆኖም፣ በRC-LH114-W ውስጥ፣ የQB ኩዊኖን አልተፈታም እና ከዚህ በታች በዝርዝር ይብራራል። ከQA እና QB ኩዊኖኖች በተጨማሪ፣ ሁለት የቼልድ UQ ሞለኪውሎች (በRC እና LH1 ቀለበቶች መካከል የሚገኙ) በRC-LH114-W መዋቅር ውስጥ በጥሩ ሁኔታ በተፈቱ የጭንቅላት ቡድኖቻቸው (በQ1 እና Q2 በቅደም ተከተል የሚገኙ) መሠረት ይመደባሉ።)። ምስል 5C)። ሁለት የኢሶፕሪን ክፍሎች ለQ1 ይመደባሉ፣ እና የጥግግት ካርታው የQ2ን 10 የኢሶፕሪን ጅራቶች ሙሉ በሙሉ ይፈታል። በRC-LH116 አወቃቀር ውስጥ፣ ሶስት የቼልድ UQ10 ሞለኪውሎች (ከQ1 እስከ Q3፣ ምስል 5D) ተፈትተዋል፣ እና ሁሉም ሞለኪውሎች በጅራቱ ውስጥ ግልጽ የሆነ ጥግግት አላቸው (ምስል 5፣ D እስከ G)። በሁለቱ መዋቅሮች ውስጥ፣ የQ1 እና Q2 የኩዊኖን ራስ ቡድኖች አቀማመጥ እጅግ በጣም ጥሩ ወጥነት አላቸው (ምስል S12F)፣ እና ከRC ጋር ብቻ ይገናኛሉ። Q1 የሚገኘው በRC-LH114-W የW ክፍተት መግቢያ ላይ ነው (ምስል 1G እና 5፣ C፣ D እና E)፣ እና Q2 የሚገኘው በQB ማያያዣ ቦታ አቅራቢያ ነው (ምስል 5፣ C፣ D) እና F)። የተጠበቁት L-Trp143 እና L-Trp269 ቅሪቶች ከQ1 እና Q2 በጣም ቅርብ ናቸው እና እምቅ የπ-stacking መስተጋብሮችን ይሰጣሉ (ምስል 5፣ E እና F፣ እና ምስል S12)። L-Gln88፣ 3.0 Å ከQ1 ሩቅ ኦክስጅን፣ ጠንካራ የሃይድሮጂን ትስስር ይሰጣል (ምስል 5E)፤ ይህ ቅሪት በጣም ሩቅ ግንኙነት ካልሆነ በስተቀር በሁሉም RCዎች ውስጥ ተጠብቆ ይገኛል (ምስል S13)። L-Ser91 በአብዛኛዎቹ ሌሎች RCs ውስጥ በThr ወግ አጥባቂ በሆነ መንገድ ተተክቷል (ምስል S13)፣ ከQ1 ሜቲል ኦክስጅን 3.8 አንግስትሮሞች ሲሆን ደካማ የሃይድሮጂን ቦንዶችን ሊያቀርብ ይችላል (ምስል 5E)። Q3 የተወሰነ መስተጋብር ያለው አይመስልም፣ ነገር ግን በRC-M ንዑስ ክፍል እና በLH1-α ንዑስ ክፍል 5 እስከ 6 መካከል ባለው ሃይድሮፎቢክ ክልል ውስጥ ይገኛል (ምስል 5፣ D እና G)። Q1፣ Q2 እና Q3 ወይም በአቅራቢያው ያሉ የኬላድ ኩዊኖኖች በTch. Gentle፣ Trv. Strain 970 እና Blc ውስጥም ተፈትተዋል። የአይሪስ መዋቅር (9፣ 10፣ 12) በRC-LH1 ውስብስብ ውስጥ የተጠበቀ ረዳት ኩዊኖን ማያያዣ ቦታን ያመለክታል (ምስል S12G)። በRC-LH116 ውስጥ ያሉት አምስቱ የተበታተኑ UQዎች በከፍተኛ አፈጻጸም ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) የሚወሰን ከእያንዳንዱ ውስብስብ 5.8±0.7 ጋር በጥሩ ሁኔታ ይስማማሉ፣ በRC-LH114-W ውስጥ ያሉት ሦስቱ የተበታተኑ UQዎች ደግሞ ከ 6.2±0.3 የሚለካው እሴት (ምስል S14) በመዋቅሩ ውስጥ ያልተፈቱ UQ ሞለኪውሎች እንዳሉ ያሳያል።
ፕሴዱ-ሲሜትሪክ ኤል እና ኤም ፖሊፔፕታይዶች እያንዳንዳቸው አምስት TMHዎችን ይይዛሉ እና አንድ BChl dimer፣ ሁለት BChl ሞኖመሮችን፣ ሁለት ባክቴሪዮፋጅ (BPh) ሞኖመሮችን እና አንድ ያልሆነ ሄሜ ብረት እና አንድ ወይም ሁለት UQ10 ሞለኪውሎችን የሚያጣምር ሄቴሮዲመር ይፈጥራሉ። በተርሚናል ኬቶን ቡድን ላይ ባለው የሃይድሮጂን ትስስር እና በ Rps ውስጥ በሚታወቀው ክምችት፣ ካሮቲኖይድ በ M-subunit ውስጥ ይካተታሉ፣ እሱም cis-3,4-dehydroorhodopin ተብሎ በሚጠራው። ዝርያዎች (25)። የ RC-H ውጫዊ ሽፋን ጎራ በአንድ TMH ከሽፋኑ ጋር ተጣብቋል። አጠቃላይ የ RC መዋቅር ከተዛማጅ ዝርያዎች (እንደ Rba) ካሉ ሶስት ንዑስ ዩኒት RC ጋር ተመሳሳይ ነው። ስፓሄሮይዶች (PDB ID: 3I4D)። የ BChl እና BPh ማክሮሳይክሎች፣ የካሮቲኖይድ የጀርባ አጥንት እና ሄሜ ያልሆነ ብረት በእነዚህ መዋቅሮች የጥራት ክልል ውስጥ ይደራረባሉ፣ እንዲሁም በ QA ጣቢያ ላይ ያለው UQ10 ራስ ቡድን እና በ RC-LH116 ያለው QB ኩዊኖን (ምስል S15)።
የተለያዩ የQB ጣቢያ የመኖርያ መጠን ያላቸው ሁለት የRC መዋቅሮች መገኘት ከQB ኩዊኖን ትስስር ጋር ተያይዘው የሚመጡ ወጥ የሆኑ የቅርጽ ለውጦችን ለመመርመር አዲስ እድል ይሰጣል። በRC-LH116 ውስብስብ ውስጥ፣ የQB ኩዊኖን ሙሉ በሙሉ በተያያዘው “ቅርበት” ቦታ (26) ውስጥ ይገኛል፣ ነገር ግን የRC-LH114-W መለያየት የQB ኩዊኖን የለውም። በRC-LH114-W ውስጥ የQB ኩዊኖን የለም፣ ይህም የሚያስደንቅ ነው ምክንያቱም ውስብስብነቱ ንቁ ስለሆነ፣ ከመዋቅራዊ መፍትሄ ካለው የQB ኩዊኖን ጋር ካለው የRC-LH116 ውስብስብ የበለጠ። ሁለቱ የLH1 ቀለበቶች ወደ ስድስት ኩዊኖኖች ቢሸነፉም፣ አምስቱ በተዘጋው የRC-LH116 ቀለበት ውስጥ በመዋቅራዊ መልኩ የተፈቱ ሲሆኑ፣ በክፍት የRC-LH114-W ቀለበት ውስጥ ሦስቱ ብቻ በመዋቅራዊ ሁኔታ የተገደቡ ናቸው። ይህ የጨመረው የመዋቅር መዛባት የRC-LH114-W QB ጣቢያዎችን በፍጥነት መተካት፣ በውስብስቡ ውስጥ ፈጣን የኩዊኖን ኪነቲክስ እና የLH1 ዑደትን የማቋረጥ እድልን ሊያንፀባርቅ ይችላል። በRC-LH114-W RC QB ጣቢያ ውስጥ የUQ አለመኖር የበለጠ ውስብስብ እና የበለጠ ንቁ ውስብስብ ውጤት ሊሆን እንደሚችል እና የRC-LH114-W QB ጣቢያ በUQ ትራንስፎርሜሽን ወዲያውኑ እንደቀዘቀዘ እንጠቁማለን። የተወሰነው ደረጃ (ወደ QB ጣቢያ መግቢያ ተዘግቷል) የዚህን እንቅስቃሴ ቅርፅ ያንፀባርቃል።
QB ከሌለ፣ የL-Phe217 አብሮ የሚሄድ ሽክርክር ከUQ10 ትስስር ጋር ወደማይጣጣም ቦታ፣ ምክንያቱም ከጅራቱ የመጀመሪያ አይሶፕሪን ክፍል ጋር የቦታ ግጭት ያስከትላል (ምስል 6A)። በተጨማሪም፣ ግልጽ የሆኑ ዋና ዋና የቅርጽ ለውጦች ግልጽ ናቸው፣ በተለይም ሄሊክስ ደ (በTMH D እና E መካከል ባለው ዑደት ውስጥ አጭር ሄሊክስ)፣ L-Phe217 ወደ QB ማያያዣ ኪስ እና የL-Tyr223 ሽክርክሪት ሲሸጋገር (ምስል 6A)። ከM-Asp45 ማዕቀፍ ጋር የሃይድሮጂን ትስስርን ለመስበር እና የQB ማያያዣ ቦታ መግቢያን ለመዝጋት (ምስል 6B)። ሄሊክስ ደ በመሠረቱ ላይ ይሽከረከራል፣ የL-Ser209 Cα በ0.33Å ሲሸጋገር፣ L-Val221Cα ደግሞ በ3.52Å ሲሸጋገር። በሁለቱም መዋቅሮች ውስጥ የማይቻሉ በTMH D እና E ውስጥ የሚታዩ ለውጦች የሉም (ምስል 6A)። እስከምናውቀው ድረስ፣ ይህ በተፈጥሮው አርሲ ውስጥ የQB ቦታን የሚዘጋ የመጀመሪያው መዋቅር ነው። ከተሟላ (QB-የተሳሰረ) መዋቅር ጋር ማነፃፀር እንደሚያሳየው ኩዊኖኑ ከመቀነሱ በፊት ወደ ኩዊኖኑ እንዲገባ የቅርጽ ለውጥ ያስፈልጋል። L-Phe217 ከኩዊኖን ራስ ቡድን ጋር π-stacking መስተጋብር ለመፍጠር ይሽከረከራል፣ እና ሄሊክስ ወደ ውጭ ይንቀሳቀሳል፣ ይህም የL-Gly222 አጽም እና የL-Tyr223 የጎን ሰንሰለት የተረጋጋ የሃይድሮጂን ትስስር መዋቅር ያለው የሃይድሮጂን ትስስር አውታረ መረብ እንዲፈጥሩ ያስችላል (ምስል 6፣ A እና C)።
(ሀ) የሆሎግራም (L ሰንሰለት፣ ብርቱካናማ/ኤም ሰንሰለት፣ ማጀንታ) እና አፖ (ግራጫ) መዋቅር ተደራራቢ ካርቱን፣ በዚህ ውስጥ ቁልፍ ቅሪቶች በዱላ መሰል ውክልና መልክ ይታያሉ። UQ10 በቢጫ አሞሌ ይወከላል። የነጥብ መስመሩ በጠቅላላው መዋቅር ውስጥ የተፈጠሩትን የሃይድሮጂን ትስስር ያሳያል። (ለ እና ሐ) የአፖሎፕሮቲን እና የቀለበት መዋቅር የወለል ውክልና፣ የL-Phe217ን የጎን ሰንሰለት ኦክስጅን በሰማያዊ እና L-Tyr223 በቀይ በቅደም ተከተል ያጎላል። የL ንዑስ ክፍል ብርቱካናማ ነው፤ የM እና H ንዑስ ክፍሎች ቀለም የላቸውም። (D እና E) አፖሊፖፕሮቲን (D) እና ሙሉ (E) የRC QB ቦታዎች [በ(A) በቅደም ተከተል ቀለም] እና Thermophilus thermophilus PSII (አረንጓዴ፣ ሰማያዊ ከፕላስቲክ ኩዊኖን ጋር፤ PDB ID: 3WU2) አሰላለፍ (58)።
ባልተጠበቀ ሁኔታ፣ ምንም እንኳን LH1 የሌላቸው በርካታ የQB እጥረት ያለባቸው RCዎች መዋቅሮች ቢኖሩም፣ በዚህ ጥናት ውስጥ የታዩት የቅርጽ ለውጦች ከዚህ በፊት ሪፖርት አልተደረጉም። እነዚህም ከ Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27)፣ Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) እና Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) የ QB መሟጠጥ መዋቅርን ያካትታሉ፣ እነዚህም ሁሉም ከአጠቃላይ የQB አወቃቀራቸው ጋር ተመሳሳይ ናቸው። የ3PRC የቅርብ ምርመራ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) የሳሙና ሞለኪውሎች በQB ቦታ መግቢያ ላይ እንደሚጣበቁ አሳይቷል፣ ይህም ወደ ዝግ ቅርፅ እንደገና እንዳይደራረብ ይከላከላል። LDAO በ1EYS ወይም 1OGV ውስጥ በተመሳሳይ ቦታ ላይ ባይበሰብስም፣ እነዚህ RCs የሚዘጋጁት በተመሳሳይ ሳሙና በመጠቀም ስለሆነ ተመሳሳይ ውጤት ሊያስገኙ ይችላሉ። የRba ክሪስታል መዋቅር። ስፋሮይዶች አርሲ ከሳይቶክሮም c2 (PDB ID: 1L9B) ጋር አብሮ ክሪስታላይዝድ የተደረገበት እንዲሁም የተዘጋ የQB ቦታ ያለው ይመስላል። ሆኖም፣ በዚህ ሁኔታ፣ የRC-M ፖሊፔፕታይድ N-ተርሚናል ክልል (በQ Helix ላይ ባለው የTyr ቅሪት H ትስስር በኩል ከQB ማያያዣ ቦታ ጋር መስተጋብር ይፈጥራል) ተፈጥሯዊ ያልሆነ ቅርፅን ይቀበላል፣ እና የQB ቅርፅ ለውጥ የበለጠ አልተዳሰሰም (30)። የሚያረጋጋው ነገር በRC-LH114-W መዋቅር ውስጥ እንዲህ ዓይነቱን የM ፖሊፔፕታይድ መበላሸት አላየንም ማለት ነው፣ ይህም ከRC-LH116 RC N-ተርሚናል ክልል ጋር ተመሳሳይ ነው። እንዲሁም በሳሙና ላይ የተመሰረተ LH1 አንቴና ከተሰረዘ በኋላ፣ በPDB ውስጥ ያሉት አፖሊፖፕሮቲን RCዎች መፍትሄ እንደሚያገኙ ልብ ሊባል ይገባል፣ ይህም በRC እና በዙሪያው ባለው LH1 ቀለበት ውስጣዊ ገጽ መካከል ባለው ክፍተት ውስጥ ያሉትን ውስጣዊ የኩዊኖን ገንዳዎች እና ሊፒዶችን አስወግዷል (31፣ 32)። RC ተግባራዊ ሆኖ የሚቆየው የሚበሰብስ QB ኩዊኖንን ሳይጨምር ሁሉንም ተባባሪ አካላትን ስለሚይዝ ነው፣ ይህም እምብዛም የማይረጋጋ እና በዝግጅት ሂደት ውስጥ ብዙ ጊዜ የሚጠፋ ነው (33)። በተጨማሪም፣ LH1 እና ተፈጥሯዊ ሳይክሊክ ሊፒዶችን ከRC ማስወገድ እንደ ክፍያ-የተለየው P+QB-state አጭር የህይወት ዘመን (31፣ 34፣ 35) ባሉ ተግባራት ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር እንደሚችል ይታወቃል። ስለዚህ፣ RCን የሚከብበው የአካባቢ LH1 ቀለበት መኖር "የተዘጋውን" QB ቦታ ሊጠብቅ እንደሚችል እና በዚህም በQB አቅራቢያ ያለውን የአካባቢ አካባቢ ሊጠብቅ እንደሚችል እንገምታለን።
ምንም እንኳን አፖሊፖፕሮቲን (ያለ QB ኩዊኖን) እና ሙሉው መዋቅር የQB ጣቢያን መዞር ሁለት ቅጽበታዊ ገጽ እይታዎችን ብቻ የሚወክሉ ቢሆንም፣ ተከታታይ ክስተቶችን ከመወከል ይልቅ፣ ማያያዣው በሃይድሮኪኖን እንደገና እንዳይጣበቅ ለመከላከል በሮች ሊገቡ እንደሚችሉ የሚያሳዩ ምልክቶች አሉ። የንጥረ ነገር መከልከልን ለመግታት። በአፖሊፖፕሮቲን QB ጣቢያ አቅራቢያ ያለው የኩዊኖሎል እና የኩዊኖን መስተጋብር የተለየ ሊሆን ይችላል፣ ይህም በRC ውድቅ ያደርገዋል። የቅርጽ ለውጦች በኩዊኖኖች ትስስር እና ቅነሳ ውስጥ ሚና እንደሚጫወቱ ከረጅም ጊዜ በፊት ተጠቁሟል። የቀዘቀዙ RCs ከጨለማ መላመድ በኋላ ኩዊኖኖችን የመቀነስ ችሎታቸው ተጎድቷል (36)፤ የኤክስሬይ ክሪስታሎግራፊ እንደሚያሳየው ይህ ጉዳት የQB ኩዊኖኖች ከንቁ ቅርብ ቦታ 4.5 Å አካባቢ በ"ሩቅ" ቅርፅ ውስጥ በመያዛቸው ምክንያት ነው (26)፣ 37)። ይህ የርቀት ማያያዣ ቅርፅ በአፖሊፖፕሮቲን እና ሙሉ ቀለበት መዋቅር መካከል ያለውን መካከለኛ ሁኔታ የሚያሳይ ቅጽበታዊ ገጽ እይታ ነው ብለን እንጠቁማለን፣ ይህም ከኩዊኖን ጋር የመጀመሪያውን መስተጋብር እና የQB ጣቢያን መከፈትን ይከተላል።
በተወሰኑ የፎቶትሮፊክ ባክቴሪያዎች እና ሳይያኖባክቴሪያ፣ አልጌ እና ተክሎች PSII ውስብስብ ውስጥ የሚገኘው አይነት II RC መዋቅራዊ እና ተግባራዊ ጥበቃ አለው (38)። በስእል 6 (D እና E) ላይ የሚታየው መዋቅራዊ አሰላለፍ በPSII RCs እና በባክቴሪያ RC ውስብስብ QB ቦታ መካከል ያለውን ተመሳሳይነት ያጎላል። ይህ ንጽጽር ከረጅም ጊዜ በፊት የኩዊኖን ትስስር እና ቅነሳ ስርዓቶችን በቅርበት ለማጥናት ሞዴል ሆኖ ቆይቷል። ቀደም ሲል የታተሙ ጽሑፎች የቅርጽ ለውጦች ከኪዊኖኖች PSII ቅነሳ ጋር አብረው እንደሚሄዱ ጠቁመዋል (39፣ 40)። ስለዚህ፣ የRC የዝግመተ ለውጥ ጥበቃን ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ ይህ ቀደም ሲል ያልታየ የማሰሪያ ዘዴ በኦክሲጅን በተሞሉ የፎቶትሮፊክ ተክሎች ውስጥ ለPSII RC QB ቦታ ላይም ተፈጻሚ ሊሆን ይችላል።
Rps ΔpufW (ያልተሰየመ pufW መሰረዝ) እና PufW-His (C-ተርሚናል 10x His-tagged protein-W ከተፈጥሯዊ pufW locus) ዝርያዎች የተገለፁ። palustris CGA009 በቀደመው ስራችን (16) ላይ ተገልጿል። እነዚህ ዝርያዎች እና ኢሶጂኒክ የዱር አይነት ወላጅ በPYE (እያንዳንዱ 5 ግራም ሊትር -1) (በ-80 °C በLB ውስጥ የተከማቹ፣ 50% (w/v) ግሊሰሮል) ፕሮቲን፣ የእርሾ ማውጣት እና ሱቺኔት) አጋር [1.5% (w/v)] ሳህን ላይ ጥቂት ሴሎችን በመርጨት ከማቀዝቀዣው ውስጥ አግኝተዋል። ሳህኑ በአናይሮቢክ ሁኔታዎች ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ በአንድ ሌሊት በጨለማ ውስጥ ታጥቧል፣ ከዚያም አንድ ነጠላ ቅኝ እስኪታይ ድረስ በ OSRAM 116-W halogen አምፖሎች (RS Components, UK) በተሰጠው ነጭ ብርሃን (~50 μmolm-2 s-1) ለ3 እስከ 5 ቀናት ተብራርቷል። አንድ ኮሎኝ 10 ሚሊ ሊትር የ M22+ መካከለኛ (41) በ0.1% (w/v) ካዛሚኖ አሲዶች (ከዚህ በኋላ M22 ተብሎ ይጠራል) ለመከተብ ጥቅም ላይ ውሏል። ባህሉ በዝቅተኛ የኦክስጅን ሁኔታ በ34°ሴ በጨለማ ውስጥ ለ48 ሰዓታት በ180 rpm በመንቀጥቀጥ አድጓል፣ ከዚያም 70 ሚሊ ሊትር ባህሉ በተመሳሳይ ሁኔታ ለ24 ሰዓታት ተከተበ። 1 ሚሊ ሊትር መጠን ያለው ከፊል ኤሮቢክ ባህል በ30 ሚሊ ሊትር ሁለንተናዊ ዊንች-ቶፕ ግልጽ በሆነ የመስታወት ጠርሙስ ውስጥ 30 ሚሊ ሊትር የ M22 መካከለኛ ለመከተብ ጥቅም ላይ ይውላል እና በንፁህ መግነጢሳዊ ኃይል በማነቃቂያ ዘንግ ለ48 ሰዓታት በብርሃን (~50μmolm-2 s-1) ይሞቃል። ከዚያም 30 ሚሊ ሊትር ባህሉ በተመሳሳይ ሁኔታ ውስጥ በ1 ሊትር አካባቢ ባህል ተከተበ፣ ከዚያም በ~200 μmolm-2 s-1 ለ72 ሰዓታት በብርሃን 9 ሊትር ባህል ለመከተብ ጥቅም ላይ ውሏል። ሴሎቹ በ7132 RCF ለ30 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጌሽን ተወስደው፣ በ~10 ሚሊ ሊትር 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ውስጥ እንደገና ተዘግተው፣ እና አስፈላጊ እስኪሆን ድረስ በ-20°ሴ ውስጥ ተከማችተዋል።
ከቀለጠ በኋላ፣ የዲኦክሲሪቦኑክሊየስ I (ሜርክ፣ ዩኬ)፣ ሊሶዚም (ሜርክ፣ ዩኬ) እና ሁለት የሮቼ ሆሎኤንዚም ፕሮቲኤዝ አጋቾች ታብሌቶች (ሜርክ፣ ዩኬ) ክሪስታሎችን ወደተደጋገሙት ሴሎች ይጨምሩ። በ20,000 psi የፈረንሳይ የግፊት ሴል (አሚንኮ፣ ዩኤስኤ) ውስጥ፣ ሴሎቹ ከ8 እስከ 12 ጊዜ ተስተጓጉለዋል። ያልተሰበሩ ሴሎችን እና የማይሟሟ ፍርስራሾችን በ18,500 RCF ለ15 ደቂቃዎች በ4°ሴ በሴንትሪፉጌሽን ካስወገዱ በኋላ፣ ሽፋኑ ከቀለም ላሳይት በ113,000 RCF በሴንትሪፉጌሽን ለ2 ሰዓታት በ43,000°ሴ ተፈጥሯል። የሚሟሟውን ክፍልፋይ ያስወግዱ እና ባለቀለም ሽፋኑን በ100 እስከ 200 ሚሊ ሊትር 20 mM ትሪስ-ኤችሲኤል (pH 8.0) እንደገና ያያይዙት እና የሚታዩ ውህዶች እስኪኖሩ ድረስ ተመሳሳይነት ያድርጉ። የተንጠለጠለው ሽፋን በ20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace፣ USA) ውስጥ 2% (w/v) β-DDM በ4°ሴ በጨለማ ውስጥ ለ1 ሰዓት በቀስታ በማነሳሳት እንዲታቀፍ ተደርጓል። ከዚያም በ70°ሴ ሴንትሪፉጅ 150,000 RCF በ4°ሴ ለ1 ሰዓት እንዲሟሟ በማድረግ የማይሟሟትን ያስወግዳል።
ከΔpufW ዝርያ የሚወጣው የማሟሟት ሽፋን በ50 ሚሊ ሊትር የDEAE Sepharose ion exchange አምድ ላይ 0.03% (w / v) β-DDM የያዘ ሶስት አምድ ጥራዞች (CV) ባለው የማሰሪያ ቋት [20 mM tris-HCl (pH 8.0)] ላይ ተተግብሯል። አምዱን በሁለት የCV ማሰሪያ ቋቶች ያጠቡ፣ ከዚያም አምዱን 50 mM NaCl የያዙ ሁለት የማሰሪያ ቋቶች ያጠቡ። የRC-LH116 ውስብስብ በ1.75 CV ላይ ከ150 እስከ 300 mM NaCl (በማሰሪያ ቋት) መስመራዊ ቅልመት ተከፍቷል፣ እና የቀረው የማሰሪያ ውስብስብ በ0.5 CV ላይ 300 mM NaCl በያዘ የማሰሪያ ቋት ተከፍቷል። የመምጠጥ ስፔክትረምን በ250 እና 1000 nm መካከል ይሰብስቡ፣ ክፍልፋዩን በ880 እስከ 280 nm ከ1 በላይ በመምጠጥ ሬሾ (A880/A280) ያስቀምጡ፣ በማሰሪያ ቋት ውስጥ ሁለት ጊዜ ይቀልጡት፣ እና ተመሳሳይ አሰራርን በDEAE አምድ ላይ እንደገና ይጠቀሙ። ክፍልፋዮቹን ከ1.7 እና ከ3.0 በላይ በሆኑ A880/A280 ሬሾዎች ያዋህዱ፣ የሶስተኛውን የአዮን ልውውጥ ያከናውኑ፣ እና ከ2.2 እና ከ5.0 በላይ በሆኑ A880/A280 ሬሾዎች ያላቸው ክፍልፋዮችን ያስቀምጡ። በከፊል የተጣራው ውስብስብ ነገር በአሚኮን 100,000 ሞለኪውላዊ ክብደት መቁረጫ (MWCO) ሴንትሪፉጋል ማጣሪያ (Merck፣ UK) ውስጥ እስከ ~2 ሚሊ ሊትር ድረስ ተከማችቶ 200 mM NaCl ቋት ባለው ሱፐርዴክስ 200 16/600 መጠን ማግለል አምድ (GE Healthcare, US) ላይ ተጭኖ ከዚያም በተመሳሳይ ቋት ውስጥ በ1.5 CV ተወጣ። የመጠን ማግለል ክፍልፋይ የመምጠጥ ስፔክትራ ይሰብስቡ እና የመምጠጥ ስፔክትራውን በ2.4 እና A880/A805 ሬሾዎች ላይ በA880/A280 ሬሾዎች ላይ ያተኩሩ። ከ5.8 እስከ 100 A880 ባለው ጊዜ ውስጥ ለክሪዮ-TEM ፍርግርግ ዝግጅት ወይም ማከማቻ ወዲያውኑ ይጠቀሙባቸው። ​​አስፈላጊ እስኪሆን ድረስ በ-80°ሴ ያስቀምጡ።
ከPufW-His ዝርያ የሚገኘው የሚሟሟ ሽፋን በIMAC ቋት (GE Healthcare) (200 mM NaCl እና 0.03% (w/w)) ውስጥ ባለ 20 ሚሊ ሊትር HisPrep FF Ni-NTA Sepharose አምድ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ላይ ተተግብሯል። አምድ በIMAC ቋት አምስት CVs እና ከዚያም 10 mM histidine የያዙ አምስት CVs IMAC ቋት ታጥቧል። ኮር ኮምፕሌክስ ከአምዱ 100 mM histidine የያዙ አምስት IMAC ቋቶች ተወግዷል። የ RC-LH114-W ኮምፕሌክስ የያዘው ክፍልፋይ በአሚኮን 100,000 MWCO ማጣሪያ (Merck, UK) በተገጠመለት በተቀሰቀሰ ማጠራቀሚያ ውስጥ እስከ ~10 ሚሊ ሊትር ድረስ ተከማችቶ 20 ጊዜ በማያያዝ ቋት ተቀልጦ ወደ 25 ሚሊ ሊትር ተጨምሯል። በDEAE Sepharose አምድ ውስጥ፣ ከቋቱ ጋር የተያያዙ አራት CVs አስቀድመው ጥቅም ላይ ይውላሉ። አምዱን በአራት የሲቪ ማያያዣ ቋቶች ያጠቡ፣ ከዚያም በስምንት ሲቪዎች ላይ ከ0 እስከ 100 mM NaCl (በማያያዣ ቋት) መስመራዊ ቅልመት ላይ ውስብስብነቱን ያስወግዱ፣ እና የተቀሩት አራት ሲቪዎች 100 mM ማያያዣ ቋት የያዙ ናቸው። በሶዲየም ክሎራይድ ላይ የተጣሉት የቀሩት ውህዶች ከ2.4 ከፍ ካለው የA880/A280 ጥምርታ እና ከ4.6 ክፍልፋዮች ከፍ ካለው የA880/A805 ጥምርታ ጋር ተጣምረው በአሚኮን 100,000 MWCO ሴንትሪፉጋል ማጣሪያ ውስጥ ወደ ~2 ሚሊ ሊትር ተከማችተው፣ እና በቅድሚያ በ1.5 ሲቪ IMAC ሞልተው በሱፐርዴክስ 200 16/600 መጠን ማግለል አምድ ላይ ተሰልፈዋል፣ ከዚያም በተመሳሳይ ቋት ውስጥ በ1.5 ሲቪ ላይ ተሰልፈዋል። የመጠን-ማግለያ ክፍልፋዮችን የመምጠጥ ስፔክትራ ይሰብስቡ እና የመምጠጥ ስፔክትራውን ከ2.1 እስከ 100 A880 ባለው የA880/A280 ሬሾዎች እና ከ4.6 እስከ 100 A880 ባለው የA880/A805 ሬሾዎች ጋር ያዋህዱ፣ እነዚህም ወዲያውኑ ለቀዘቀዘ የTEM ፍርግርግ ዝግጅት ወይም አስፈላጊ እስኪሆን ድረስ በ-80°ሴ ይከማቻሉ።
የLeica EM GP ኢምፕሬዘር ማቀዝቀዣ ዝቅተኛ የሙቀት መጠን ያላቸውን የTEM ግሪዶች ለማዘጋጀት ጥቅም ላይ ውሏል። ውህዱ በIMAC ቋት ውስጥ እስከ 50 A880 ድረስ ተበረዘ፣ ከዚያም 5μl በአዲስ ብርሃን በተለቀቀው QUANTIFOIL 1.2/1.3 ካርቦን በተሸፈነ የመዳብ ሜሽ (Agar Scientific፣ UK) ላይ ተጭኗል። ግሪዱን በ20°ሴ እና 60% አንጻራዊ እርጥበት ለ30 ሰከንዶች ያቀዘቅዙት፣ ከዚያም ለ3 ሰከንዶች ያድርቁት፣ ከዚያም በ-176°ሴ በፈሳሽ ኤቴን ውስጥ ያጥፉት።
የRC-LH114-W ውስብስብ መረጃ በeBIC (ኤሌክትሮኒክ ባዮኢሜጂንግ ማዕከል) (ብሪቲሽ ዳይመንድ ላይት ምንጭ) ላይ ተመዝግቧል፣ ይህም በ300kV ፍጥነት በሚጨምር ቮልቴጅ የሚሰራ፣ 130,000× የሆነ ስመ ማጉላት እና የ20 eV ኃይል - ክፍተት ይምረጡ። Gatan 968 GIF Quantum ከK2 ፒክ ማወቂያ ጋር ውሂብ ለመሰብሰብ ምስሎችን በመቁጠር ሁነታ ለመቅዳት ጥቅም ላይ ውሏል። የተስተካከለው የፒክሰል መጠን 1.048Å ሲሆን የመጠን መጠኑ 3.83 e-Å-2s-1 ነው። ፊልሙን በ11 ሰከንዶች ውስጥ ሰብስቦ በ40 ክፍሎች ከፍሎታል። ማይክሮስኮፑን እንደገና ለማተኮር የካርቦን ሽፋን ያለውን ቦታ ይጠቀሙ እና ከዚያም በአንድ ቀዳዳ ሶስት ፊልሞችን ይሰብስቡ። በአጠቃላይ 3130 ፊልሞች ተሰብስበው ነበር፣ በ-1 እና -3μm መካከል የዲስፎከስ እሴቶች።
የRC-LH116 ውስብስብ መረጃ የተሰበሰበው በአስተርበሪ ባዮስትራክቸር ላቦራቶሪ (የሊድስ ዩኒቨርሲቲ፣ ዩኬ) ተመሳሳይ ማይክሮስኮፕ በመጠቀም ነው። መረጃው የተሰበሰበው በ130 ኪ.ሜ ማጉላት በመቁጠር ሁነታ ሲሆን የፒክሰል መጠኑ ወደ 1.065 Å በ4.6 e-Å-2s-1 መጠን ተቀይሯል። ፊልሙ በ12 ሰከንዶች ውስጥ ተመዝግቦ በ48 ክፍሎች ተከፍሏል። በአጠቃላይ 3359 ፊልሞች ተሰብስበው የፎከስ ዲፎክስ እሴቶች በ-1 እና -3μm መካከል ነበሩ።
ሁሉም የውሂብ ሂደት የሚከናወነው በRelion 3.0 ቧንቧ መስመር (42) ውስጥ ነው። የጨረር እንቅስቃሴን በመጠን ክብደት ለማስተካከል Motioncorr 2 (43) ይጠቀሙ፣ እና ከዚያ የCTF (የንፅፅር ማስተላለፊያ ተግባር) መለኪያን ለመወሰን CTF 4.1 (44) ይጠቀሙ። ከእነዚህ የመጀመሪያ የማቀነባበሪያ ደረጃዎች በኋላ የተለመዱ የፎቶ ማይክሮግራፎች በስእል 2. S16 ላይ ይታያሉ። አውቶማቲክ የምርጫ አብነት የሚፈጠረው በ250-ፒክስል ክፈፍ ውስጥ ወደ 250 ፒክስል የሚሆኑ 1000 ቅንጣቶችን በእጅ በመምረጥ እና ምንም የማጣቀሻ ባለ ሁለት-ልኬት (2D) ምደባ ሳይኖር ነው፣ በዚህም የናሙና ብክለትን የሚያሟሉ ወይም ምንም የሚታዩ ባህሪያት የሌላቸውን ምደባዎች ውድቅ በማድረግ ነው። ከዚያም፣ በሁሉም ማይክሮፎቶግራፎች ላይ አውቶማቲክ ምርጫ ተካሂዷል፣ እና RC-LH114-W 849,359 ቅንጣቶች ነበር፣ እና የRC-LH116 ውስብስብ 476,547 ቅንጣቶች ነበሩ። ሁሉም የተመረጡ ቅንጣቶች ሁለት ዙር ማጣቀሻ ያልሆኑ 2D ምደባዎችን አሳልፈዋል፣ እና ከእያንዳንዱ ሩጫ በኋላ፣ የካርቦን አካባቢን የሚያሟሉ ቅንጣቶች፣ የናሙና ብክለት፣ ግልጽ ያልሆኑ ባህሪያት ወይም በጥብቅ የተደራረቡ ቅንጣቶች ውድቅ ይደረጋሉ፣ በዚህም ምክንያት 772,033 (90.9%) እና 359,678 (75.5%) ቅንጣቶች በቅደም ተከተል ለ RC-LH114-W እና RC-LH116 3D ምደባ ጥቅም ላይ ይውላሉ። የመጀመሪያው 3D ማጣቀሻ ሞዴል የተፈጠረው በስቶካስቲክ ግሬዲየንት ዴዝመንት ዘዴ ነው። የመጀመሪያውን ሞዴል እንደ ማጣቀሻ በመጠቀም፣ የተመረጡት ቅንጣቶች በ3D ውስጥ በአራት ምድቦች ይመደባሉ። በዚህ ምድብ ውስጥ ያለውን ሞዴል እንደ ማጣቀሻ በመጠቀም፣ በትልቁ ምድብ ውስጥ ባሉ ቅንጣቶች ላይ 3D ማጣሪያ ያከናውኑ፣ ከዚያም የሟሟ ቦታን ለመሸፈን የመጀመሪያውን 15Å ዝቅተኛ-ማለፊያ ማጣሪያ ይጠቀሙ፣ 6 ፒክስል ለስላሳ ጠርዞችን ይጨምሩ፣ እና የከፍተኛው መመርመሪያውን የጋታን K2 ጫፍ ሞዱሌሽን ዝውውር ተግባርን ለማስተካከል ፒክስሎቹን ከሂደት በኋላ ያሂዱ። ለRC-LH114-W የውሂብ ስብስብ፣ ይህ የመጀመሪያ ሞዴል በጭምብሉ ጠርዝ ላይ ያለውን ጠንካራ ጥግግት በማስወገድ (በUCSF Chimera ውስጥ ካለው ዋና ውስብስብ ጥግግት የተላቀቀ) ተሻሽሏል። የተገኙት ሞዴሎች (የRC-LH114-W እና RC-LH116 ጥራቶች በቅደም ተከተል 3.91 እና 4.16 Å ናቸው) ለሁለተኛው የ3D ምደባ ዙር እንደ ማጣቀሻ ያገለግላሉ። ጥቅም ላይ የዋሉት ቅንጣቶች ወደ መጀመሪያው የ3D ክፍል የተመደቡ ሲሆን ከአካባቢው ጋር ጠንካራ ትስስር የላቸውም። ግልጽ የሆኑ የመዋቅር ባህሪያት መደራረብ ወይም አለመኖር። ከሁለተኛው የ3D ምደባ ዙር በኋላ፣ ከፍተኛው ጥራት ያለው ምድብ ተመርጧል [ለRC-LH114-W፣ አንድ ምድብ 377,703 ቅንጣቶች (44.5%) ነው፣ ለRC-LH116፣ በድምሩ 260,752 ቅንጣቶች (54.7%) የሚባሉ ሁለት ምድቦች አሉ፣ እነዚህም ከመጀመሪያው ሽክርክሪት በኋላ ትንሽ ልዩነት ሲኖራቸው ብቻ ተመሳሳይ ናቸው።] የተመረጡት ቅንጣቶች በ400-ፒክስል ሳጥን ውስጥ እንደገና ይወጣሉ እና በ3-ልኬት ማጣሪያ ይጣራሉ። የሟሟት ጭምብል የሚመነጨው የመጀመሪያውን 15Å ዝቅተኛ-ማለፊያ ማጣሪያ፣ 3 ፒክስል የካርታ መስፋፋት እና 3 ፒክስል ለስላሳ ጭምብል በመጠቀም ነው። በእያንዳንዱ-ቅንጣት CTF ማሻሻያ፣ በእያንዳንዱ-ቅንጣት እንቅስቃሴ እርማት እና በሁለተኛው ዙር በእያንዳንዱ-ቅንጣት CTF ማሻሻያ፣ 3-ልኬት ማሻሻያ፣ የሟሟት ጭምብል እና ድህረ-ሂደት ከእያንዳንዱ እርምጃ በኋላ የተገኘውን ሸካራነት የበለጠ ለማጣራት ይከናወናሉ። የFSC (የፉሪየር ሼል ኮሬሌሽን ኮፊሸንት) የመቁረጫ እሴት 0.143 በመጠቀም፣ የRC-LH114-W እና RC-LH116 የመጨረሻ ሞዴሎች ጥራቶች በቅደም ተከተል 2.65 እና 2.80Å ናቸው። የመጨረሻው ሞዴል የFSC ኩርባ በስእል 2. S17 ላይ ይታያል።
ሁሉም የፕሮቲን ቅደም ተከተሎች ከ UniProtKB: LH1-β (PufB፤ UniProt ID: Q6N9L5)፤ LH1-α (PufA፤ UniProtID: Q6N9L4)፤ RC-L (PufL፤ UniProt ID: O83005)፤ RC-M (PufM፤ UniProt ID: A0A4Z7)፤ RC-H (PuhA፤ UniProt ID: A0A4Z9)፤ ፕሮቲን-ደብሊው (PufW፤ UniProt ID: Q6N1K3) የወረዱ ናቸው። የስዊስ-ሞዴል (45) የRC-L፣ RC-M እና RC-H የፕሮቲን ቅደም ተከተሎችን የያዘውን የRC ተመሳሳይነት ሞዴል ለመገንባት ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና የRba ክሪስታል መዋቅርም ጥቅም ላይ ውሏል። sphaeroides RC እንደ አብነት (PDB ID: 5LSE) (46)። የተፈጠረውን ሞዴል ከካርታው (47) ጋር ለማስማማት፣ የፕሮቲን አወቃቀሩን ለማሻሻል እና ኮፋክተር [4×BChl a (ሞኖመር ቤተመፃህፍት ቅሪት ስም = BCL)፣ 2×BPh a (BPH)፣ አንድ ወይም ሁለት ዓይነት UQ10 (U10)፣ አንድ ሄሜ ያልሆነ ብረት (Fe) እና አንድ 3,4-ዲሃይድሮሄክሳካርቦኒልኮሊን (QAK)] በUCSF Chimera ውስጥ ያለውን “የማስተካከያ ካርታ” መሳሪያ በመጠቀም ለመጨመር ይጠቀሙበት።
ቀጥሎ፣ የLH1 ንዑስ ክፍል ተገንብቷል። መጀመሪያ ላይ፣ በPHENIX (49) ውስጥ ያለው አውቶማቲክ የግንባታ መሳሪያ ካርታውን እና የLH1-α እና LH1-β ፕሮቲን ቅደም ተከተሎችን እንደ ግብዓት በመጠቀም የLH1 ቅደም ተከተል ክፍልን በራስ-ሰር ለመገንባት ጥቅም ላይ ውሏል። በጣም የተሟላውን የLH1 ንዑስ ክፍል ይምረጡ፣ ያውጡት እና ወደ ኩውት ይጫኑት፣ በውስጡ ያለውን የጎደለውን ቅደም ተከተል በእጅ ያክሉት፣ እና ሁለት BCls a (BCL) እና spirilloxanthin (CRT) ከማከልዎ በፊት መላውን መዋቅር በእጅ ያጣሩ [በLH1 ውስብስብ ጥግግት እና በሚታወቀው የካሮቲኖይድ ይዘት መሠረት። ዝርያዎች (17)]። ሙሉውን የLH1 ንዑስ ክፍል ይቅዱ፣ እና የUCSF Chimera “የመትከያ ካርታ መሳሪያ”ን በመጠቀም በአቅራቢያው ባለው የሞዴል ያልሆነ የLH1 ጥግግት አካባቢ ላይ ለመትከል እና ከዚያም በኩውት ውስጥ ያሻሽሉት፤ ሁሉም የLH1 ንዑስ ክፍሎች እስኪቀረጹ ድረስ ሂደቱን ይድገሙት። ለRC-LH114-W መዋቅር፣ በኩቱ ውስጥ ያልተመደበውን ጥግግት በማውጣት፣ ፕሮቲኑ በዩኤስሲኤፍ ቺሜራ ካርታ ውስጥ ከቀሩት ፕሮቲን ያልሆኑ ክፍሎች የተከፋፈለ ሲሆን የራስ-ግንባታ መሳሪያው የመጀመሪያውን ሞዴል እና የቀሩትን ንዑስ ክፍሎች (ፕሮቲን-ደብሊው) ሞዴሊንግ ለመመስረት ይጠቅማል። በPHENIX (49) ውስጥ። በኩቱ (48) ውስጥ ወደተገኘው ሞዴል ማንኛውንም የጎደሉ ቅደም ተከተሎችን ያክሉ እና ከዚያ መላውን ንዑስ ክፍል በእጅ ያጣሩ። የተቀረው ያልተመደበ ጥግግት ከሊፒድስ (የCDL = CDL፣ POPC = 6PL እና POPG = PGT)፣ β-DDM ሳሙና (LMT) እና UQ10 ሞለኪውሎች (U10) ጥምረት ጋር ይጣጣማል። የሞዴል ስታቲስቲክስ እና የመገጣጠሚያው የእይታ ጥራት የበለጠ እስኪሻሻል ድረስ የተሟላውን የመጀመሪያ ሞዴል ለማሟሟት በኩቱ (48) ውስጥ የPHENIX ማመቻቸት (49) እና በእጅ ማመቻቸትን ይጠቀሙ። በመጨረሻም፣ የአካባቢውን ካርታ ለማሳመር LocScale (50) ይጠቀሙ፣ እና ከዚያም ያልተመደበውን ጥግግት እና አውቶማቲክ እና በእጅ ማመቻቸትን የሞዴሊንግ ሌሎች በርካታ ዑደቶችን ያከናውኑ።
በየራሳቸው ጥግግት ውስጥ የተተከሉት ፔፕታይዶች፣ ኮፋክተሮች እና ሌሎች ሊፒዶች እና ኩዊኖኖች በስእል 1 እና 2 ይታያሉ። S18 እስከ S23። የመጨረሻው ሞዴል ስታትስቲካዊ መረጃ በሰንጠረዥ S1 ውስጥ ይታያል።
ሌላ ካልተገለጸ በስተቀር፣ የ UV/Vis/NIR የመምጠጥ ስፔክትራዎች በCary60 ስፔክትሮፎቶሜትር (Agilent፣ USA) ላይ ከ250 nm እስከ 1000 nm ባለው 1 nm ልዩነት እና የውህደት ጊዜ 0.1s ነው።
ናሙናውን በኳርትዝ ​​ኩቬት ውስጥ በ2 ሚሜ መንገድ ወደ A880 1 ያዋህዱት፣ እና በ400 እና 1000 nm መካከል ያለውን የመምጠጥ ስፔክትረም ይሰብስቡ። ክብ ቅርጽ ያላቸው ዲክሮይክ ስፔክትራዎች በጃስኮ 810 ስፔክትሮፖላሪሜትር (ጃስኮ፣ ጃፓን) ላይ በ20 nm ደቂቃ-1 የፍተሻ ፍጥነት በ400 nm እና 950 nm መካከል በ1 nm ልዩነት ተሰብስበዋል።
የሞላር መጥፋት ኮፊሸንት የሚለካው ዋናውን ውስብስብ ወደ በግምት 50 በሆነ A880 በመቀነስ ነው። የ10μl መጠንን በ990μl ማያያዣ ቋት ወይም ሜታኖል ውስጥ ይቅሉት እና የBChl መበላሸትን ለመቀነስ ወዲያውኑ የመምጠጥ ስፔክትረም ይሰብስቡ። የእያንዳንዱ የሜታኖል ናሙና የBChl ይዘት በ54.8 mM-1 ሴሜ-1 በ771 nm የመጥፋት ኮፊሸንት በመሰላት እና የመጥፋት ኮፊሸንት ተወስኗል (51)። የተለካውን የBChl ክምችት ክምችት በ32 (RC-LH114-W) ወይም 36 (RC-LH116) ይከፋፍሉት፣ ይህም በቋፍ ውስጥ የተሰበሰበውን ተመሳሳይ ናሙና የመምጠጥ ስፔክትረም ለመወሰን ያገለግላል፣ ከዚያም በቋፍ ውስጥ የተሰበሰበውን ተመሳሳይ ናሙና የመምጠጥ ስፔክትረም ለመወሰን ያገለግላል። ለእያንዳንዱ ናሙና ሶስት ተደጋጋሚ መለኪያዎች ተወስደዋል፣ እና የBChl Qy ከፍተኛ አማካይ የመምጠጥ ስፔክትረም ለማስላት ጥቅም ላይ ውሏል። በ878 nm የሚለካው የRC-LH114-W የመጥፋት ኮፊሸንት 3280±140 mM-1 cm-1 ሲሆን በ880 nm የሚለካው የRC-LH116 የመጥፋት ኮፊሸንት 3800±30 mM-1 cm-1 ነው።
UQ10 በ(52) ውስጥ ባለው ዘዴ መሰረት ተለክቷል። ባጭሩ፣ የተገላቢጦሽ ምዕራፍ HPLC (RP-HPLC) የተከናወነው በAgilent 1200 HPLC ስርዓት በመጠቀም ነው። 0.02 nmol የRC-LH116 ወይም RC-LH114-W 0.02 nmol በ50μl 50:50 ሜታኖል፡ክሎሮፎርም ውስጥ 0.02% (w/v) ፌሪክ ክሎራይድ የያዘውን 0.02% (w/v) ፌሪክ ክሎራይድ የያዘውን 50μl ሜታኖል፡ክሎሮፎርም ውስጥ ይቀልጡት፣ እና ቀድሞ የተመጣጠነውን ቤክማን ኮልተር አልትራሳውንድ ፕላስፌር ኦዲኤስ 4.6 ሚሜ በ40°ሴ በHPLC ሟሟት (80:20 methanol:2-propanol) በ×25 ሴ.ሜ አምድ ላይ በ1 ml-1 ደቂቃ-1 ውስጥ ይቀልጡት። በ275 nm (UQ10)፣ 450 nm (ካሮቴኖይድ) እና 780 nm (BChl) ላይ ያለውን መምጠጥ ለመቆጣጠር በHPLC ሟሟት ውስጥ የኢሶክራቲክ ኢሉሽን ያከናውኑ። በ25.5 ደቂቃዎች ውስጥ በ275 nm ክሮማቶግራም ውስጥ ያለው ጫፍ የተዋሃደ ሲሆን ይህም ሌሎች ሊታወቁ የሚችሉ ውህዶችን አልያዘም። የተቀናጀው ቦታ ከ0 እስከ 5.8 nmol (ምስል S14) ያሉትን ንፁህ ደረጃዎችን በመርፌ ከተሰላው የካሊብሬሽን ኩርባ ጋር በማጣቀስ የተወጣውን የUQ10 ሞላር መጠን ለማስላት ይጠቅማል። እያንዳንዱ ናሙና በሦስት ድግግሞሽ ተተነተነ፣ እና የተዘገበው ስህተት ከአማካይ SD ጋር ይዛመዳል።
ከፍተኛውን የQy መምጠጥ 0.1 የሆነ የRC-LH1 ውስብስብ የያዘ መፍትሄ በ30 μM የተቀነሰ የፈረስ ልብ ሳይቶክሮም c2 (Merck፣ UK) እና ከ0 እስከ 50 μMUQ2 (Merck፣ UK) ተዘጋጅቷል። ሶስት የ1-ሚሊ ሊትር ናሙናዎች በእያንዳንዱ UQ2 ክምችት ተዘጋጅተው ከመለኪያው በፊት ከጨለማው ጋር ሙሉ በሙሉ መላመድን ለማረጋገጥ በ4°ሴ በጨለማ ውስጥ በአንድ ሌሊት እንዲቆዩ ተደርጓል። መፍትሄው በ300 nm የእሳት/500 መስመር ፍርግርግ፣ 1.24 ሚሜ መግቢያ፣ 0.12 ሚሜ መካከለኛ እና 0.6 ሚሜ መውጫ ቀዳዳዎች በተገጠመለት የOLIS RSM1000 ሞዱላር ስፔክትሮፎቶሜትር ውስጥ ተጭኗል። የ600 nm ርዝመት ያለው ማለፊያ ማጣሪያ በናሙና ፎቶቱብ መግቢያ እና በማጣቀሻ ፎቶማሊፒየር ቱቦ መግቢያ ላይ የማነቃቂያ ብርሃንን ለማስወገድ ይደረጋል። የመምጠጥ ሂደቱ በ550 nm ቁጥጥር ተደርጎበት በ0.15 ሰከንድ የማዋሃድ ጊዜ ተከናውኗል። የማነቃቂያ መብራቱ ከ880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) በDC2200 መቆጣጠሪያ (Thorlabs Ltd., UK) በኩል በ90% ጥንካሬ በፋይበር ኦፕቲክ ገመድ በኩል ይለቀቃል እና በ90° አንግል ወደ ብርሃን ምንጭ ይለቀቃል። የመለኪያ ጨረሩ ከመስተዋቱ ጋር ይቃረናል፣ ይህም በመጀመሪያ በናሙናው ያልተዋጠ ማንኛውንም ብርሃን ይመልሳል። ከ50 ሰከንድ ብርሃን በፊት የመምጠጥ ብቃቱን ለ10 ሰከንድ ይከታተሉ። ከዚያም ኩዊኖሎል ሳይቶክሮም c23+ በድንገት የሚቀንስበትን መጠን ለመገምገም በጨለማ ውስጥ ለ60 ሰከንድ ተጨማሪ ክትትል ተደርጓል (ጥሬ መረጃ ለማግኘት ምስል S8 ይመልከቱ)።
መረጃው የተካሄደው ከ0.5 እስከ 10 ሰከንድ ውስጥ መስመራዊ የመጀመሪያ ፍጥነትን በመግጠም እና በእያንዳንዱ UQ2 ክምችት ላይ ያሉትን የሶስቱም ናሙናዎች መጠኖች በአማካይ በማስተካከል ነው። በየተወሰነው የመጥፋት ኮፊሸንት የተሰላው የRC-LH1 ክምችት ፍጥነቱን ወደ ካታሊቲክ ቅልጥፍና ለመቀየር ጥቅም ላይ ውሏል፣ ይህም በ Origin Pro 2019 (OriginLab፣ USA) ላይ ተቀርጾ የሚታይ የKm እና Kcat እሴቶችን ለመወሰን ከሚካሊስ-ሜንተን ሞዴል ጋር ተገጥሟል።
ለጊዜያዊ የመምጠጥ መለኪያዎች፣ የRC-LH1 ናሙና በIMAC ቋት ውስጥ 50 mM ሶዲየም አስኮርባት (ሜርክ፣ ዩኤስኤ) እና 0.4 mM ቴርቡቲን (ሜርክ፣ ዩኤስኤ) የያዘውን ~2μM ተበርዟል። አስኮርቢክ አሲድ እንደ መስዋዕትነት የሚያገለግል ኤሌክትሮን ለጋሽ ሆኖ ያገለግላል፣ እና ዋናው የRC ለጋሽ በመለኪያ ሂደቱ ውስጥ እንዲቀንስ (ማለትም ፎቶኦክሳይድ የተደረገበት አይደለም) ቴርት-ቡታክሎፌን እንደ QB አጋች ጥቅም ላይ ይውላል። በግምት 3 ሚሊ ሊትር ናሙና ወደ ብጁ የሚሽከረከር ሴል (0.1 ሜትር ዲያሜትር፣ 350 አርፒኤም) በ2 ሚሜ የኦፕቲካል መንገድ ርዝመት ተጨምሮ በሌዘር መንገድ ውስጥ ያለው ናሙና በማነቃቂያ ምቶች መካከል ለጨለማ መላመድ በቂ ጊዜ እንዲኖረው ያደርጋል። ናሙናውን በ880 nm በ1 kHz (20 nJ ለ NIR ወይም 100 nJ ለ Vis) ለማነቃቃት ~100-fs የሌዘር ምቶች ይጠቀሙ። ናሙናውን በ880 nm በ1 kHz (20 nJ ለ NIR ወይም 100 nJ ለ Vis) ለማነቃቃት ~100-fs የሌዘር ምቶች ይጠቀሙ። መረጃ ከመሰብሰብዎ በፊት ናሙናውን ለ30 ደቂቃዎች ያህል በማነቃቂያ ብርሃን ውስጥ ያጋልጡት። ተጋላጭነቱ የQA እንቅስቃሴን (QA) መገደብን ያስከትላል (ምናልባትም አንድ ጊዜ ወይም ሁለት ጊዜ የQA መጠንን ይቀንሳል)። ነገር ግን ይህ ሂደት ሊቀለበስ የሚችል መሆኑን ልብ ይበሉ ምክንያቱም ረጅም ጊዜ ከጨለማ መላመድ በኋላ፣ RC ቀስ በቀስ ወደ የQA እንቅስቃሴ ይመለሳል። ከ -10 እስከ 7000 ps የመዘግየት ጊዜ ያለው ጊዜያዊ ስፔክትራ ለመለካት የሄሊዮስ ስፔክትሮሜትር (Ultrafast Systems፣ USA) ጥቅም ላይ ውሏል። የውሂብ ስብስቦችን ለማላቀቅ፣ ከዚያም ለማዋሃድ እና መደበኛ ለማድረግ የSurface Xplorer ሶፍትዌር (Ultrafast Systems፣ USA) ይጠቀሙ። ከመበስበስ ጋር የተያያዘውን ልዩነት ያለው ስፔክትራ ለማግኘት የተጣመረውን የውሂብ ስብስብ ለመጠቀም የCarpetView ሶፍትዌር ፓኬጅ (Light Conversion Ltd., Lithuania) ይጠቀሙ ወይም በኦሪጅን (OriginLab, USA) ውስጥ ያለውን ነጠላ-ሞገድ ርዝመት ያለው ስፔክትራል ዝግመተ ለውጥ ለማስማማት ከመሳሪያው ምላሽ ጋር ብዙ ኤክስፖነንቶችን የሚያካትት ተግባር ይጠቀሙ።
ከላይ እንደተጠቀሰው (53)፣ የRC እና የፔሪፈራል LH2 አንቴና የሌለው የLH1 ውስብስብ የያዘ የፎቶሲንተቲክ ፊልም ተዘጋጅቷል። ሽፋኑ በ20 mM ትሪስ (pH 8.0) ውስጥ ተቀልጦ ከዚያም 2 ሚሜ የኦፕቲካል መንገድ ባለው ኳርትዝ ኩቬት ውስጥ ተጭኗል። ናሙናውን በ540 nm ለማነቃቃት 30nJ የሌዘር ምት ከ -10 እስከ 7000 ps የመዘግየት ጊዜ ጋር ጥቅም ላይ ውሏል። የውሂብ ስብስቡን ለ Rps. pal ናሙና እንደተገለጸው ያሂዱ።
ሽፋኑ በ150,000 RCF ለ2 ሰዓታት በ4°ሴ በሴንትሪፉጌሽን ተበተነ፣ ከዚያም በ880 nm ያለው የመምጠጥ ችሎታው በ20 mM tris-HCl (pH 8.0) እና 200 mM NaCl ውስጥ እንደገና ተንጠለጠለ። ሽፋኑን በ4°ሴ በጨለማ ውስጥ ለ1 ሰዓት በ2% (w/v) β-DDM ቀስ በቀስ በማነሳሳት ይቀልጡት። ናሙናው በ100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB፤ Merck, UK) ውስጥ ወደ 2.5 mg ml-1 የፕሮቲን ክምችት (Bio-Rad analysis) ተበረዘ። ከዚህ ቀደም ከታተመው ዘዴ (54) ተጨማሪ ሂደት ተካሂዷል፣ ይህም 1% (w/v) ሶዲየም ላውሬት (Merck, UK) የያዘ 50 μg ፕሮቲን ወደ 50 μl TEAB በመቀነስ ይጀምራል። ለ60 ሰከንድ ሶኒኬሽን ከተደረገ በኋላ፣ በ37°ሴ በ5 mM ትሪስ(2-ካርቦክሲኢቲል)ፎስፊን (ሜርክ፣ ዩኬ) ለ30 ደቂቃዎች ቀንሷል። ለኤስ-አልኪሌሽን፣ ናሙናውን በ10 mM ሜቲል ኤስ-ሜቲልቲዮሜትኔሰልፎኔት (ሜርክ፣ ዩኬ) ያቀዘቅዙትና ከ200 mM ኢሶፕሮፓኖል ክምችት መፍትሄ ለ10 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ይጨምሩት። የፕሮቲዮሊቲክ መፈጨት የተከናወነው 2 μg ትራይፕሲን/ኢንዶፕሮቲኔዝ ሊስ-ሲ ድብልቅ (ፕሮሜጋ ዩኬ) በመጨመር እና ለ3 ሰዓታት በ37°ሴ በማቀዝቀዝ ነው። የላውሬት ሰርፋክታንት 50 μl ኤቲል አሲቴት እና 10 μl 10% (v/v) LC ደረጃ ትሪፍሎሮአሲቲክ አሲድ (TFA፤ Thermo Fisher Scientific፣ UK) በመጨመር እና ለ60 ሰከንድ በማዞር ተወግዷል። የደረጃ መለያየት በ15,700 RCF በሴንትሪፉጌሽን ለ5 ደቂቃዎች ተሻሽሏል። በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት፣ ፔፕታይዱን የያዘውን የታችኛውን ክፍል በጥንቃቄ ለማምጠጥ እና ጨው ለማስወገድ የC18 ስፒን አምድ (Thermo Fisher Scientific፣ UK) ጥቅም ላይ ውሏል። በቫክዩም ሴንትሪፉጌሽን ከደረቀ በኋላ፣ ናሙናው በ0.5% TFA እና 3% አሴቶኒትሪል ውስጥ ፈሰሰ፣ እና 500 ng ቀደም ሲል የተዘረዘሩትን የስርዓት መለኪያዎች በመጠቀም በናኖፍሎው አርፒ ክሮማቶግራፊ ከጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ጋር ተተነተነ።
የፕሮቲን መለያ እና መጠንን ለማግኘት MaxQuant v.1.5.3.30 (56)ን ይጠቀሙ የRps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)። የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ፕሮቲዮሚክስ መረጃ በProteomeXchange Alliance በኩል በPRIDE አጋር ማከማቻ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) በመረጃ ስብስብ መለያ PXD020402 ስር ተቀምጧል።
በRPLC ከኤሌክትሮስፕሬይ ionization mass spectrometry ጋር ተጣምሮ ለትንታኔ፣ የRC-LH1 ውስብስብ ከዱር ዓይነት Rps ተዘጋጅቷል። ቀደም ሲል የታተመውን ዘዴ (16) በመጠቀም፣ በፓሉስትሪስ ሴሎች ውስጥ የሚመረተው የፕሮቲን ክምችት በ20 mM Hepes (pH 7.8)፣ 100 mM NaCl እና 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM ውስጥ 2 ሚ.ግ. ml-1 ነበር። በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት፣ 10 μg ፕሮቲን በዝናብ ዘዴ ለማውጣት 2D የማጥራት ኪት (GE Healthcare, USA) ይጠቀሙ እና ዝናብን በ20 μl 60% (v/v) ፎርሚክ አሲድ (FA)፣ 20% (v/v) አሴቶኒትሪል እና 20% (v/v) ውሃ ውስጥ ያሟሟሉ። አምስት ማይክሮሊተሮች በRPLC (Dionex RSLC) ከጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (Maxis UHR-TOF፣ Bruker) ጋር ተዳምረው ተተነተኑ። በ60°ሴ እና 100μlmin -1 ላይ ለመለየት የMabPac 1.2×100 ሚሜ አምድ (Thermo Fisher Scientific፣ UK)ን ይጠቀሙ፣ 85% (v/v) ሟሟት A [0.1% (v/v) FA እና 0.02% (V/v) TFA የውሃ መፍትሄ] ወደ 85% (v/v) ሟሟት B [0.1%(v/v) FA እና 0.02%(v/v) በ90%(v/v) አሴቶኒትሪል TFA] ቅልመት ያለው። መደበኛ የኤሌክትሮስፕሬይ ionization ምንጭ እና ነባሪ መለኪያዎችን ከ60 ደቂቃዎች በላይ በመጠቀም የጅምላ ስፔክትሮሜትር ከ100 እስከ 2750 ሜ/z (የጅምላ-ወደ-ቻርጅ ጥምርታ) ያገኛል። በExPASy ባዮኢንፎርማቲክስ ሪሶርስ ፖርታል የFindPept መሳሪያ (https://web.expasy.org/findpept/) እገዛ የጅምላ ስፔክትረምን ከውስብስቡ ንዑስ ክፍሎች ጋር ያመሳስሉ።
ሴሎቹ ለ72 ሰዓታት በ100 ሚሊ ሊትር NF-ዝቅተኛ (10μMm-2 s-1)፣ መካከለኛ (30μMm-2 s-1) ወይም ከፍተኛ (300μMm-2 s-1) ብርሃን ስር አድጓል። በ100 ሚሊ ሊትር ስክሩ-ቶፕ ጠርሙስ (23) ውስጥ M22 መካከለኛ (M22 መካከለኛ) (አሞኒየም ሰልፌት የሚወገድበት እና ሶዲየም ሱኪኔት በሶዲየም አሲቴት የሚተካበት) M22 መካከለኛ (M22 መካከለኛ)። በአምስት የ30-ሴ ዑደቶች ውስጥ፣ 0.1 ማይክሮን የመስታወት ዶቃዎች በ1፡1 የድምጽ ጥምርታ ህዋሶቹን ለማለስለስ እና ለ5 ደቂቃዎች በበረዶ ላይ እንዲቀዘቅዙ ተደርገዋል። የማይሟሟ ቁስ፣ ያልተሰበሩ ሴሎች እና የመስታወት ዶቃዎች በ16,000 RCF ለ10 ደቂቃዎች በቤንችቶፕ ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ውስጥ በሴንትሪፉጌሽን ተወግደዋል። ሽፋኑ በቲ 70.1 ሮተር ውስጥ በ20 mM tris-HCl (pH 8.0) ውስጥ 100,000 RCF እና 40/15% (w/w) የሱክሮስ ግራዲየንት ለ10 ሰዓታት ተለያይቷል።
በቀደመው ስራችን፣ በፑፍደብሊው (16) ላይ የሂስ መለያን የመከላከል አቅም (ኢሚውኖዲቴክሽን) እንደተገለጸው። ባጭሩ፣ የተጣራው ኮር ኮምፕሌክስ (11.8 nM) ወይም ተመሳሳይ የRC ክምችት የያዘው ሽፋን (የተቀነሰውን የልዩነት ስፔክትረም በመቀነስ እና በቆሸሸው ጄል ላይ ያለውን ጭነት በማዛመድ የሚወሰን) በ2x SDS የመጫኛ ቋት (Merck፣ UK) ውስጥ ሁለት ጊዜ ተበርዟል። ፕሮቲኖቹ በ12% ቢስ-ትሪስ ኑፔጅ ጄል (Thermo Fisher Scientific፣ UK) ቅጂ ላይ ተለያይተዋል። የRC-L ንዑስ ክፍል ለመጫን እና ለማየት አንድ ጄል በኩማሲ ብሪሊያንት ብሉ (ባዮ-ራድ፣ ዩኬ) ተቀባ። በሁለተኛው ጄል ላይ ያለው ፕሮቲን ለኢሚውኖሳይድ ምርመራ ወደ ሜታኖል-አክቲቭ ፖሊቪኒሊዲን ፍሎራይድ (PVDF) ሽፋን (Thermo Fisher Scientific፣ UK) ተላልፏል። የPVDF ሽፋን በ50 mM tris-HCl (pH 7.6)፣ 150 mM NaCl፣ 0.2% (v / v) Tween-20 እና 5% (w / v) የተወገደ የወተት ዱቄት ውስጥ ታግዷል፣ ከዚያም በፀረ-ሂስ ዋና ፀረ እንግዳ አካል (በ1:1000 A190-114A፣ ቤቲል ላቦራቶሪዎች፣ ዩኤስኤ) ውስጥ በ1:1000 A190-114A፣ ቤቲል ላቦራቶሪዎች፣ ዩኤስኤ) ለ4 ሰዓታት ታግዷል። በፀረ-ሰውነት መከላከያ ቋት ውስጥ ለ3 ጊዜ ለ5 ደቂቃዎች ከታጠበ በኋላ፣ ሽፋኑ ከፈረሰኛ ፔሮክሲዳሴ (ሲግማ-አልድሪች፣ ዩኬ) ፀረ-አይጥ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ-ሰው (በፀረ-ሰውነት መከላከያ ቋት ውስጥ 1:10,000 የተቀላቀለ) ጋር ተጣምሯል። ዌስትአር ኢታ ሲ 2.0 ኬሚሉሚኒሰንስ ንጣፍ (ሲያናገን፣ ጣሊያን) እና አመርሻም ኢሜገር 600 (GE Healthcare፣ UK) በመጠቀም ለመለየት (በፀረ-ሰውነት መከላከያ ቋት ውስጥ 3 ጊዜ ከታጠበ በኋላ 5 ደቂቃዎች) እንዲፈጠር ያድርግ።
የእያንዳንዱን የተቀባ ጄል ወይም የኢሚውኖአሳይ ሌይን የጥንካሬ ስርጭት በመሳል፣ ከጫፍ በታች ያለውን ቦታ በማዋሃድ እና የRC-L (የተቀባ ጄል) እና የፕሮቲን-W (ኢሚውኖአሳይ) የጥንካሬ ጥምርታ በማስላት፣ በImageJ (57) ውስጥ ምስሉን ያካሂዱ። እነዚህ ሬሾዎች በንጹህ RC-LH114-W ናሙና ውስጥ የRC-L ወደ ፕሮቲን-W ጥምርታ 1:1 እንደሆነ በማሰብ እና አጠቃላይ የውሂብ ስብስቡን በዚሁ መሠረት መደበኛ በማድረግ ወደ ሞላር ሬሾዎች ተቀይረዋል።
ለዚህ ጽሑፍ ተጨማሪ ቁሳቁሶችን ለማግኘት እባክዎ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ን ይመልከቱ።
ይህ በCreative Commons Attribution License ውሎች መሠረት የሚሰራጭ ክፍት መዳረሻ ያለው ጽሑፍ ነው። ጽሑፉ የመጀመሪያው ሥራ በአግባቡ ከተጠቀሰ በኋላ በማንኛውም ሚዲያ ላይ ያልተገደበ አጠቃቀም፣ ስርጭት እና ማባዛት ይፈቅዳል።
ማሳሰቢያ፡ የኢሜይል አድራሻዎን እንዲያቀርቡ የምንጠይቅዎት እርስዎ ለገጹ የሚመክሩት ሰው ኢሜይሉን እንዲያዩት እንደሚፈልጉ እና አይፈለጌ መልዕክት እንዳልሆነ እንዲያውቅ ብቻ ነው። ምንም አይነት የኢሜይል አድራሻዎችን አንይዝም።
ይህ ጥያቄ ጎብኚ መሆንዎን ለመፈተሽ እና በራስ-ሰር የአይፈለጌ መልዕክት ማስገባትን ለመከላከል ይጠቅማል።
ዴቪድ ጄኬ ስዋዊንስበሪ፣ ፓርክ ኪያን፣ ፊሊፕ ጄ. ጃክሰን፣ ኬትሊን ኤም. ፋሪስ፣ ዳሪየስ ኤም. ኒድዝዊድዝኪ፣ ኤልዛቤት ሲ. ማርቲን፣ ዴቪድ ኤ. ፋርመር፣ ሎርና ኤ. ማሎን፣ ርብቃ ኤፍ. ቶምፕሰን፣ ኒል ኤ. ራንሰን፣ ዳንኤል ፒ ካኒፌ፣ ማርክ ጄ. ዲክማን፣ ዴዊ ሆልተን፣ ክሪስቲን ኪርማይየር፣ አንድሪው ሂችኮክ፣ ሲ. ኒል ሀንተር
በምላሽ ማዕከል ውስጥ ያለው የብርሃን ወጥመድ 1 ውስብስብ ከፍተኛ ጥራት ያለው መዋቅር ስለ ኩዊኖን ተለዋዋጭነት አዲስ ግንዛቤዎችን ይሰጣል።
ዴቪድ ጄኬ ስዋዊንስበሪ፣ ፓርክ ኪያን፣ ፊሊፕ ጄ. ጃክሰን፣ ኬትሊን ኤም. ፋሪስ፣ ዳሪየስ ኤም. ኒድዝዊድዝኪ፣ ኤልዛቤት ሲ. ማርቲን፣ ዴቪድ ኤ. ፋርመር፣ ሎርና ኤ. ማሎን፣ ርብቃ ኤፍ. ቶምፕሰን፣ ኒል ኤ. ራንሰን፣ ዳንኤል ፒ ካኒፌ፣ ማርክ ጄ. ዲክማን፣ ዴዊ ሆልተን፣ ክሪስቲን ኪርማይየር፣ አንድሪው ሂችኮክ፣ ሲ. ኒል ሀንተር
በምላሽ ማዕከል ውስጥ ያለው የብርሃን ወጥመድ 1 ውስብስብ ከፍተኛ ጥራት ያለው መዋቅር ስለ ኩዊኖን ተለዋዋጭነት አዲስ ግንዛቤዎችን ይሰጣል።
©2021 የአሜሪካ የሳይንስ እድገት ማህበር። ሁሉም መብቶች የተጠበቁ ናቸው. AAAS የHINARI፣ AGORA፣ OARE፣ CHORUS፣ CLOCKSS፣ CrossRef እና COUNTER አጋር ነው። ScienceAdvances ISSN 2375-2548.