የአሁኑ * የአሁኑ አድራሻ፡ ኮሎኝ 50931፣ ጀርመን፣ ኮሎኝ ኤክሰኬሽን ክላስተር እርጅናን በተመለከተ በሴሉላር ውጥረት ምላሽ ላይ የተደረገ ጥናት (CECAD)።
የማይቶኮንድሪያል በሽታዎች የነርቭ መዛባት የማይቀለበስ እንደሆነ ይቆጠራል ምክንያቱም የነርቭ ሴሎች የሜታቦሊክ ፕላስቲክነት ውስን ነው፣ ነገር ግን የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር በሰውነት ውስጥ ባለው የነርቭ ሜታቦሊዝም ሴል ራስን በራስ የማስተዳደር ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በደንብ አልተረዳም። እዚህ፣ በተስተጓጎለ የማይቶኮንድሪያል ፉዥን ዳይናሚክስ ምክንያት የሚመጣውን ተራማጅ OXPHOS እጥረት ያለበትን የፐርኪንጄ ነርቮች ሴል-ተኮር ፕሮቲን እናስተዋውቃለን። የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር በፕሮቲዮሚክስ መስክ ላይ ጥልቅ ለውጥ እንዳስከተለ ደርሰንበታል፣ ይህም በመጨረሻ ከሴል ሞት በፊት ትክክለኛ የሜታቦሊክ ፕሮግራሞችን በተከታታይ ማግበር አስከትሏል። ባልተጠበቀ ሁኔታ፣ የፒሩቫት ካርቦክሲላዝ (PCx) እና የቲሲኤ ዑደት መካከለኛ ክፍሎችን የሚያሟሉ ሌሎች ፀረ-እርጅና ኢንዛይሞችን ግልጽ የሆነ መነሳሳት ወሰንን። የፒሲክስን የተባባሰ ኦክሲዴቲቭ ውጥረት እና የነርቭ መዛባት መከልከል፣ ይህም አተሮስክለሮሲስ ኦክስፎስ በሌላቸው የነርቭ ሴሎች ላይ የመከላከያ ውጤት እንዳለው ያሳያል። በማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ፉዥን መመለስ እነዚህን የሜታቦሊክ ባህሪያት ሙሉ በሙሉ ይለውጣል፣ በዚህም የሴል ሞትን ይከላከላል። ግኝቶቻችን ቀደም ሲል ያልታወቁ መንገዶችን ለማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር የመቋቋም አቅም የሚሰጡ እና የነርቭ መዛባት በበሽታው የመጨረሻ ደረጃዎች እንኳን ሊቀለበስ እንደሚችል ያሳያሉ።
ሚቶኮንድሪያ የነርቭ ኃይል ሜታቦሊዝምን ለመጠበቅ ያለው ማዕከላዊ ሚና ከሰው ሚቶኮንድሪያል በሽታዎች ጋር በተያያዙ ሰፊ የነርቭ ምልክቶች አፅንዖት ይሰጣል። አብዛኛዎቹ እነዚህ በሽታዎች የሚከሰቱት በማይቶኮንድሪያል ጂን አገላለጽን የሚቆጣጠሩ (1፣ 2) ወይም ከማይቶኮንድሪያል ዲኤንኤ (mtDNA) መረጋጋት ጋር በተዘዋዋሪ የሚነኩ የጂን ጥፋትን በሚቆጣጠሩ የጂን ሚውቴሽን ነው (3፣ 4)። በእንስሳት ሞዴሎች ላይ የተደረገው ጥናት እንደሚያሳየው በአካባቢው ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ለሚከሰት የማይቶኮንድሪያል ችግር ምላሽ፣ ወግ አጥባቂ የሜታቦሊክ መንገዶች (5-7) ሊነቃቁ ይችላሉ፣ ይህም የእነዚህ ውስብስብ በሽታዎች መንስኤነት በጥልቀት ለመረዳት አስፈላጊ መረጃ ይሰጣል። በግልጽ በተቃራኒው፣ የአንጎል ሚቶኮንድሪያል አዴኖሲን ትሪፎስፌት (ATP) ምርት አጠቃላይ ውድቀት ምክንያት የሚከሰቱ የተወሰኑ የሴል ዓይነቶችን የሜታቦሊክ ለውጦች መረዳታችን መሠረታዊ ነው (8)፣ በሽታን ለመከላከል ወይም ለመከላከል ጥቅም ላይ ሊውሉ የሚችሉ የሕክምና ኢላማዎችን መለየት አስፈላጊ መሆኑን አፅንዖት ይሰጣል። የነርቭ ሴሎችን መከላከል (9)። የመረጃ እጥረት የነርቭ ሴሎች ከአካባቢው ሕብረ ሕዋሳት የሴል ዓይነቶች ጋር ሲነፃፀሩ በጣም የተገደበ የሜታቦሊክ ተለዋዋጭነት እንዳላቸው በሰፊው ይታሰባል (10)። እነዚህ ሴሎች የሲናፕቲክ ስርጭትን ለማበረታታት እና ለጉዳት እና ለበሽታ ሁኔታዎች ምላሽ ለመስጠት የሜታቦላይት አቅርቦትን ወደ ኒውሮኖች በማስተባበር ረገድ ማዕከላዊ ሚና የሚጫወቱ በመሆናቸው፣ የሴል ሜታቦሊዝምን ከአንጎል ቲሹ ፈታኝ ሁኔታዎች ጋር የማስማማት ችሎታ በግሊያል ሴሎች ብቻ የተወሰነ ነው (11-14)። በተጨማሪም፣ የአንጎል ቲሹ ውስጣዊ የሴል ልዩነት በተወሰኑ የነርቭ ንዑስ ቡድኖች ውስጥ የሚከሰቱ የሜታቦሊክ ለውጦችን ጥናት በእጅጉ ያደናቅፋል። በዚህም ምክንያት፣ በነርቭ ሴሎች ውስጥ ስለሚከሰቱት የማይቶኮንድሪያል መዛባት ትክክለኛ የሴሉላር እና የሜታቦሊክ ውጤቶች ብዙም የሚታወቅ ነገር የለም።
የማይቶኮንድሪያል ዲርሞሽን ሜታቦሊክ ውጤቶችን ለመረዳት፣ በማይቶኮንድሪያል ውጫዊ ሽፋን ፊውዥን (Mfn2) መጥፋት ምክንያት በተለያዩ የነርቭ ሴል ደረጃዎች ውስጥ የፐርኪንጄ ነርቮችን (PNs) ለይተናል። በሰዎች ላይ የሚደረጉ የMfn2 ሚውቴሽን ቻርኮት-ማሪ-ጥርስ አይነት 2A (15) በመባል ከሚታወቀው በዘር የሚተላለፍ የሞተር የስሜት ህዋሳት ነርቮች አይነት ጋር የተቆራኙ ቢሆኑም፣ በአይጦች ውስጥ የMfn2 ሁኔታዊ ጥፋት በደንብ የሚታወቅ የኦክሳይድ ኢንዳክሽን ፎስፎሪሌሽን (OXPHOS) የአካል ጉዳተኝነት ዘዴ ነው። የተለያዩ የነርቭ ሴል ዓይነቶች (16-19) እና የተገኘው የነርቭ ሴል ፊኖታይፕ እንደ የእንቅስቃሴ መዛባት (18፣ 19) ወይም ሴሬቤላር አታክሲያ (16) ካሉ ተራማጅ የነርቭ ምልክቶች ጋር አብረው ይመጣሉ። ከመለያ-ነጻ የቁጥር (LFQ) ፕሮቲዮሚክስ፣ ሜታቦሎሚክስ፣ ኢሜጂንግ እና ቫይሮሎጂካል ዘዴዎች ጥምረት በመጠቀም፣ ተራማጅ ኒውሮዴጄኔሽን ፒሩቫት ካርቦክሲላዝ (PCx) እና ሌሎች በቪቮ ውስጥ በፒኤንኤዎች አርቴሪዮስክለሮሲስ ውስጥ የተሳተፉትን የኢንዛይሞች አገላለጽ በከፍተኛ ሁኔታ እንደሚያመጣ እናሳያለን። የዚህን ግኝት አስፈላጊነት ለማረጋገጥ፣ በMfn2 ጉድለት ባላቸው PNዎች ውስጥ የPCx አገላለጽን በተለይ ቀንሰናል፣ እና ይህ ቀዶ ጥገና የኦክሳይድ ውጥረትን እንዳባባሰ እና የነርቭ ህዋሳትን እንዳፋጠነ ደርሰንበታል፣ በዚህም አዞስፐርሚያ የሕዋስ ሞትን የሜታቦሊክ መላመድን እንደሚሰጥ አረጋግጧል። ከባድ የMFN2 አገላለጽ ከባድ የOXPHOS እጥረት፣ ከፍተኛ የ mitochondrial ዲኤንኤ ፍጆታ እና የተሰበረ የማይቶኮንድሪያል ኔትወርክ ያለበትን የመጨረሻ መበላሸት PN ሙሉ በሙሉ ሊያድን ይችላል፣ ይህም ይህ የነርቭ ህዋሳት አይነት ከሴል ሞት በፊት በበሽታው ከፍተኛ ደረጃ ላይ እንኳን ማገገም እንደሚችል የበለጠ አፅንዖት ይሰጣል።
በMfn2 knockout PNs ውስጥ ያለውን ሚቶኮንድሪያን በዓይነ ሕሊናችን ለማየት፣ ክሬ-ጥገኛ ሚቶኮንድሪያን ቢጫ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (YFP) (mtYFP) እንዲያነጣጥር የሚያስችል የአይጥ ዝርያ ተጠቅመናል (20) የክሬን አገላለጽ እና በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን በቪቮ አፈትሸነዋል። በPNs ውስጥ ያለው የMfn2 ጂን መጥፋት ወደ ሚቶኮንድሪያል ኔትወርክ ቀስ በቀስ መከፋፈል እንደሚያመራ ደርሰንበታል (ምስል S1A)፣ እና የመጀመሪያው ለውጥ የተገኘው በ3 ሳምንታት ዕድሜ ላይ ነው። በተቃራኒው፣ የካልቢንዲን ኢሚውኖስቴይንግን በማጣት እንደታየው የPN ሴል ንብርብር ከፍተኛ መበስበስ እስከ 12 ሳምንታት ዕድሜ ድረስ አልጀመረም (ምስል 1፣ A እና B)። በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ የመጀመሪያዎቹ ለውጦች እና በሚታየው የነርቭ ሞት መጀመሪያ መካከል ያለው የጊዜ አለመመጣጠን ከሴል ሞት በፊት በሚቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ምክንያት የሚከሰቱ የሜታቦሊክ ለውጦችን እንድንመረምር አነሳስቶናል። የYFP (YFP+)-PNን የሚገልጽ (ምስል 1C) እና በቁጥጥር አይጦች (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre) ውስጥ ለመለየት በፍሎረሰንስ-የተነቃ የሴል መደርደር (FACS) ላይ የተመሠረተ ስትራቴጂ አዘጋጅተናል፣ ከዚህ በኋላ CTRL ተብሎ ይጠራል (ምስል S1B)። የGET ስትራቴጂውን በYFP ምልክት አንጻራዊ ጥንካሬ ላይ በመመስረት ማመቻቸት የYFP+ አካል (YFPhigh) ከPN ላልሆኑ (YFPneg) (ምስል S1B) ወይም ተተኪ ፍሎረሰንት አክሰን/ዴንድሪቲክ ቁርጥራጮች (YFPlow፤ ምስል S1D፣ ግራ) ለማጽዳት ያስችለናል፣ በኮንፎካል ማይክሮስኮፕ የተረጋገጠ (ምስል S1D፣ ቀኝ)። የተመደቡትን ህዝብ ማንነት ለማረጋገጥ፣ የLFQ ፕሮቲዮሚክስ እና ከዚያም ዋና የክፍል ትንተና አካሂደናል፣ እና በYFPhigh እና YFPneg ሴሎች መካከል ግልጽ የሆነ መለያየት እንዳለ አግኝተናል (ምስል S1C)። ከፍተኛ የYFP ሴሎች የታወቁ የPNs ማርከሮችን (ማለትም Calb1፣ Pcp2፣ Grid2 እና Itpr3) የተጣራ ማበልጸግ አሳይተዋል (21፣ 22)፣ ነገር ግን በነርቮች ወይም በሌሎች የሴል ዓይነቶች ውስጥ በተለምዶ የሚገለጹ ፕሮቲኖችን ማበልጸግ አልታየም (ምስል 1D)። በገለልተኛ ሙከራዎች ውስጥ የተሰበሰቡ በተመደቡ የYFP ከፍተኛ ሴሎች ውስጥ ባሉ ናሙናዎች መካከል የተደረገ ንፅፅር በባዮሎጂካል ድግግሞሽ መካከል ጥሩ የመራባት ችሎታን ያሳያል (ምስል S1E)። ባጭሩ፣ እነዚህ መረጃዎች ሊቻል የሚችል PN አጣዳፊ እና ልዩ ለይቶ የማውጣት እቅዳችንን አረጋግጠዋል። ጥቅም ላይ የዋለው የL7-cre አሽከርካሪ ስርዓት ከወሊድ በኋላ በመጀመሪያው ሳምንት ውስጥ ሞዛይክ ዳግም ውህደትን ስለሚያመጣ (23)፣ አይጦችን ከ CTRL እና ሁኔታዊ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) መቁረጥ ጀመርን። የነርቭ ሴሎችን መሰብሰብ። ዳግም ውህደት ከተጠናቀቀ በኋላ፣ በ4 ሳምንታት ዕድሜ ላይ Mfn2cKO ይባላል። እንደ መጨረሻ ነጥብ፣ ግልጽ የሆነ የማይቶኮንድሪያል ክፍፍል ቢኖርም የፒኤን ንብርብር ሳይበላሽ የቆየበትን የ8 ሳምንታት እድሜ መርጠናል (ምስል 1ቢ እና ምስል S1A)። በአጠቃላይ፣ በአጠቃላይ 3013 ፕሮቲኖችን ለካን፣ ከእነዚህም ውስጥ 22% የሚሆኑት እንደ ሚቶኮንድሪያል ፕሮቲኦም (ምስል 1ኢ) (ምስል 1ኢ) (ምስል 1ኢ) (24) ላይ ተመስርተው በሚቶካርታ 2.0 ማብራሪያዎች ላይ የተመሰረቱ ናቸው። በሳምንት 8 የተደረገው የልዩነት ጂን አገላለጽ ትንተና እንደሚያሳየው ከሁሉም ፕሮቲኖች ውስጥ 10.5% የሚሆኑት ብቻ ጉልህ ለውጦች እንዳሳዩ (ምስል 1ኤፍ እና ምስል S1ኤፍ)፣ ከእነዚህም ውስጥ 195 ፕሮቲኖች ዝቅ ተደርገዋል እና 120 ፕሮቲኖች ከፍ ተደርገዋል (ምስል 1ኤፍ)። የዚህ የውሂብ ስብስብ “ፈጠራ ያለው የመንገድ ትንተና” እንደሚያሳየው የተለያዩ የተገለጹ ጂኖች በዋናነት ከተገደቡ የተወሰኑ የሜታቦሊክ መንገዶች ስብስብ ውስጥ መሆናቸውን ልብ ሊባል ይገባል (ምስል 1ጂ)። የሚገርመው ነገር፣ ከኦክስፎስ እና ከካልሲየም ሲግናሊንግ ጋር የተያያዙ መንገዶች መቀነስ በፉዥን እጥረት ባለባቸው የፒኤንኤዎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር መፈጠርን የሚያረጋግጥ ቢሆንም፣ በዋናነት የአሚኖ አሲድ ሜታቦሊዝምን የሚያካትቱ ሌሎች ምድቦች በከፍተኛ ሁኔታ የተሻሻሉ ናቸው፣ ይህም በማይቶኮንድሪያል ፒኤንኤዎች ውስጥ ከሚከሰተው ሜታቦሊዝም ጋር የሚስማማ ነው። እንደገና ማዋሃድ ወጥነት ያለው ነው። አለመሳካት።
(ሀ) የ CTRL እና Mfn2cKO አይጦች የሴሬቤል ክፍሎች ተወካይ ኮንፎካል ፎቶግራፎች (ካልቢንዲን፣ ግራጫ)፤ ኒውክሊየሶች በDAPI ተቃርነዋል። (ለ) የ (A) መጠን (የልዩነት አንድ-መንገድ ትንተና፣ ***P<0.001፤ n = ከሶስት አይጦች ከ4 እስከ 6 ክበቦች)። (ሐ) የሙከራ የስራ ፍሰት። (መ) ለፑርኪንጄ (ከላይ) እና ለሌሎች የሴል ዓይነቶች (መካከለኛ) የተወሰኑ ማርከሮች የሙቀት ካርታ ስርጭት። (ሠ) በተመደበው PN ውስጥ የተለዩትን የማይቶኮንድሪያል ፕሮቲኖች ብዛት የሚያሳይ የቬን ዲያግራም። (ረ) በ8 ሳምንታት ውስጥ በMfn2cKO ነርቮች ውስጥ የተለያየ የተገለጹ ፕሮቲኖች የእሳተ ገሞራ ሴራ (የ1.3 ትርጉም የመቁረጥ እሴት)። (ሰ) የፈጠራ መንገድ ትንተና በMfn2cKO PN ውስጥ ያሉትን አምስት በጣም አስፈላጊ የሆኑ የከፍታ ቁጥጥር (ቀይ) እና የታች ቁጥጥር (ሰማያዊ) መንገዶችን በ8 ሳምንታት ይመደባል። የእያንዳንዱ የተገኘ ፕሮቲን አማካይ የመግለጫ ደረጃ ይታያል። የግራጫ ሚዛን የሙቀት ካርታ፡ የተስተካከለ የP እሴት። ns፣ አስፈላጊ አይደለም።
የፕሮቲዮሚክስ መረጃዎች እንደሚያሳዩት የውህደቶች I፣ III እና IV የፕሮቲን አገላለጽ ቀስ በቀስ እየቀነሰ ነው። ውህደቶች I፣ III እና IV ሁሉም አስፈላጊ የሆኑ mtDNA-encoded subunitsን የያዙ ሲሆኑ፣ ውህደቱ II፣ በኑክሌር-ኮድ ብቻ የተቀመጠ፣ በመሠረቱ ምንም ተጽእኖ አልነበረውም (ምስል 2A እና ምስል S2A)። ከፕሮቲዮሚክስ ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የሴሬቤላር ቲሹ ክፍሎች ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ በPN ውስጥ ያለው ውስብስብ IV MTCO1 (ሚቶኮንድሪያል ሳይቶክሮም C ኦክሳይድ ንዑስ 1) ንዑስ ክፍል ደረጃ ቀስ በቀስ እየቀነሰ መሆኑን አሳይቷል (ምስል 2B)። mtDNA-encoded subunit Mtatp8 በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል S2A)፣ የኑክሌር-encoded ATP synthase ንዑስ ክፍል ደግሞ የተረጋጋ ሁኔታ ደረጃ ሳይለወጥ ቆይቷል፣ ይህም የmtDNA አገላለጽ ሲረጋጋ ከሚታወቀው የተረጋጋ ATP synthase ንዑስ ስብስብ F1 ውስብስብ ጋር የሚስማማ ነው። ምስረታው ወጥ ነው። ማቋረጥ (7)። በተደረደረው Mfn2cKO PNs ውስጥ በእውነተኛ ጊዜ ፖሊመሬዝ ሰንሰለት ምላሽ (qPCR) የ mtDNA ደረጃ ግምገማ የ mtDNA ቅጂ ቁጥር ቀስ በቀስ መቀነስን አረጋግጧል። ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር፣ በ8 ሳምንታት ዕድሜ ላይ፣ ከ mtDNA ደረጃ 20% የሚሆነው ብቻ ተጠብቆ ቆይቷል (ምስል 2C)። ከእነዚህ ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የ Mfn2cKO PNs ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ስቴይን ዲኤንኤ ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል፣ ይህም የማይቶኮንድሪያል ኑክሊዮታይዶችን በጊዜ ላይ የተመሰረተ ፍጆታ ያሳያል (ምስል 2D)። በማይቶኮንድሪያል ፕሮቲን መበላሸት እና በጭንቀት ምላሽ ውስጥ የተሳተፉ አንዳንድ እጩዎች ብቻ Lonp1፣ Afg3l2 እና Clpx እና OXPHOS ውስብስብ የመሰብሰቢያ ሁኔታዎችን ጨምሮ ተሻሽለዋል። በአፖፕቶሲስ ውስጥ በተሳተፉት ፕሮቲኖች ደረጃዎች ላይ ምንም ጉልህ ለውጦች አልተገኙም (ምስል S2B)። በተመሳሳይ፣ በካልሲየም ትራንስፖርት ውስጥ የተሳተፉት ሚቶኮንድሪያል እና የኢንዶፕላስሚክ ሬቲኩለም ቻናሎች ጥቃቅን ለውጦች ብቻ እንዳሏቸው ደርሰንበታል (ምስል S2C)። በተጨማሪም፣ ከራስ-ሰርፋጂ ጋር የተያያዙ ፕሮቲኖች ግምገማ ምንም አይነት ጉልህ ለውጦችን አላገኘም፣ ይህም በኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ እና በኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (ምስል S3) ውስጥ ከሚታየው አውቶፋጎሶሞች የሚታየውን ኢንዳክሽን ጋር የሚጣጣም ነው። ሆኖም፣ በPNs ውስጥ ያለው ተራማጅ OXPHOS ችግር ግልጽ ከሆኑ የአልትራሳውንድ ሚቶኮንድሪያል ለውጦች ጋር አብሮ ይመጣል። የሚቶኮንድሪያል ክላስተሮች በ5 እና 8 ሳምንታት ዕድሜ ላይ ባሉ የMfn2cKO PNs የሴል አካላት እና ዴንድሪቲክ ዛፎች ውስጥ ሊታዩ ይችላሉ፣ እና የውስጠኛው ሽፋን መዋቅር ጥልቅ ለውጦች ተደርገዋል (ምስል S4፣ A እና B)። ከእነዚህ የአልትራሳውንድ ለውጦች እና በmtDNA ውስጥ ጉልህ የሆነ ቅነሳ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ በቴትራሜቲልሮዳሚን ሜቲል ኤስተር (TMRM) አማካኝነት አጣዳፊ የአንጎል ሴሬቤላር ቁርጥራጮች ትንተና በMfn2cKO PNs ውስጥ ያለው የማይቶኮንድሪያል ሽፋን አቅም በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል S4C)።
(ሀ) የOXPHOS ውስብስብ አገላለጽ ደረጃ የጊዜ ኮርስ ትንተና። በ8 ሳምንታት ውስጥ P<0.05 ያላቸውን ፕሮቲኖች ብቻ ያስቡበት (ባለሁለት አቅጣጫ ANOVA)። የነጥብ መስመር፡ ከCTRL ጋር ሲነጻጸር ምንም ማስተካከያ የለም። (ለ) ግራ፡ በፀረ-MTCO1 ፀረ እንግዳ አካል (የልኬት አሞሌ፣ 20 μm) የተሰየመ የሴሬቤል ክፍል ምሳሌ። በፑርኪንጄ የሴል አካላት የተያዘው ቦታ በቢጫ ተሸፍኗል። ቀኝ፡ የMTCO1 ደረጃዎች ብዛት (የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና፤ n = ከሶስት አይጦች የተተነተኑ ከ7 እስከ 20 ሴሎች)። (ሐ) በተደረደረው PN ውስጥ የmtDNA ቅጂ ቁጥር qPCR ትንተና (የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና፤ n = 3 እስከ 7 አይጦች)። (መ) ግራ፡ በፀረ-ዲኤንኤ ፀረ እንግዳ አካል የተሰየመ የሴሬቤል ቁራጭ ምሳሌ (የልኬት አሞሌ፣ 20 μm)። በፑርኪንጄ የሴል አካላት የተያዘው ቦታ በቢጫ ተሸፍኗል። ቀኝ፡ የmtDNA ቁስሎች ብዛት (የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና፤ n = ከሶስት አይጦች ከ5 እስከ 9 ሴሎች)። (ሠ) በሙሉ ሕዋስ ፓች ክላምፕ ቀረጻ ውስጥ mitoYFP + Purkinje ሴሎችን (ቀስት) የሚያሳይ አጣዳፊ የሴሬቤል ክፍል ምሳሌ። (ረ) የIV ኩርባ ቁጥራዊነት። (ጂ) በCTRL እና Mfn2cKO Purkinje ሴሎች ውስጥ የዴፖላራይዜሽን የአሁኑ መርፌ ተወካይ ቀረጻዎች። የላይኛው ዱካ፡ APን ያስነሳው የመጀመሪያው ምት። የታችኛው ዱካ፡ ከፍተኛ የAP ድግግሞሽ። (ሸ) የድህረ-ሲናፕቲክ ድንገተኛ ግብዓቶች (sPSPs) መጠን። የተወካይ ቀረጻ ዱካ እና የማጉላት ጥምርታው በ (I) ውስጥ ይታያሉ። የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና የተተነተነው n = 5 እስከ 20 ሴሎች ከሶስት አይጦች። መረጃው እንደ አማካኝ ±SEM ይገለጻል፤ *P<0.05፤ **P<0.01፤ ***P<0.001። (ጄ) የተበሳጨውን የፓች ክላምፕ ሁነታ በመጠቀም የተመዘገቡ ድንገተኛ AP ተወካይ ዱካዎች። የላይኛው ዱካ፡ ከፍተኛ የAP ድግግሞሽ። የታችኛው ዱካ፡ የአንድ AP ማጉላት። (ኬ) በ (J) መሠረት አማካይ እና ከፍተኛውን የAP ድግግሞሽ መጠን ይለካ። የማን-ዊትኒ ሙከራ፤ n = 5 ሴሎች ከአራት አይጦች ተተነተኑ። መረጃው እንደ አማካይ ± SEM ይገለጻል፤ አስፈላጊ አይደለም።
በ8-ሳምንት ዕድሜ ባለው Mfn2cKO PN ላይ ግልጽ የሆነ የOXPHOS ጉዳት ተገኝቷል፣ ይህም የነርቭ ሴሎች የፊዚዮሎጂ ተግባር በጣም ያልተለመደ መሆኑን ያሳያል። ስለዚህ፣ በ4 እስከ 5 ሳምንታት እና በ7 እስከ 8 ሳምንታት ውስጥ የOXPHOS እጥረት ያለባቸው የነርቭ ሴሎች ተገብሮ የኤሌክትሪክ ባህሪያትን በአጣዳፊ ሴሬቤላር ቁርጥራጮች ውስጥ ሙሉ-ሴል ፓች ክላምፕ ቀረጻዎችን በማከናወን ተንትነናል (ምስል 2E)። ባልተጠበቀ ሁኔታ፣ የMfn2cKO የነርቭ ሴሎች አማካይ የእረፍት ሽፋን አቅም እና የግቤት መቋቋም ከቁጥጥሩ ጋር ተመሳሳይ ነበሩ፣ ምንም እንኳን በሴሎች መካከል ጥቃቅን ልዩነቶች ቢኖሩም (ሠንጠረዥ 1)። በተመሳሳይ፣ በ4 እስከ 5 ሳምንታት ዕድሜ፣ በአሁኑ-ቮልቴጅ ግንኙነት (IV ኩርባ) ላይ ምንም ጉልህ ለውጦች አልተገኙም (ምስል 2F)። ሆኖም፣ በዚህ የመጨረሻ ደረጃ ላይ ለሃይፐርፖላራይዜሽን አቅም ግልጽ የሆነ ስሜታዊነት እንዳለ የሚያሳይ ምንም የMfn2cKO የነርቭ ሴሎች ከIV regimen (hyperpolarization step) በሕይወት አልፈዋል፣ ይህም በዚህ የመጨረሻ ደረጃ ላይ ለሃይፐርፖላራይዜሽን አቅም ግልጽ የሆነ ስሜታዊነት እንዳለ ያሳያል። በአንፃሩ፣ በMfn2cKO ነርቮች ውስጥ፣ ተደጋጋሚ የድርጊት አቅም (AP) ፈሳሾችን የሚያስከትሉት ዲፖላራይዚንግ ጅረቶች በደንብ ይታገሳሉ፣ ይህም አጠቃላይ የመልቀቂያ ዘይቤዎቻቸው ከ8-ሳምንት የቁጥጥር ነርቮች በእጅጉ የተለዩ እንዳልሆኑ ያሳያል (ሠንጠረዥ 1 እና ምስል 2ጂ)። በተመሳሳይ፣ የድንገተኛ ፖስትሲናፕቲክ ጅረቶች (sPSCs) ድግግሞሽ እና ስፋት ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ተመሳሳይ ነበሩ፣ እና የክስተቶች ድግግሞሽ ከ4 ሳምንታት ወደ 5 ሳምንታት እስከ 7 ሳምንታት እስከ 8 ሳምንታት በተመሳሳይ ጭማሪ ጨምሯል (ምስል 2፣ H እና I)። በPNs ውስጥ የሲናፕቲክ ብስለት ጊዜ (25)። ከተበሳጩ PNs ጥገናዎች በኋላ ተመሳሳይ ውጤቶች ተገኝተዋል። ይህ ውቅር በሙሉ-ሴል ፓች ክላምፕ ቀረጻ ላይ እንደሚከሰት ሁሉ የሴሉላር ATP ጉድለቶችን ማካካስ ይከላከላል። በተለይም፣ የማረፊያ ሽፋን አቅም እና የMfn2cKO ነርቮች ድንገተኛ የመተኮስ ድግግሞሽ አልተነኩም (ምስል 2፣ J እና K)። ባጭሩ፣ እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት ግልጽ የሆነ የኦክስፎስ ችግር ያለባቸው PNዎች ከፍተኛ ድግግሞሽ ያላቸውን የመልቀቂያ ቅጦችን በጥሩ ሁኔታ መቋቋም ይችላሉ፣ ይህም መደበኛ የሆነ የኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ምላሾችን እንዲጠብቁ የሚያስችል የማካካሻ ዘዴ እንዳለ ያሳያል።
መረጃዎቹ እንደ አማካኝ ± SEM (የልዩነት አንድ-መንገድ ትንተና፣ የሆልም-ሲዳክ ባለብዙ ንፅፅር ሙከራ፤ *P<0.05) ይገለፃሉ። የአሃዱ ቁጥር በቅንፍ ይገለጻል።
በፕሮቲዮሚክስ የውሂብ ስብስብ ውስጥ ያለ ማንኛውም ምድብ (ምስል 1ጂ) ከባድ የኦክስፎስ እጥረትን የሚከላከሉ መንገዶችን ያካተተ መሆኑን ለመመርመር ወሰንን፣ በዚህም የተጎዳው PN ለምን ወደ መደበኛ ሁኔታ የሚጠጋ ኤሌክትሮፊዚዮሎጂን ሊይዝ እንደሚችል አስረድተናል (ምስል 2፣ E እስከ K)። የፕሮቲዮሚክስ ትንተና እንደሚያሳየው በቅርንጫፍ ሰንሰለት አሚኖ አሲዶች (BCAA) ካታቦሊዝም ውስጥ የተሳተፉት ኢንዛይሞች በከፍተኛ ሁኔታ ቁጥጥር የተደረገባቸው መሆናቸውን (ምስል 3A እና ምስል S5A) እና የመጨረሻው ምርት አሲቲል-ኮአ (CoA) ወይም ሱቺኒል ኮአ በአርትራይዮስክለሮሲስ አሲድ (TCA) ዑደት ውስጥ ያሉትን ትሪካርቦክሲሌቶች ሊያሟሉ ይችላሉ። የBCAA ትራንስአሚኔዝ 1 (BCAT1) እና BCAT2 ይዘት ሁለቱም እንደጨመሩ ደርሰንበታል። ከα-ኬቶግሉታሬት (26) ግሉታሜትን በማመንጨት የBCAA ካታቦሊዝምን የመጀመሪያ ደረጃ ያነቃቃሉ። የቅርንጫፉን ሰንሰለት ኬቶ አሲድ ዴሃይድሮጂኔዝ (BCKD) ውስብስብ የሚያዋቅሩት ሁሉም ንዑስ ክፍሎች ተሻሽለዋል (ውስብስቡ የሚመጣውን የBCAA ካርቦን አፅም ቀጣይ እና የማይቀለበስ ዲካርቦክሲሌሽን ያነቃቃል) (ምስል 3A እና ምስል S5A)። ሆኖም፣ በተደረደረው PN ውስጥ በBCAA ራሱ ላይ ምንም ግልጽ ለውጦች አልተገኙም፣ ይህም ሊሆን የሚችለው የእነዚህ አስፈላጊ አሚኖ አሲዶች የሴሉላር ቅበላ መጨመር ወይም የTCA ዑደትን ለማሟላት ሌሎች ምንጮችን (ግሉኮስ ወይም ላቲክ አሲድ) መጠቀም ምክንያት ሊሆን ይችላል (ምስል S5B)። OXPHOS የሌላቸው PNዎች በ8 ሳምንታት ዕድሜ ላይ የግሉታሚን መበስበስ እና የትራንስአሚኔሽን እንቅስቃሴዎችን አሳይተዋል፣ ይህም በማይቶኮንድሪያል ኢንዛይሞች ግሉታሚኔዝ (GLS) እና በግሉታሚን ፒሩቫት ትራንስአሚኔዝ 2 (GPT2) መጨመር ሊንጸባረቅ ይችላል (ምስል 3፣ A እና C)። የጂኤልኤስ (GLS) ቁጥጥር መጨመር በተሰነጣጠለው ኢሶፎርም ግሉታሚኔዝ ሲ (GLS-GAC) ብቻ የተወሰነ መሆኑን ልብ ሊባል ይገባል (የMfn2cKO/CTRL ለውጥ በግምት 4.5 እጥፍ ነው፣ P = 0.05)፣ እና በካንሰር ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ያለው ልዩ መሻሻል ማይቶኮንድሪያል ባዮኢነርጂን ሊደግፍ ይችላል። (27)።
(ሀ) የሙቀት ካርታው በ8 ሳምንታት ውስጥ ለተጠቀሰው መንገድ የፕሮቲን መጠን የመታጠፍ ለውጥን ያሳያል። (ለ) በፀረ-ፒሲክስ ፀረ እንግዳ አካል (ሚዛን ባር፣ 20 μm) የተሰየመ የሴሬቤላር ቁራጭ ምሳሌ። ቢጫ ቀስቱ ወደ ፐርኪንጄ ሴል አካል ያመለክታል። (ሐ) ለአተሮስክለሮሲስ አስፈላጊ እጩ እንደሆነ የተገለጸ የጊዜ ኮርስ የፕሮቲን አገላለጽ ትንተና (ብዙ ቲ-ሙከራ፣ *FDR <5%፤ n = 3-5 አይጦች)። (መ) ከላይ፡ በ[1-13C]ፒሩቫት መከታተያ ውስጥ የተካተተውን የተሰየመውን ካርቦን (ማለትም፣ በPDH ወይም በትራንስ-አርቴሪያል መንገድ) ውስጥ የተካተተውን የተሰየመውን ካርቦን ለማስገባት የተለያዩ መንገዶችን የሚያሳይ ንድፍ ዲያግራም። ከታች፡ የቫዮሊን ገበታ አጣዳፊ የሴሬቤላር ቁርጥራጮችን በ[1-13C]ፒሩቫት (የተጣመሩ ቲ-ሙከራ፤ ** P <0.01) ከለዩ በኋላ ወደ አስፓርቲክ አሲድ፣ ሲትሪክ አሲድ እና ማሊክ አሲድ የተቀየረውን ነጠላ-መለያ ያለው ካርቦን (M1) መቶኛ ያሳያል። (ሠ) የተጠቆመውን መንገድ አጠቃላይ የጊዜ ታሪክ ትንተና። በ8 ሳምንታት ውስጥ P<0.05 ያላቸውን ፕሮቲኖች ብቻ ያስቡበት። የተሰረዘ መስመር፡ የማስተካከያ እሴት የለም (የሁለትዮሽ ልዩነት ትንተና፤ * P <0.05፤ *** P <0.001)። መረጃው እንደ አማካኝ ± SEM ይገለጻል።
በኛ ትንተና፣ የBCAA ካታቦሊዝም ከዋና ዋና የቁጥጥር መንገዶች አንዱ ሆኗል። ይህ እውነታ በቲሲኤ ዑደት ውስጥ የሚገባው የአየር ዝውውር መጠን OXPHOS በሌለበት PN ውስጥ ሊለወጥ እንደሚችል አጥብቆ ይጠቁማል። ይህ የነርቭ ሜታቦሊዝም እንደገና ማዋሃድ ዋና አይነት ሊሆን ይችላል፣ ይህም ከባድ የ OXPHOS ችግርን በመጠበቅ ወቅት በነርቭ ፊዚዮሎጂ እና በሕይወት መትረፍ ላይ ቀጥተኛ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። ከዚህ መላምት ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ዋናው ፀረ-ኤትሮስክለሮቲክ ኢንዛይም PCx የተሻሻለ መሆኑን ደርሰንበታል (Mfn2cKO/CTRL በግምት 1.5 ጊዜ ይለወጣል፤ ምስል 3A)፣ ይህም የፒሩቬት ወደ ኦክሳሎአሴቴት (28) መለወጥን ያነሳሳል፣ ይህም በአንጎል ቲሹ ውስጥ እንዳለ ይታመናል። በ ውስጥ ያለው አገላለጽ ለአስትሮሳይቶች ብቻ የተወሰነ ነው (29፣ 30)። ከፕሮቲዮሚክስ ውጤቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ኮንፎካል ማይክሮስኮፒ እንደሚያሳየው የPCx አገላለጽ በተለይ እና በከፍተኛ ሁኔታ በ OXPHOS ጉድለት ባላቸው PNዎች ውስጥ ጨምሯል፣ የ PCx ምላሽ ግን በዋናነት በመቆጣጠሪያው አቅራቢያ ባሉ የበርግማን ግሊያል ሴሎች ብቻ የተወሰነ ነው (ምስል 3B)። የታየውን የPCx መጨመር በተግባራዊነት ለመፈተሽ፣ አጣዳፊ የሴሬቤላር ቁርጥራጮችን በ[1-13C]ፒሩቫት መከታተያ አከምን። ፒሩቫት በፒሩቫት ዴሃይድሮጂኔዝ (PDH) ኦክሳይድ ሲደረግበት፣ የኢሶቶፕ መለያው ጠፋ፣ ነገር ግን ፒሩቫት በቫስኩላር ግብረመልሶች ሜታቦሊዝም ሲደረግ በTCA ዑደት መካከለኛ ክፍሎች ውስጥ ይካተታል (ምስል 3D)። የፕሮቲዮሚክስ መረጃችንን ለመደገፍ፣ ከዚህ መከታተያ በMfn2cKO ቁርጥራጮች አስፓርቲክ አሲድ ውስጥ ብዙ ማርከሮችን ተመልክተናል፣ ሲትሪክ አሲድ እና ማሊክ አሲድ ደግሞ መጠነኛ አዝማሚያ ነበራቸው፣ ምንም እንኳን ጉልህ ባይሆኑም (ምስል 3D)።
በሚቶፓርክ አይጦች ውስጥ በተለይም በሚቶኮንድሪያል ትራንስክሪፕሽን ፋክተር ኤ ጂን (Tfam) (ምስል S6B) ላይ በሚከሰቱ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ችግር ባለባቸው የዶፓሚን ነርቮች ውስጥ፣ የፒሲክስ አገላለጽ በከፍተኛ ሁኔታ ተሻሽሏል (31)፣ ይህም የአሴቶን አሲድ አርቴሪዮስክለሮሲስ በሽታ መኖሩን ያመለክታል። የበሽታው መከሰት በሰውነት ውስጥ የነርቭ ኦክስፎስ ችግር በሚፈጠርበት ጊዜ ቁጥጥር ይደረግበታል። ከአርቲሪዮስክለሮሲስ ጋር ሊዛመዱ በሚችሉ የነርቭ ሴሎች ውስጥ ሊገለጹ የሚችሉ ልዩ ኢንዛይሞች (32-34) እንደ ፕሮፒዮኒል-ኮአ ካርቦክሲላዝ (PCC-A) ባሉ በኦክስፎስ እጥረት ውስጥ ባሉ PNዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ቁጥጥር እንደሚደረግባቸው ልብ ሊባል የሚገባው ሲሆን ማሎኒል-ኮአ ፕሮፒዮኒል-ኮአን ወደ ሱቺኒል-ኮአ እና ሚቶኮንድሪያል ማሊክ ኢንዛይም 3 (ME3) ይለውጣል፣ ዋና ሚናቸውም ከማሌት ፒሩቬትን መልሶ ማግኘት ነው (ምስል 3፣ ኤ እና ሲ) (33፣ 35)። በተጨማሪም፣ Pdk3 ኢንዛይም ውስጥ ጉልህ የሆነ ጭማሪ አግኝተናል፣ ይህም PDHን የሚያነቃቃ እና በዚህም የሚያግደው (36) ሲሆን፣ PDHን ወይም PDH ኢንዛይም ውስብስብን በራሱ የሚያንቀሳቅሰው Pdp1 ኢንዛይም ውስጥ ምንም አይነት ለውጥ አልተገኘም (ምስል 3A)። በተከታታይ፣ በ Mern2cKO PNs ውስጥ፣ በ Ser293 ውስጥ ባለው የPDH ውስብስብ የፒሩቫት ዴሃይድሮጂንሴዝ E1 ክፍል ውስጥ ያለው የα1 ንዑስ ክፍል α (PDHE1α) ንዑስ ክፍል ፎስፈረስሌሽን ተሻሽሏል (ምስል S6C) (ምስል S6C)። ፒሩቫት የደም ሥር መዳረሻ የለውም።
በመጨረሻም፣ የሴሪን እና የግሊሲን ባዮሲንተሲስ ሱፐር pathway፣ ተዛማጅ ሚቶኮንድሪያል ፎሌት (1C) ዑደት እና የፕሮሊን ባዮሲንተሲስ (ምስል 1G እና ምስል S5C) በሪፖርቶች መሠረት በማግበር ሂደት ውስጥ ሁሉም በከፍተኛ ሁኔታ ቁጥጥር ይደረግባቸዋል። በዙሪያው ያሉት ሕብረ ሕዋሳት በማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር (5-7) ይንቀሳቀሳሉ። እነዚህን የፕሮቲዮሚክስ መረጃዎች የሚደግፍ የኮንፎካል ትንተና እንደሚያሳየው በPN ውስጥ OXPHOS በሌለባቸው የ8 ሳምንት አይጦች ሴሬቤላር ቁርጥራጮች ለሴሪን ሃይድሮክሲሜቲል ትራንስፈራዝ 2 (SHMT2) ተገዝተዋል፣ ይህም የማይቶኮንድሪያል ፎሌት ዑደት ቁልፍ ኢንዛይም ነው። ጉልህ የሆነ የበሽታ መከላከያ ምላሽ (ምስል S5D)። በ13 CU-ግሉኮስ-ኢንኩቤድድ አጣዳፊ ሴሬቤላር ቁርጥራጮች፣ የሜታቦሊክ መከታተያ ሙከራዎች የሴሪን እና የፕሮሊን ባዮሲንተሲስን መጨመርን የበለጠ አረጋግጠዋል፣ ይህም የካርቦን ኢሶፎርሞች ወደ ሴሪን እና ፕሮሊን ፍሰት እንደጨመረ ያሳያል (ምስል S5E)። በGLS እና GPT2 የሚቀርቡት ግብረመልሶች ከግሉታሚን የግሉታሚን ውህደት እና በግሉታሚን እና በα-ኬቶግሉታሬት መካከል ያለውን ሽግግር ስለሚያደርጉ፣ የእነሱ መጨመር የOXPHOS እጥረት ያለባቸው የነርቭ ሴሎች የግሉታሚን ፍላጎት መጨመር እንዳላቸው ያሳያል። ይህ የፕሮሊንን ባዮሲንተሲስ መጨመርን ለመጠበቅ ያለመ ሊሆን ይችላል (ምስል S5C)። ከእነዚህ ለውጦች በተቃራኒ፣ ከPN-specific Mfn2cKO አይጦች የተገኙ የሴሬቤላር አስትሮሳይቶች ፕሮቲዮሚክ ትንተና እንደሚያሳየው እነዚህ መንገዶች (ሁሉንም ፀረ-ፔሮክሲዳሴዎችን ጨምሮ) በአገላለጽ ረገድ በከፍተኛ ሁኔታ እንዳልተለወጡ አሳይቷል፣ ስለዚህ ይህ የሜታቦሊክ አቅጣጫ መቀየር ለተበላሸ PN (ምስል S6፣ D ወደ G) የሚመረጥ መሆኑን ያሳያል።
ባጭሩ፣ እነዚህ ትንታኔዎች በPNs ውስጥ የተወሰኑ የሜታቦሊክ መንገዶችን የጊዜያዊ ማነቃቂያ በእጅጉ የተለያዩ ቅጦችን አሳይተዋል። ምንም እንኳን ያልተለመደ የነርቭ ማይቶኮንድሪያል ተግባር ወደ መጀመሪያው የአተሮስክለሮሲስ እና የ1C ዳግም ማደስ (ምስል 3E እና ምስል S5C) ሊያመራ ቢችልም፣ በ I እና IV ውህዶች አገላለጽ ላይ ሊተነበዩ የሚችሉ ለውጦች እንኳን ቢኖሩም፣ በሴሪን ዴ ኖቮ ውህደት ውስጥ ያሉት ለውጦች በመጨረሻዎቹ ደረጃዎች ላይ ብቻ ግልጽ ሆነዋል። የኦክስፎስ ችግር (ምስል 3E እና ምስል S5C)። እነዚህ ግኝቶች ውጥረት የፈጠረው ሚቶኮንድሪያል (1C ዑደት) እና ሳይቶፕላዝሚክ (ሴሪን ባዮሲንተሲስ) የነርቭ ሜታቦሊዝምን እንደገና ለመቅረጽ በቲሲኤ ዑደት ውስጥ ካለው የአተሮስክለሮሲስ መጨመር ጋር በመተባበር ምላሽ የሚሰጡበትን ቅደም ተከተል ሂደት ይገልጻሉ።
የ8 ሳምንት እድሜ ያላቸው የኦክስፎስ እጥረት ያለባቸው PNዎች ከፍተኛ ድግግሞሽ ያለው የማነቃቂያ እንቅስቃሴን ጠብቀው የሚቶኮንድሪያል ችግርን ለማካካስ ከፍተኛ የሆነ የሜታቦሊክ ዳግም መገናኘት ይችላሉ። ይህ ግኝት በአሁኑ ጊዜም ቢሆን እነዚህ ሴሎች የነርቭ ሥርዓትን ለማዘግየት ወይም ለመከላከል የሕክምና ጣልቃ ገብነት ሊያገኙ እንደሚችሉ አስደሳች እድል ይፈጥራል። ዘግይቷል። ይህንን እድል በሁለት ገለልተኛ ጣልቃ ገብነቶች ፈትነናል። በመጀመሪያው ዘዴ፣ MFN2 በOXPHOS ጉድለት ባለባቸው PNዎች ውስጥ በምርጫ እንዲገለጽ የCre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector ነድፈናል (ምስል S7A)። የAAV ኮድ MFN2 እና የፍሎረሰንት ሪፖርተር ጂን mCherry (Mfn2-AAV) በዋና ዋና የነርቭ ባህሎች በብልቃጥ ውስጥ ተረጋግጠዋል፣ ይህም MFN2 በCre-dependent መንገድ እንዲገለጽ እና የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን አድኗል፣ በዚህም በMfn2cKO ነርቮች ውስጥ የነርቭ ለውጥ እንዳይከሰት ይከላከላል (ምስል S7፣ B፣ D እና E)። በመቀጠልም፣ የ8 ሳምንት እድሜ ያላቸውን Mfn2-AAV ወደ Mfn2cKO ሴሬቤላር ኮርቴክስ በስቴሪዮታክቲክ ለማድረስ እና አይጦችን ለመቆጣጠር በቪቮ ሙከራዎችን አድርገናል፣ እና የ12 ሳምንት እድሜ ያላቸውን አይጦች ተንትነናል (ምስል 4A)። የታከሙት Mfn2cKO አይጦች ሞተዋል (ምስል 1፣ A እና B) (16)። በቪቮ ውስጥ የቫይረስ ትራንስዱክሽን በአንዳንድ ሴሬቤላር ክቦች ውስጥ የPN መራጭ አገላለጽ አስከትሏል (ምስል S7፣ G እና H)። mCherry (Ctrl-AAV) ብቻ የሚገልጸው የቁጥጥር AAV መርፌ በMfn2cKO እንስሳት ላይ ባለው የነርቭ ሴል ደረጃ ላይ ምንም አይነት ጉልህ ተጽእኖ አላሳደረም። በተቃራኒው፣ በMfn2-AAV የተተላለፉት Mfn2cKOዎች ትንተና የPN ሴል ንብርብር ጉልህ የሆነ የመከላከያ ውጤት አሳይቷል (ምስል 4፣ B እና C)። በተለይም የነርቭ ጥግግት ከቁጥጥር እንስሳት ፈጽሞ የማይለይ ይመስላል (ምስል 4፣ B እና C፣ እና ምስል S7፣ H እና I)። የMFN1 አገላለጽ ግን የMFN2 አይደለም የሚለው አገላለጽ የነርቭ ሞትን ለማዳን እኩል ውጤታማ ነው (ምስል 4C እና ምስል S7፣ C እና F)፣ ይህም የኢክቶፒክ MFN1 አገላለጽ የMFN2 እጥረትን በብቃት ሊያሟላ እንደሚችል ያሳያል። በነጠላ PN ደረጃ ላይ ተጨማሪ ትንታኔ እንደሚያሳየው Mfn2-AAV የ mitochondriaን እጅግ በጣም አወቃቀሩን በእጅጉ አድኗል፣ የmtDNA ደረጃዎችን መደበኛ አድርጓል፣ እና የፀረ-አንጂዮጄኔሲስ ምልክት PCx ​​ከፍተኛ አገላለጽን ገልብጧል (ምስል 4፣ C ወደ E)። በእረፍት ሁኔታ ውስጥ የተረፉት የMfn2cKO አይጦች የእይታ ምርመራ የአቀማመጣቸው እና የሞተር ምልክቶቻቸው (የ S1 ወደ S3 እንቅስቃሴ) ተሻሽለዋል። በማጠቃለያ፣ እነዚህ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የMFN2 ወደ PNs እንደገና መምራት በOXPHOS ውስጥ በጣም ጉድለት ያለበት የ mtDNA ፍጆታን ለመቀልበስ እና አተሮስክለሮሲስን ለማነሳሳት በቂ ነው፣ በዚህም የአክሰን መበላሸት እና የነርቭ ሞት በ vivo ውስጥ ይከላከላል።
(ሀ) የተጠቆመው የሜታቦሊክ መንገድ ሲነቃ የ AAV ኢንኮዲንግ MFN2 መርፌ የሙከራ መርሃ ግብርን የሚያሳይ እቅድ። (ለ) በ8 ሳምንታት ውስጥ በMfn2cKO አይጦች ውስጥ የተቀየሩ እና በፀረ-ካልቢንዲን ፀረ እንግዳ አካል የተሰየሙ የ12 ሳምንት እድሜ ያላቸው የሴሬቤል ቁርጥራጮች ተወካይ ኮንፎካል ምስሎች። ቀኝ፡ የአክሰን ፋይበር መጠን። የአክሰን ዙም ሚዛን 450 እና 75 μm ነው። (ሐ) ግራ፡ በ AAV ትራንስዱክሽን ሉፕ (AAV+) ውስጥ የፐርኪንጄ ሴል ጥግግት መጠን (የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና፤ n = 3 አይጦች)። ቀኝ፡ በሳምንት 12 በተቀየረው PN ውስጥ የ mtDNA የትኩረት ትንተና (ያልተጣመረ የቲ-ሙከራ፤ n = 6 ሴሎች ከሶስት አይጦች)። * P <0.05፤ ** P <0.01። (መ) በተጠቆሙት የቫይረስ ቬክተሮች የተቀየሱ የ Mfn2cKO ሴሬቤል ክፍሎች PNዎች ተወካይ ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮግራፎች። ሮዝ ጭምብሉ በዴንድሪትስ የተያዘውን ቦታ ያሳያል፣ እና ቢጫ ነጠብጣብ ያለው ካሬ በቀኝ በኩል የተሰጠውን ማጉላት ያሳያል፤ n ኒውክሊየስን ይወክላል። የስኬል ባር፣ 1μm። (E) በ12 ሳምንታት ውስጥ በፒኤን ውስጥ የPCx ቀለም መቀባትን የሚያሳይ ምሳሌ ያሳያል። የስኬል ባር፣ 20μm. OE፣ ከመጠን በላይ መገለጽ፤ FC፣ የመታጠፍ ለውጥ።
በመጨረሻም፣ የOXPHOS ችግር ባጋጠማቸው PNs ውስጥ በፔሮክሲዳዝ ምክንያት የሚመጣውን የሴል ህልውና አስፈላጊነት መርምረናል። በተለይ የመዳፊት PCx mRNA (AAV-shPCx) ኢላማ ያደረገ mCherry ኮድ AAV-shRNA (አጭር የፀጉር ፒን RNA) ፈጥረናል፣ እና ቫይረሱን ወይም የተዘበራረቀ መቆጣጠሪያውን (AAV-scr) ወደ Mfn2cKO አይጦች ሴሬቤልየም ውስጥ ወስደናል። መርፌው የተከናወነው በአራተኛው ሳምንት ዕድሜ ላይ ነው (ምስል 5A)፣ የPCx አገላለጽ እየጨመረ በሄደበት (ምስል 3C) እና የPN ሴል ንብርብር አሁንም ሳይበላሽ በነበረበት ወቅት ውጤታማ የPCx ንኪኪ ለማድረግ ነው (ምስል 1A)። PCxን መዝረፍ (ምስል S8A) ለPN ሞት ከፍተኛ ፍጥነት እንደሚያስከትል ልብ ሊባል ይገባል፣ ይህም በተበከለው ቀለበት ብቻ የተወሰነ ነው (ምስል 5፣ B እና C)። በPCx መጨመር ምክንያት የሚፈጠረውን የሜታቦሊክ ተጽእኖ ዘዴ ለመረዳት፣ የPCx knockdown እና AAV-mediated optical ባዮሴንሰር Grx1-roGFP2 በአንድ ጊዜ ከተገለጹ በኋላ የPNs የሬዶክስ ሁኔታን አጥንተናል (ምስል S8፣ B እስከ D)። የፔፕታይድ ሬዶክስ አቅም አንጻራዊ ለውጥ (38)። ከዚያም፣ የFLIM ሁኔታዎችን ካረጋገጡ በኋላ በሳይቶፕላዝሚክ ሬዶክስ ሁኔታ ላይ ሊከሰቱ የሚችሉ ለውጦችን ለመለየት በ7-ሳምንት ዕድሜ ላይ ባሉ Mfn2cKO ወይም በመቆጣጠሪያ ባልደረቦች አጣዳፊ የአንጎል ቁርጥራጮች ላይ ባለ ሁለት-ፎቶን ፍሎረሰንስ የህይወት ዘመን ምስል ማይክሮስኮፒ (FLIM) አድርገናል (ምስል S8፣ E እስከ G)። ትንታኔው ከቁጥጥር ነርቮች ወይም ከተጨናነቀ shrRNA የሚገልጸው Mfn2cKO PNs የተለየ የሆነ ነጠላ Mfn2cKO PNs የኦክሳይድ ሁኔታ ላይ ከፍተኛ ጭማሪ አሳይቷል (ምስል 5፣ D እና E)። የፒሲክስ አገላለጽ ሲቀንስ፣ በከፍተኛ ሁኔታ ኦክሳይድ የተደረገበትን ሁኔታ የሚያሳዩት የMfn2cKO PNs መቶኛ ከሶስት እጥፍ በላይ ጨምሯል (ምስል 5E)፣ ይህም የፒሲክስ መጨመር የተበላሹ የነርቭ ሴሎችን የሬዶክስ አቅም እንደጠበቀ ያሳያል።
(ሀ) የተጠቆመው የሜታቦሊክ መንገድ ሲነቃ የ AAV ኮድ shPCxን ለመወጋት የሙከራ መርሃ ግብር የሚያሳይ እቅድ። (ለ) በ4 ሳምንታት ውስጥ በፀረ-ካልሲኔሪን ፀረ እንግዳ አካል የተወሰዱ እና በMfn2cKO አይጦች ውስጥ የ8 ሳምንት እድሜ ያላቸው ሴሬቤላር ክፍሎች ተወካይ ኮንፎካል ፎቶግራፎች። የመለኪያ አሞሌ፣ 450μm። (ሐ) በ AAV የተቀየሩ ሉፖች ውስጥ የፐርኪንጄ ሴል ጥግግት መጠን (የልዩነት አንድ አቅጣጫ ትንተና፤ n = 3 እስከ 4 አይጦች)። መረጃው እንደ አማካኝ ±SEM ይገለጻል፤ ***P<0.001። (መ) የተወካይ FLIM ስዕል የ7 ሳምንት እድሜ ያለው PN የግሉታቲዮን ሬዶክስ ዳሳሽ Grx1-roGFP2ን የሚገልጽ አማካይ የህይወት ዘመን ያሳያል በተገለጹት የሙከራ ሁኔታዎች ስር። LUT (የፍለጋ ሰንጠረዥ) ጥምርታ፡ የመትረፍ የጊዜ ክፍተት (በፒኮሰኮንዶች)። የመለኪያ አሞሌ፣ 25μm። (ሠ) ሂስቶግራም የGrx1-roGFP2 የህይወት ዘመን እሴቶችን በእያንዳንዱ ሁኔታ ስር በሁለት አይጦች ውስጥ ከ (D) (n=158 እስከ 368 ሴሎች) ስርጭት ያሳያል። ከእያንዳንዱ ሂስቶግራም በላይ ያለው የፓይ ገበታ፡ በCTRL-AAV-scr ውስጥ ካለው አማካይ የህይወት ዘመን እሴት 1 SD የሚበልጥ በጣም ረጅም (ቀይ፣ ኦክሳይድ የተደረገበት) ወይም አጭር (ሰማያዊ፣ የተቀነሰ) የህይወት ዘመን እሴቶች ያላቸውን የሕዋሶች ብዛት ያሳያል። (ረ) የቀረበው ሞዴል የነርቭ ሴሎች ፒሲክስን ከፍ ማድረግ የመከላከያ ውጤት ያሳያል።
በአጠቃላይ፣ እዚህ የምናቀርበው መረጃ እንደሚያሳየው የMFN2 እንደገና መገለጽ ከባድ የኦክስፎስ እጥረት፣ ከባድ የmtDNA መሟጠጥ እና እጅግ በጣም ያልተለመደ የኢስታ-መሰል ሞርፎሎጂ ያለበትን የላቀ PN ሙሉ በሙሉ ማዳን እንደሚችል ያሳያል፣ በዚህም በተራቀቁ በሽታዎች ውስጥም ቢሆን ቀጣይነት ያለው እድገት ይሰጣል። የነርቭ መበላሸት ከሴል ሞት በፊት ያለውን ደረጃ የሚቀለበስ ማስረጃ ይሰጣል። ይህ የሜታቦሊክ ተለዋዋጭነት ደረጃ የነርቭ ሴሎች አተሮስክለሮሲስን (የቲሲኤ ዑደት እንደገና ማያያዝ) በማነሳሳት ችሎታ የበለጠ አፅንዖት ተሰጥቶታል፣ ይህም ኦክስፎስ በሌሉባቸው PNዎች ውስጥ የፒሲክስ አገላለጽን የሚገታ እና የሕዋስ ሞትን የሚያባብስ ሲሆን በዚህም የመከላከያ ሚና ይጫወታል (ምስል 5F)።
በዚህ ጥናት፣ የPNs ለOXPHOS ችግር የሚሰጠው ምላሽ ቀስ በቀስ ወደ TCA ዑደት አተሮስክለሮሲስ መቀላቀል መሆኑን የሚያሳይ ማስረጃ አቅርበናል፤ ይህም በሜታቦሊክ ፕሮግራሞች በሚነቃው ልዩነት የማግበር መንገድ በኩል ነው። የፕሮቲዮሚክ ትንተናን በብዙ ተጓዳኝ ዘዴዎች አረጋግጠናል፤ በከባድ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ሲፈተኑ፣ የነርቭ ሴሎች ቀደም ሲል የማይታወቅ የሜታቦሊክ ቅልጥፍና ቅርፅ እንዳላቸው ገልጸናል። የሚገርመው ነገር፣ አጠቃላይ የሪዊሪንግ ሂደት ቀስ በቀስ እና በማይቀለበስ መልኩ የነርቭ ህዋሳትን የሚያጅበውን የመጨረሻ ሜታቦሊክ ሁኔታ ምልክት ባያደርግም፣ መረጃዎቻችን እንደሚያሳዩት ከሴል ሞት በፊት ባለው ደረጃ ላይ እንኳን የጥገና ነርቭ ሊሆን ይችላል። ተግባራዊ የማካካሻ ዘዴ። ይህ ግኝት የነርቭ ሴሎች በሰውነት ውስጥ ከፍተኛ የሆነ የሜታቦሊክ ፕላስቲክነት እንዳላቸው ያሳያል። ይህ እውነታ በኋላ ላይ የMFN2 እንደገና መፈጠር ቁልፍ የሜታቦሊክ ማርከሮችን አገላለጽ ሊቀለበስ እና የPN መበስበስን ሊከላከል ይችላል። በተቃራኒው፣ አተሮስክለሮሲስን ይከላከላል እና ነርቮችን ያፋጥናል። ትራንስሴክሹዋል.
በጥናታችን ውስጥ ካሉት በጣም አስደናቂ ግኝቶች አንዱ OXPHOS የሌላቸው PNs በተለይ አርቴሪዮስክለሮሲስን የሚያነቃቁ ኢንዛይሞችን በማሻሻል የቲሲኤ ዑደት ሜታቦሊዝምን ሊቀይሩ ይችላሉ። ሜታቦሊክ ዳግም ማዋቀር የካንሰር ሴሎች የተለመደ ባህሪ ሲሆን አንዳንዶቹ በግሉታሚን ላይ የተመሰረቱት የቲሲኤ ዑደት መካከለኛዎችን በመደመር የቲሲኤ ዑደት መካከለኛዎችን በመደመር ሲሆን ይህም የመተንፈሻ ሰንሰለቱን የሚያንቀሳቅሱ እና የሊፒድ እና የኑክሊዮታይድ ባዮሲንተሲስ ቅድመ-ዝግጅትዎችን ማምረት ይቀጥላሉ (39፣ 40)። የቅርብ ጊዜ ጥናት እንደሚያሳየው የኦክስፎስ ችግር ባለባቸው የዳር ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የግሉታሚን/ግሉታሜት ሜታቦሊዝም እንደገና መገናኘትም ጉልህ ገጽታ ነው (5፣ 41)፣ የግሉታሚን ወደ TCA ዑደት የሚገባው አቅጣጫ በOXPHOS ጉዳት ክብደት ምክንያት ይወሰናል (41)። ሆኖም፣ በሰውነት ውስጥ ስላለው የነርቭ ሜታቦሊዝም ፕላስቲክነት ተመሳሳይነት እና በበሽታው አውድ ውስጥ ሊኖር ስለሚችል ጠቀሜታ ግልጽ ማስረጃ የለም። በቅርቡ በተደረገ በብልቃጥ ውስጥ በተደረገ ጥናት፣ ዋና ዋና ኮርቲካል ነርቮች ለኒውሮትራንስሚሽን የግሉታሚን ገንዳዎችን እንደሚያንቀሳቅሱ ታይቷል፣ በዚህም በሜታቦሊክ ውጥረት ሁኔታዎች ውስጥ ኦክሲዴቲቭ ሜታቦሊዝምን እና አተሮስክለሮሲስን ያበረታታሉ (42)። የቲሲኤ ዑደት ኢንዛይም ሱቺኔት ዴሃይድሮጂኔዝ ፋርማኮሎጂካል እገዳ ስር ፒሩቫት ካርቦክሲሌሽን በተለማመዱ ሴሬቤላር ግራኑል ነርቮች ውስጥ የኦክሳሎአሴቴት ውህደትን እንደሚጠብቅ ይታመናል (34)። ሆኖም ግን፣ የእነዚህ ዘዴዎች ለአእምሮ ሕብረ ሕዋስ (አተሮስክለሮሲስ በዋናነት በአስትሮሳይቶች ብቻ የተወሰነ እንደሆነ የሚታመንበት) የፊዚዮሎጂ ጠቀሜታ አሁንም አስፈላጊ የፊዚዮሎጂ ጠቀሜታ አለው (43)። በዚህ ሁኔታ፣ መረጃችን እንደሚያሳየው በሰውነት ውስጥ በኦክስፎስ የተጎዱ PNዎች ወደ BCAA መበላሸት እና ፒሩቫት ካርቦክሲሌሽን ሊቀየሩ ይችላሉ፣ እነዚህም የቲሲኤ ገንዳ መካከለኛዎች ተጨማሪ ሁለት ዋና ዋና ምንጮች ናቸው። የቢሲኤኤ ካታቦሊዝም ለነርቭ ኢነርጂ ሜታቦሊዝም ያለው አተገባበር ለኒውሮናል ኢነርጂ ሜታቦሊዝም ቢቀርብም፣ ከግሉታሜት እና GABA ለኒውሮትራንስሚሽን ሚና በተጨማሪ (44)፣ ለእነዚህ ዘዴዎች በ vivo ውስጥ ምንም ማስረጃ የለም። ስለዚህ፣ ያልተስተካከሉ PNዎች አተሮስክለሮሲስን በመጨመር በመዋሃድ ሂደት የሚመሩትን የቲሲኤ መካከለኛዎች ፍጆታ በራስ-ሰር ማካካስ እንደሚችሉ መገመት ቀላል ነው። በተለይም፣ የፒሲክስ መጨመር የአስፓርቲክ አሲድ ፍላጎትን ለመጠበቅ ሊያስፈልግ ይችላል፣ ይህም በማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ባለባቸው ሴሎች ውስጥ የተጠቆመ ነው (45)። ሆኖም፣ የሜታቦሎሚክስ ትንታኔያችን በMfn2cKO PNs ውስጥ ባለው የአስፓርቲክ አሲድ የተረጋጋ ሁኔታ ደረጃ ላይ ምንም አይነት ጉልህ ለውጦችን አላሳየም (ምስል S6A)፣ ይህም ምናልባት በሚባዙ ሴሎች እና በድህረ-ሚቶቲክ ነርቮች መካከል ያለውን የአስፓርቲክ አሲድ የተለያዩ ሜታቦሊዝም አጠቃቀምን የሚያንፀባርቅ ነው። ምንም እንኳን በ vivo ውስጥ በተዳከሙ የነርቭ ሴሎች ውስጥ የፒሲክስ መጨመር ትክክለኛ ዘዴ አሁንም ተለይቶ ቢታወቅም፣ ይህ ያለጊዜው ምላሽ የነርቭ ሴሎችን የሬዶክስ ሁኔታ በመጠበቅ ረገድ ትልቅ ሚና እንደሚጫወት አሳይተናል፣ ይህም በሴሬቤላር ቁርጥራጮች ላይ በFLIM ሙከራዎች ታይቷል። በተለይም፣ PNs ን ከማስተካከል መከላከል የበለጠ ኦክሳይድ ያለበት ሁኔታ ሊያስከትል እና የሕዋስ ሞትን ሊያፋጥን ይችላል። የBCAA መበላሸት ማግበር እና የፒሩቫቴ ካርቦክሲሌሽን የ mitochondrial ዲስኦርደር ቲሹዎችን ለመለየት መንገዶች አይደሉም (7)። ስለዚህ፣ ለኒውሮዴጄኔሬሽን አስፈላጊ የሆነው ብቸኛው ባህሪ ባይሆንም እንኳ የOXPHOS ጉድለት ያላቸው የነርቭ ሴሎች ቅድሚያ የሚሰጣቸው ባህሪያት ይመስላሉ። .
የሴሬቤላር በሽታ የተለያዩ የነርቭ ሴሎችን የሚያጠቃ በሽታ ሲሆን ብዙውን ጊዜ እንደ አታክሲያ ሆኖ የሚገለጥ እና ብዙውን ጊዜ የ PN ዎችን የሚጎዳ ነው (46)። ይህ የነርቭ ሴሎች በተለይ ለማይቶኮንድሪያል ችግር ተጋላጭ ናቸው ምክንያቱም በአይጦች ላይ ያላቸው የመራጭ መበላሸት የሰውን ስፒኖሴሬቤላር አታክሲያ የሚገልጹትን ብዙ የሞተር ምልክቶችን ለማባዛት በቂ ስለሆነ (16፣ 47፣ 48)። እንደ ሪፖርቶች ገለጻ፣ የሚውቴሽን ጂን ያለው ትራንስጀኒክ የአይጥ ሞዴል ከሰው ስፒኖሴሬቤላር አታክሲያ ጋር የተቆራኘ ሲሆን የማይቶኮንድሪያል ችግር አለው (49፣ 50)፣ ይህም በፒኤንኤች ውስጥ የኦክስፎስ እጥረት መዘዝን ማጥናት አስፈላጊ መሆኑን አፅንዖት ይሰጣል። ስለዚህ፣ ይህንን ልዩ የነርቭ ሴሎች በብቃት ለይቶ ለማጥናት እና ለማጥናት በተለይ ተስማሚ ነው። ሆኖም፣ PNዎች ለግፊት በጣም ስሜታዊ ስለሆኑ እና የጠቅላላው የሴሬቤላር ሴል ህዝብ ዝቅተኛ ድርሻ ስለሚይዙ፣ ለብዙ ኦሚክስ ላይ በተመሰረቱ ጥናቶች፣ እንደ ሙሉ ሴሎች መምረጥ አሁንም ፈታኝ ገጽታ ነው። የሌሎች የሴል ዓይነቶችን (በተለይም የአዋቂዎች ሕብረ ሕዋሳትን) ሙሉ በሙሉ የብክለት እጥረት ማግኘት ፈጽሞ የማይቻል ቢሆንም፣ ውጤታማ የሆነ የመከፋፈል ደረጃን ከFACS ጋር አጣምረን ለታችኛው የፕሮቲዮሚክስ ትንተና በቂ ቁጥር ያላቸውን ሕያው የነርቭ ሴሎች ለማግኘት እና ከጠቅላላው ሴሬቤልየም ካለው የውሂብ ስብስብ ጋር ሲነፃፀር በጣም ከፍተኛ የፕሮቲን ሽፋን (ወደ 3000 የሚጠጉ ፕሮቲኖች) አለን (51)። የሙሉ ሴሎችን ህያውነት በመጠበቅ፣ እዚህ የምናቀርበው ዘዴ በማይቶኮንድሪያ ውስጥ ባሉ የሜታቦሊክ መንገዶች ላይ ለውጦችን ለመፈተሽ ብቻ ሳይሆን በሳይቶፕላስሚክ ተጓዳኝ አካላት ላይ የተደረጉ ለውጦችን ለመፈተሽም ያስችለናል፣ ይህም የሴል አይነትን ለማበልጸግ የማይቶኮንድሪያል ሽፋን መለያዎችን መጠቀምን የሚያሟላ ነው። ውስብስብ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ለሚገኘው ሚቶኮንድሪያ ቁጥር አዲሱ ዘዴ (52፣ 53)። የምንገልጸው ዘዴ ከፑርኪንጄ ሴሎች ጥናት ጋር ብቻ የተያያዘ አይደለም፣ ነገር ግን በታመሙ አንጎል ውስጥ ያሉ የሜታቦሊክ ለውጦችን ለመፍታት በማንኛውም ዓይነት ሴል ላይ በቀላሉ ሊተገበር ይችላል፣ ሌሎች የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ሞዴሎችን ጨምሮ።
በመጨረሻም፣ በዚህ የሜታቦሊክ ዳግም ማስተካከያ ሂደት ወቅት የሴሉላር ውጥረትን ቁልፍ ምልክቶች ሙሉ በሙሉ የሚቀይር እና የነርቭ መበላሸትን የሚከላከል የሕክምና መስኮት ለይተናል። ስለዚህ፣ እዚህ የተገለጸውን የሪዋየርንግ ተግባራዊ አንድምታ መረዳት በማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ወቅት የነርቭ ሴሎችን ህያውነት ለመጠበቅ ስለሚቻሉ ሕክምናዎች መሠረታዊ ግንዛቤዎችን ሊሰጥ ይችላል። ይህ መርህ ለሌሎች የነርቭ በሽታዎች ተግባራዊነትን ሙሉ በሙሉ ለማሳየት በሌሎች የአንጎል ሴል ዓይነቶች ውስጥ የኃይል ሜታቦሊዝም ለውጦችን ለመለየት የታለመ የወደፊት ምርምር ያስፈልጋል።
የሚቶፓርክ አይጦች ቀደም ሲል ተገልጸዋል (31)። የሎክስፒ ጎን ያለው የMfn2 ጂኖች ያላቸው የC57BL/6N አይጦች ቀደም ሲል ተገልጸዋል (18) እና ከL7-Cre አይጦች ጋር ተሻግረዋል (23)። የተገኘው ድርብ ሄትሮዚጎስ ዝርያ ከዚያም ለMfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP፤ ​​L7-cre) የፑርኪንጄ-ተኮር የጂን knockouts ለማመንጨት ከሆሞዚጎስ Mfn2loxP/Mfn2loxP አይጦች ጋር ተሻግረዋል። በተጣመሩት ክፍሎች ውስጥ፣ የGt (ROSA26) SorStop-mito-YFP አሌል (stop-mtYFP) በተጨማሪ crossings (20) በኩል አስተዋውቋል። ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች የተከናወኑት በአውሮፓ፣ በብሔራዊ እና በተቋማዊ መመሪያዎች መሠረት ሲሆን በUmwelt እና Verbraucherschutz፣ ሰሜን ራይን-ዌስትፋሊያ፣ ጀርመን በሚገኘው ላንድሳምትፉርናተር ጸድቀዋል። የእንስሳት ሥራም የአውሮፓ የላቦራቶሪ እንስሳት ሳይንስ ማህበራት ፌዴሬሽን መመሪያን ይከተላል።
የነፍሰ ጡርዋን የማህፀን ክፍል ማደንዘዣ ካስከተለ በኋላ የአይጥ ሽል (E13) ተለይቷል። ኮርቴክሱ በሃንስ ሚዛናዊ የጨው መፍትሄ (HBSS) ውስጥ በ10 mM ሄፕስ ተጨምሮ በዱልቤኮ የተሻሻለው ኢግል መካከለኛ ፓፔን (20 U/ml) እና ሳይስቴይን (1 μg/ml) የያዘውን ፓፔን (20 U/ml) እና ሳይስቴይን (1 μg/ml) ተላልፏል። ቲሹውን በDMEM ውስጥ ያፍሉት እና ኢንዛይማቲክ መፈጨት በማድረግ ይለዩት። Ml) በ37°ሴ ለ20 ደቂቃዎች፣ ከዚያም በሜካኒካል መንገድ በDMEM ውስጥ በ10% የፅንስ የከብት ሴረም ተጨምሮ በፖሊሊሲን በተሸፈኑ የመስታወት ሽፋኖች ላይ ወይም በ6 ሴ.ሜ የባህል ምግብ 2 × 106 ጥግግት ወይም በ0.5 × 105 ሴሎች/ሴሜ2 ጥግግት ለምስል ትንተና ተዘርግቷል። ከ4 ሰዓታት በኋላ መካከለኛው ክፍል 1% B27 ማሟያ እና 0.5 mM GlutaMax በያዘ ኒውሮባሳል ሴረም-ነጻ መካከለኛ ተተክቷል። የነርቭ ሴሎች በሙከራው በሙሉ በ37°ሴ እና 5% CO2 ተጠብቀው በሳምንት አንድ ጊዜ ተመግበዋል። በብልቃጥ ውስጥ እንደገና ውህደትን ለማነሳሳት፣ በሁለተኛው ቀን በብልቃጥ ውስጥ የነርቭ ሴሎችን ለማከም የሚከተለው የAAV9 ቫይረስ ቬክተር 3μl (24-ዌል ባህል ዲሽ) ወይም 0.5μl (24-ዌል ሳህን) ጥቅም ላይ ውሏል፡ AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Adgene፣ የካታሎግ ቁጥር 105530-AAV9) እና AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Adgene፣ የካታሎግ ቁጥር 105545-AAV9)።
የመዳፊት Mfn1 እና Mfn2 ተጓዳኝ ዲ ኤን ኤ (ከAdgene ፕላዝሚድ #23212 እና #23213 በቅደም ተከተል የተገኙ) በC-terminus ላይ በV5 ቅደም ተከተል (GKPIPNPLLGLDST) ምልክት የተደረገባቸው ሲሆን በT2A ቅደም ተከተል በኩል በክፈፍ ውስጥ ከ mCherry ጋር ይዋሃዳሉ። Grx1-roGFP2 ከሄይደልበርግ TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) የተሰጠ ስጦታ ነው። የtdTomato ካሴትን በባህላዊ የክሎኒንግ ዘዴዎች በመተካት፣ ካሴቱ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5፣ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 እና pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ቬክተሮችን ለማመንጨት ወደ pAAV-CAG-FLEX-tdTomato የጀርባ አጥንት (Adgene ማጣቀሻ ቁጥር 28306) ተከፍሏል። የቁጥጥር ቬክተር pAAV-CAG-FLEX-mCherry ለማመንጨት ተመሳሳይ ስትራቴጂ ጥቅም ላይ ውሏል። የAAV-shPCx ግንባታን ለማመንጨት፣ የ shRNA ኢላማ መዳፊት PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) የሚያስቀምጠውን የዲኤንኤ ቅደም ተከተል የያዘ የፕላዝሚድ AAV ቬክተር (VectorBuilder፣ pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ያስፈልጋል። በU6 ፕሮሞተር ቁጥጥር ስር፣ mCherry በCMV ፕሮሞተር ቁጥጥር ስር ጥቅም ላይ ይውላል። የረዳት AAV ቬክተሮች ማምረት የተከናወነው በአምራቹ መመሪያ (ሴል ባዮላብስ) መሠረት ነው። ባጭሩ፣ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)፣ mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) የያዘ የዝውውር ፕላዝሚድ ይጠቀሙ። ጊዜያዊ የ293AAV ሴሎች-T2A-MFN1-V5)፣ mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ወይም Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) የኮድ ጂን፣ እንዲሁም የAAV1 ካፕሲድ ፕሮቲን እና ተጨማሪ ፕሮቲን ኮድ ያድርጉ። የፕላዝሚድ ፕላዝሚድን በካልሲየም ፎስፌት ዘዴ በመጠቀም ማሸግ። ጥሬ የቫይረስ ሱፐርናታንት የተገኘው በደረቅ በረዶ/ኤታኖል መታጠቢያ ውስጥ በማቀዝቀዝ-በማቅለጥ ዑደቶች እና በፎስፌት በተከማቸ ሳላይን (PBS) ውስጥ በተዘጉ ሴሎች ነው። የኤኤቪ ቬክተር በተቆራረጠ አዮዲክሳንኖል ግራዲየንት አልትራሴንትሪፉጌሽን (24 ሰዓታት በ32,000 rpm እና 4°C) ተጠርጎ በአሚኮን አልትራ-15 ሴንትሪፉጋል ማጣሪያ ተከማችቷል። የኤኤቪ1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 የጂኖም ቅጂ (GC)/ml]፣ የኤኤቪ1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)፣ የኤኤቪ1-CAG-FLEX ቀደም ሲል እንደተገለጸው (54) ተለካ፣ በእውነተኛ ጊዜ ቁጥራዊ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) እና የኤኤቪ1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ተለካ።
ዋና የነርቭ ሴሎች በበረዶ ቀዝቃዛ 1x PBS ውስጥ ተጠርገው ተቆርጠው ከዚያም ፎስፋታሴ እና ፕሮቲሴ አጋቾች (ሮቼ) የያዘውን 0.5% ትሪቶን ኤክስ-100 / 0.5% ሶዲየም ዲኦክሲኮሌት/ፒቢኤስ ሊሲስ ቋት ውስጥ ሆሞጋዊ ተደርገዋል። የፕሮቲን መጠን በቢቺንኮኒኒክ አሲድ ምርመራ (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) በመጠቀም ተከናውኗል። ከዚያም ፕሮቲኖቹ በኤስዲኤስ-ፖሊያክሪላሚድ ጄል ኤሌክትሮፎረሲስ ተለያይተው ከዚያም በፖሊቪኒሊዲን ፍሎራይድ ሽፋን (GE Healthcare) ላይ ተደርገዋል። ልዩ ያልሆኑ ቦታዎችን ይዝጉ እና በቲቢኤስቲ (ትሪስ-ቡፈርድድ ሳላይን ከትዊን ጋር)፣ የመታጠቢያ ደረጃዎች እና በቲቢኤስቲ ኢንኩቤት ውስጥ ባለው ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካል ውስጥ በዋና ፀረ እንግዳ አካል (ለዝርዝሮች ሰንጠረዥ S1 ይመልከቱ) ያፍሱ። በ+4°ሴ በዋና ፀረ እንግዳ አካል በአንድ ሌሊት ያፍሱ። ከታጠቡ በኋላ፣ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ2 ሰዓታት ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካል ይተግብሩ። በመቀጠልም፣ ተመሳሳይ ነጠብጣብ በፀረ-β-አክቲን ፀረ እንግዳ አካል በማቅለል፣ ተመሳሳይ ጭነት ተረጋግጧል። ወደ ኬሚሉሚኒሴንስ በመቀየር እና ኬሚሉሚኒሴንስን (GE Healthcare) በማሻሻል መለየት።
ቀደም ሲል በመስታወት ሽፋን ላይ የተዘሩት የነርቭ ሴሎች በተጠቀሰው የጊዜ ነጥብ በ4% ፓራፎርማልዴይድ (PFA)/PBS በክፍል ሙቀት ለ10 ደቂቃዎች ተስተካክለዋል። የሽፋን ሽፋኖች በመጀመሪያ በ0.1% ትሪቶን X-100/PBS ለ5 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ይገባሉ፣ ከዚያም በብሎክ ቋት [3% የበሬ ሴረም አልቡሚን (BSA)/PBS] ውስጥ ይገባሉ። በሁለተኛው ቀን የሽፋን ሽፋኖች በብሎክ ቋት ታጥበው በተገቢው ፍሎሮፎር-ኮንጁጌትድ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካል ለ2 ሰዓታት በክፍል ሙቀት ውስጥ ይታጠባሉ፤ በመጨረሻም፣ ናሙናዎቹ በPBS ውስጥ 4′፣6-ዲያሚዲኖ-2 -ፌኒሊንዶል (DAPI) በንፅፅር ተሸፍኖ ከዚያም በአኳ-ፖሊ/ማውንት በማይክሮስኮፕ ስላይድ ላይ ተጠግነዋል።
አይጦቹ (ወንድና ሴት) በፔሪቶናል ውስጥ ኬታሚን (130 ሚ.ግ./ኪ.ግ) እና ክሲላዚን (10 ሚ.ግ./ኪ.ግ) በመርፌ ሰመመን ተሰጥቷቸው በካርፕሮፌን አናሊሲስ (5 ሚ.ግ./ኪ.ግ) ሞቅ ባለ ፓድ በተገጠመለት ስቴሪዮታቲክ መሳሪያ (ኮፕፍ) ውስጥ ተቀምጠዋል። የራስ ቅሉን ያጋልጡ እና ከማይስ አጥንት ጋር የሚዛመደውን የሴሬቤላር ኮርቴክስ ክፍል ለማቅለል የጥርስ መሰርሰሪያ ይጠቀሙ (ከላምዳ፡ ጅራት 1.8፣ ጎን 1፣ ከሎቡልስ IV እና V ጋር የሚዛመደው)። ከታች ያለውን የደም ሥር እንዳይረብሽ ለማድረግ የተጠማዘዘ የሲሪንጅ መርፌ በመጠቀም የራስ ቅሉ ላይ ትንሽ ቀዳዳ በጥንቃቄ ይፍጠሩ። ከዚያም ቀጭኑ የተሳለው የመስታወት ካፕላሪ ቀስ በቀስ ወደ ማይክሮ-ሆል (ከዱራ ማተር ventral ጎን -1.3 እስከ -1) ይገባል፣ እና ከ200 እስከ 300 nl AAV በአነስተኛ ግፊት ወደ ማይክሮ-መርፌ (ናሪሺጅ) በመርፌ በእጅ መርፌዎች (ናሪሺጅ) ብዙ ጊዜ በ10 እስከ 20 ደቂቃዎች መስኮት ውስጥ ይወጋሉ። ከተከተቡ በኋላ ቫይረሱ ሙሉ በሙሉ እንዲሰራጭ ካፊላሪውን ለሌላ 10 ደቂቃዎች ያስቀምጡት። ካፊላሪዎቹ ከተወገዱ በኋላ የቁስል እብጠትን ለመቀነስ እና እንስሳው እንዲያገግም ቆዳው በጥንቃቄ ይሰፋል። እንስሳቱ ከቀዶ ጥገናው በኋላ ለብዙ ቀናት በህመም ማስታገሻዎች (ካስፖፌን) ታክመዋል፣ በዚህ ጊዜ ውስጥ አካላዊ ሁኔታቸው በጥንቃቄ ክትትል ተደርጎበት ከዚያም በተጠቀሰው ጊዜ እንዲጠፉ ተደርገዋል። ሁሉም ሂደቶች በአውሮፓ፣ በብሔራዊ እና በተቋማዊ መመሪያዎች መሠረት የተከናወኑ ሲሆን በኡምዌልት እና ቨርብራውቸርሹትዝ፣ ሰሜን ራይን-ዌስትፋሊያ፣ ጀርመን በሚገኘው ላንድሴምትፉርናተር ጸድቀዋል።
እንስሳቱ በኬታሚን (100 ሚ.ግ./ኪ.ግ) እና በxylazine (10 ሚ.ግ./ኪ.ግ) ማደንዘዣ ተሰጥቷቸዋል፣ እና ልብ በመጀመሪያ በ0.1 M PBS፣ ከዚያም በPBS ውስጥ በ4% PFA ተቀላቅሏል። ቲሹው በ4°ሴ በ4% PFA/PBS ተቆርጦ በአንድ ሌሊት ተስተካክሏል። በPBS ውስጥ ካለው ቋሚ አንጎል ውስጥ የሳጊትታል ክፍሎችን (50 μm ውፍረት) ለማዘጋጀት የሚንቀጠቀጥ ቢላዋ (Leica Microsystems GmbH፣ Vienna፣ Austria) ጥቅም ላይ ውሏል። ሌላ ካልተገለጸ በስተቀር፣ ከላይ እንደተገለጸው (13) በክፍል ሙቀት ውስጥ ነፃ ተንሳፋፊ ክፍሎችን ቀለም መቀባት እና በማነሳሳት ተካሂዷል። በአጭሩ፣ በመጀመሪያ፣ የተገኙት ቁርጥራጮች በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ15 ደቂቃዎች በ0.5% ትሪቶን X-100/PBS ተሰርዘዋል፤ ለአንዳንድ ኤፒቶፖች (Pcx እና Shmt2)፣ በ80°ሴ (PH9) በትሪስ-EDTA ቋት ውስጥ ተሰርዘዋል፣ በዚህ ደረጃ ፈንታ ቁርጥራጮቹን ለ25 ደቂቃዎች ያሞቁ። ቀጥሎም፣ ክፍሎቹ በ4°ሴ የሙቀት መጠን በማወዛወዝ በዋና ፀረ እንግዳ አካላት (ሰንጠረዥ S1 ይመልከቱ) በብሎክ ቋት (3% BSA/PBS) ውስጥ በአንድ ሌሊት በማነሳሳት ታጥበው ነበር። በማግስቱ፣ ክፍሎቹ በብሎክ ቋት ታጥበው በተገቢው ፍሎሮፎር-ኮንጁጌትድ ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ለ2 ሰዓታት በክፍል ሙቀት ውስጥ ታጥበዋል፤ በመጨረሻም፣ ክፍሎቹ በPBS በደንብ ታጥበው፣ በDAPI ተሸፍነው፣ ከዚያም በAquaPolymount On በማይክሮስኮፕ ስላይድ ተስተካክለዋል።
ናሙናውን በነጭ ብርሃን ሌዘር እና በ405 ዳዮድ አልትራቫዮሌት ሌዘር የተገጠመለት የሌዘር ቅኝት ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ (TCS SP8-X ወይም TCS Digital Light Sheet፣ Leica Microsystems) ናሙናውን ለመሳል ጥቅም ላይ ውሏል። ፍሎሮፎሩን በማነቃቃት እና ምልክቱን በሃይብሪድ መመርመሪያ (HyDs) በመሰብሰብ፣ የLAS-X ሶፍትዌር ከኒኪስት ናሙና ጋር የሚስማሙ የተደራረቡ ምስሎችን በቅደም ተከተል ለመሰብሰብ ጥቅም ላይ ውሏል፡ ለቁጥር ላልሆኑ ፓነሎች፣ ከፍተኛ ተለዋዋጭ ምልክቶች (ለምሳሌ፣ በሶማቲክ ሴሎች እና ዴንድሪቶች) mtYFP ነው) በBrightR ሁነታ ውስጥ ያሉትን የPNዎች ብዛት ለማወቅ HyDን ይጠቀሙ)። ዳራውን ለመቀነስ ከ0.3 እስከ 6 ns ያለው ክፍተት ይተገበራል።
የተደረደሩ ህዋሶችን በእውነተኛ ጊዜ የሚያሳይ ምስል። 1% B27 ማሟያ እና 0.5 mM GlutaMax በያዘው ኒውሮባሳል-ኤ ሚዲያ ውስጥ ከተደረደሩ በኋላ፣ ህዋሶቹ ወዲያውኑ በፖሊ-ሊሲን በተሸፈኑ የመስታወት ስላይዶች (μ-Slide8 Well፣ Ibidi፣ የካታሎግ ቁጥር 80826) ላይ ተዘርግተዋል፣ ከዚያም ህዋሶቹ እንዲረጋጉ በ37°ሴ እና 5% CO2 ለ1 ሰዓት ያስቀምጡት። የእውነተኛ ጊዜ ምስል በነጭ ሌዘር፣ HyD፣ 63×[1.4 numerical aperture (NA)] የዘይት ኦብጀክት ሌንስ እና የማሞቂያ ደረጃ በተገጠመለት በLeica SP8 የሌዘር ቅኝት ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ላይ ተካሂዷል።
አይጡ በካርቦን ዳይኦክሳይድ በፍጥነት ሰመመን ተሰጥቶ ጭንቅላቱ ተቆርጦ አንጎሉ ከራስ ቅሉ በፍጥነት ተወግዶ 200 μm ውፍረት ባለው (ለ13C መለያ ሙከራ) ወይም 275 μm ውፍረት ባለው (ለሁለት የፎቶን ሙከራዎች) በሚከተሉት ቁሳቁሶች የተሞላ ሳጊታል ክፍል ተቆርጧል። አይስክሬም (HM-650 V፣ Thermo Fisher Scientific፣ Walldorf፣ Germany) በሚከተሉት ንጥረ ነገሮች የተሞላ ነው፡ 125 mM በረዶ-ቀዝቃዛ፣ ካርቦን-የተሞላ (95% O2 እና 5% CO2) ዝቅተኛ Ca2 + አርቲፊሻል ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ACSF) NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM ሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25 mM NaHCO3፣ 25 mM ግሉኮስ፣ 0.5 mM CaCl2 እና 3.5 mM MgCl2 (የኦስሞቲክ ግፊት ከ310 እስከ 330 mmol)። የተገኙትን የአንጎል ቁርጥራጮች ከፍተኛ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM የሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-ግሉኮስ፣ 1.0 mM CaCl2 እና 2.0 mM MgCl2) መካከለኛ) pH 7.4 እና 310 እስከ 320 mmol) የያዘ የቅድመ-ኢንኩቤሽን ክፍል ያስተላልፉ።
በምስል ሂደቱ ወቅት፣ ቁርጥራጮቹ ወደተለየ የምስል ክፍል ተወስደዋል፣ እና ሙከራው የተከናወነው ከ32° እስከ 33°ሴ ባለው የማያቋርጥ የሙቀት መጠን በተከታታይ ACSF ፐርፉዥን ስር ነው። የሌይካ 25x ኦብጀክት ሌንስ (NA 0.95፣ ውሃ)፣ Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II፣ Coherent) የተገጠመለት ባለብዙ ፎቶን የሌዘር ቅኝት ማይክሮስኮፕ (TCS SP8 MP-OPO፣ Leica Microsystems) ለስዕል ኢሜጂንግ ጥቅም ላይ ውሏል። የFLIM ሞዱል (PicoHarp300፣ PicoQuant)።
የGrx1-roGFP2 FLIM። በPNs ሳይቶፕላስሚክ ሬዶክስ ሁኔታ ላይ የተደረጉት ለውጦች በሳጊታል የአንጎል ቁርጥራጮች ውስጥ ባለ ሁለት ፎቶን FLIM ተለክተዋል፣ የGrx1-roGFP2 ባዮሴንሰር PNዎችን ኢላማ ያደረገባቸው። በPN ንብርብር ውስጥ፣ የማግኛ መስክ ከቁራጩ ወለል በታች ከ50 እስከ 80 μm አካባቢ ተመርጧል፣ ይህም ተግባራዊ የሆነ PN (ማለትም፣ በዴንድሪቶች ላይ የዶቃ መዋቅር ወይም የነርቭ ሞርፎሎጂ ለውጦች አለመኖር) እና ድርብ አወንታዊ roGFP2 ዳሳሽ እና AAV ኢንኮዲንግ shRNA PCx ወይም የቁጥጥር ቅደም ተከተሉ (እያንዳንዱ አብሮ የሚገልጽ mCherry) መኖሩን ለማረጋገጥ ነው። ባለ 2x ዲጂታል ማጉላት [የማነቃቂያ ርዝመት፡ 890 nm፤ 512 nm 512 ፒክስል) ያላቸው ነጠላ-ቁልል ምስሎችን ይሰብስቡ። መለየት፡ ውስጣዊ HyD፣ የፍሎረሰንሴይን ኢሶቲዮሲያኔት (FITC) ማጣሪያ ቡድን] እና በ2 እስከ 3 ደቂቃዎች ውስጥ አማካይ ምስል ጥቅም ላይ ይውላሉ፣ ይህም በቂ ፎቶኖች (በአጠቃላይ 1000 ፎቶኖች) ከርቭ ጋር እንዲገጣጠሙ ለማረጋገጥ ነው። የGrx1-roGFP2 ምርመራ ስሜታዊነት እና የFLIM ሁኔታዎችን ማረጋገጥ የተከናወነው ውጫዊ 10 mM H2O2 ወደ ፐርፉዥን ACSF ሲጨመር የroGFP2 የህይወት ዘመን እሴትን በመከታተል ነው (ኦክሳይድን ከፍ ለማድረግ፣ የህይወት ዘመንን ለመጨመር)፣ እና ከዚያም 2 mM dithiothreitol በመጨመር (የመቀነሱን ደረጃ ይቀንሳል፣ ይህም የህይወት ዘመንን ይቀንሳል) (ምስል S8፣ D እስከ G)። የተገኙትን ውጤቶች ለመተንተን፣ የሙሉውን ምስል ነጠላ ኤክስፖንሲቭ መበስበስ ኩርባ ከተለካው IRF (የመሳሪያ ምላሽ ተግባር) ጋር ለማስማማት FLIMfit 5.1.1 ሶፍትዌርን ይጠቀሙ፣ እና χ2 በግምት 1 ነው። የአንድ ነጠላ PN የህይወት ዘመን ለማስላት፣ በነርቭ አካል ዙሪያ ያለው ጭምብል በእጅ ተሳሏል፣ እና በእያንዳንዱ ጭምብል ውስጥ ያለው አማካይ የህይወት ዘመን ለቁጥር ጥቅም ላይ ውሏል።
የሚቶኮንድሪያል እምቅ ትንተና። አጣዳፊው ክፍል በ100 nM TMRM በቀጥታ ወደ ፐርፉድ ACSF ለ30 ደቂቃዎች ከተጨመረ በኋላ፣ የPNs የማይቶኮንድሪያል እምቅ ለውጦች በሁለት-ፎቶን ማይክሮስኮፕ ተለክተዋል። የTMRM ምስል ምርመራው የተከናወነው በ920 nm ያለውን ምርመራ በማነቃቃት እና ምልክቶችን ለመሰብሰብ ውስጣዊ HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) በመጠቀም ነው፤ ተመሳሳይ የማነቃቂያ ሞገድ ርዝመት በመጠቀም ነገር ግን mtYFPን ምስል ለማድረግ የተለየ ውስጣዊ HyD (FITC:525/50) በመጠቀም ነው። በነጠላ ሴል ደረጃ የማይቶኮንድሪያል እምቅ አቅምን ለመገምገም የImageJ's Image Calculator ተሰኪ ይጠቀሙ። ባጭሩ፣ የተሰኪው እኩልታ፡ signal = min (mtYFP፣ TMRM) በተጓዳኝ ቻናል ነጠላ-ቁልል ኮንፎካል ምስል ውስጥ በፑርኪንጄ ሶማሊ ውስጥ የTMRM ምልክትን የሚያሳየውን የማይቶኮንድሪያል ክልል ለመለየት ይጠቅማል። ከዚያም በሚፈጠረው ጭምብል ውስጥ ያለው የፒክሰል ስፋት ይለካና ከዚያም በሚቲዮንድሪያል አቅም ላይ ያለውን የማይቶኮንድሪያል ክፍልፋይ ለማግኘት በmtYFP ቻናል ተጓዳኝ የገደብ ነጠላ-ቁልል ምስል ላይ መደበኛ ይሆናል።
ምስሉ በHuygens Pro (ሳይንቲፊክ ቮልዩም ኢሜጂንግ) ሶፍትዌር ተለቋል። ለተቃኙ የንጣፎች ስዕሎች፣ የአንድ ንጣፍ ሞንታጅ የሚዘጋጀው በLAS-X ሶፍትዌር በተሰጠው አውቶማቲክ የስፌት ስልተ ቀመር በመጠቀም ነው። የምስል ማስተካከያ ከተደረገ በኋላ ምስሉን የበለጠ ለማስኬድ ImageJ እና Adobe Photoshopን ይጠቀሙ እና ብሩህነት እና ንፅፅርን በእኩልነት ያስተካክሉ። ለግራፊክ ዝግጅት Adobe Illustratorን ይጠቀሙ።
የmtDNA የትኩረት ትንተና። የmtDNA ቁስሎች ብዛት በዲኤንኤ ላይ ፀረ እንግዳ አካላት በተለጠፉባቸው የሴሬቤላር ክፍሎች ላይ በኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ተለክቷል። እያንዳንዱ የዒላማ ቦታ የተፈጠረው ለእያንዳንዱ ሴል ሴል አካል እና ኒውክሊየስ ሲሆን የሚመለከተው አካባቢ ደግሞ ባለብዙ መለኪያ ተሰኪ (ImageJ ሶፍትዌር) በመጠቀም ተሰልቷል። የሳይቶፕላዝም አካባቢን ለማግኘት የሴሉ አካል አካባቢ የኑክሌር አካባቢውን ይቀንሱ። በመጨረሻም፣ የትንታኔ ቅንጣቶች ተሰኪ (ImageJ ሶፍትዌር) በገደቡ ምስል ላይ mtDNA ን የሚያመለክቱ የሳይቶፕላዝም ዲኤንኤ ነጥቦችን በራስ-ሰር ለመለካት ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና የተገኙት ውጤቶች ወደ CTRL አይጦች PN አማካይ መደበኛ ሆነዋል። ውጤቶቹ በሴል ውስጥ እንደ አማካኝ የኒውክሊዮሳይዶች ብዛት ይገለፃሉ።
የፕሮቲን አገላለጽ ትንተና። በነጠላ ሴል ደረጃ በPN ውስጥ የፕሮቲን አገላለጽን ለመገምገም የImageJ's Image Calculator ተሰኪ ይጠቀሙ። ባጭሩ፣ በተጓዳኝ ቻናል ነጠላ-ንብርብር ኮንፎካል ምስል፣ በእኩልታ፡ ምልክት = ደቂቃ (mtYFP፣ ፀረ እንግዳ አካል)፣ በፑርኪና ውስጥ ለተወሰነ ፀረ እንግዳ አካል የበሽታ መከላከያ እንቅስቃሴን የሚያሳየው የማይቶኮንድሪያል ክልል ተለይቶ ይታወቃል። ከዚያም በሚመጣው ጭንብል ውስጥ ያለው የፒክሰል አካባቢ ይለካና ከዚያም የሚታየውን ፕሮቲን ማይቶኮንድሪያል ክፍልፋይ ለማግኘት በmtYFP ቻናል ተጓዳኝ የገደብ ነጠላ-ቁልል ምስል ላይ መደበኛ ይሆናል።
የፐርኪንጄ ሴል ጥግግት ትንተና። የImageJ የሴል Counter ተሰኪ የተቆጠረውን የፐርኪንጄ ሴል ብዛት በተቆጠረው ሴል ውስጥ በተያዘው የሴሬቤላር ቀለበት ርዝመት በመከፋፈል የፐርኪንጄ ጥግግትን ለመገምገም ጥቅም ላይ ውሏል።
የናሙና ዝግጅት እና መሰብሰብ። ከቁጥጥር ቡድኑ እና ከMfn2cKO አይጦች የተገኙት አንጎልዎች በ0.1 M ፎስፌት ቋት (PB) ውስጥ በ2% PFA/2.5% ግሉታራሌይድ ውስጥ ተስተካክለዋል፣ ከዚያም የኮሮናል ክፍሎች በሲሊየቶች (Leica Mikrosysteme GmbH፣ Vienna፣ Austria) (ውፍረት ከ50 እስከ 60 μm) በመጠቀም ተዘጋጅተዋል። ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ1 ሰዓት በ1% os tetraoxide እና 1.5% ፖታሲየም ፌሮሲያኒድ ውስጥ በPB ቋት ውስጥ ያስተካክሉ። ክፍሎቹ ሶስት ጊዜ በተጣራ ውሃ ታጥበው ለ20 ደቂቃዎች 1% uranyl acetate በያዘ 70% ኤታኖል ታጥበዋል። ከዚያም ክፍሎቹ በደረጃ አልኮሆል ውስጥ ተደርቀው በዱርኩፓን ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences፣ ካታሎግ ቁጥር 14040) ውስጥ በሲሊኮን በተሸፈኑ የመስታወት ስላይዶች መካከል ተካትተዋል፣ እና በመጨረሻም በ60°ሴ ፖሊመሪዝ ምድጃ ውስጥ ለ48 ሰዓታት ተጨምረዋል። የሴሬቤላር ኮርቴክስ አካባቢ ተመርጦ 50 nm እጅግ በጣም ቀጭን ክፍሎች በLeica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH፣ Vienna፣ Austria) ላይ ተቆርጠው በ2×1 ሚሜ የመዳብ ስሊት ፍርግርግ በፖሊስቲሪን ፊልም ተሸፍነዋል። ክፍሎቹ በH2O ውስጥ ለ10 ደቂቃዎች በ4% ዩራኒል አሲቴት መፍትሄ ተቀባ፣ በH2O ብዙ ጊዜ ታጥበዋል፣ ከዚያም በH2O ውስጥ በሬይኖልድስ ሊድ ሲትሬት ለ10 ደቂቃዎች ታጥበዋል፣ ከዚያም በH2O ብዙ ጊዜ ታጥበዋል። ማይክሮግራፎች በTVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 ዲጂታል ካሜራ (TVIPS GmbH፣ Gauting፣ USA) በመጠቀም በማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific፣ Waltham፣ MA፣ USA) ተወስደዋል።
በኤኤቪ ለተያዙ አይጦች፣ አንጎል ተለያይቶ በ1 ሚሜ ውፍረት ባለው የሳጊታል ክፍል ተቆርጦ ተቆርጧል፣ እና ሴሬቤልየም በፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕ በመጠቀም በኤኤቪ የተበከለውን ቀለበት (ማለትም mCherry expressing) ለመለየት ተመርምሯል። የኤኤቪ መርፌ ቢያንስ በሁለት ተከታታይ የሴሬቤል ቀለበቶች ውስጥ የፐርኪንጄ ሴል ንብርብር (ማለትም ሙሉውን ንብርብር ማለት ይቻላል) በጣም ከፍተኛ የሆነ የትራንስዱክሽን ውጤታማነት የሚያስገኙ ሙከራዎች ብቻ ጥቅም ላይ ይውላሉ። የኤኤቪ-ትራንስዱድ ሉፕ ለአንድ ሌሊት ከመለጠፍ በኋላ (4% PFA እና 2.5% ግሉታራሌይድ በ0.1 M ኮኮቴት ቋት) ማይክሮ ዲሴክሽን ተደርጎበታል እና ተጨማሪ ሂደት ተደርጓል። ለኢፒኤን ኢንክሚንግ፣ ቋሚው ቲሹ በ0.1 M ሶዲየም ኮኮቴት ቋት (አፕሊኬም) ታጥቦ በ2% OsO4 (os፣ Science Services፤ Caco) በ0.1 M ሶዲየም ኮኮቴት ቋት (አፕሊኬም) ለ4 ሰዓታት ታጥቧል፣ ከዚያም ለ2 ሰዓታት ታጥቧል። በ0.1 M ኮካሚድ ቋት 3 ጊዜ ይድገሙት። በመቀጠልም፣ ወደ ላይ የሚወጣው የኢታኖል ተከታታይ ክፍል እያንዳንዱን የኢታኖል መፍትሄ በ4°ሴ ለ15 ደቂቃዎች ለማቅለጥ ጥቅም ላይ ውሏል። ቲሹው ወደ ፕሮፒሊን ኦክሳይድ ተላልፎ በ4°ሴ በEPON (ሲግማ-አልድሪች) ውስጥ በአንድ ሌሊት እንዲቆይ ተደርጓል። ቲሹውን በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ2 ሰዓታት በአዲስ EPON ውስጥ ያስቀምጡት፣ ከዚያም በ62°ሴ ለ72 ሰዓታት ይክሉት። 70 nm እጅግ በጣም ቀጭን ክፍሎችን ለመቁረጥ አልትራማይክሮቶም (ሊካ ማይክሮሲስተምስ፣ UC6) እና የአልማዝ ቢላዋ (ዲያቶም፣ ቢኤል፣ ስዊዘርላንድ) ይጠቀሙ፣ እና በ37°ሴ ለ15 ደቂቃዎች በ1.5% ዩራኒል አሲቴት ይቀቡት፣ እና ለ4 ደቂቃዎች በእርሳስ ሲትሬት መፍትሄ ይቀቡት። የኤሌክትሮን ማይክሮግራፎች የተወሰዱት በካሜራ OneView 4K 16-ቢት (ጋታን) እና ዲጂታል ማይክሮግራፍ ሶፍትዌር (ጋታን) የተገጠመለት የJEM-2100 Plus ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (JEOL) በመጠቀም ነው። ለመተንተን፣ የኤሌክትሮን ማይክሮግራፎች የተገኙት በ5000× ወይም 10,000× ዲጂታል ማጉላት ነው።
የ mitochondria ሞርፎሎጂካል ትንተና። ለሁሉም ትንታኔዎች፣ የግለሰብ mitochondria ቅርጾች በImageJ ሶፍትዌር በመጠቀም በዲጂታል ምስሎች በእጅ ተዘርዝረዋል። የተለያዩ የሞርፎሎጂካል መለኪያዎች ተተነተኑ። የሚቶኮንድሪያል ጥግግት የእያንዳንዱን ሕዋስ አጠቃላይ የማይቶኮንድሪያል አካባቢ በሳይቶፕላዝም አካባቢ (ሳይቶፕላዝም አካባቢ = የሴል አካባቢ-ሴል ኒውክሊየስ አካባቢ) × 100 በመከፋፈል የተገኘ መቶኛ ሆኖ ይገለጻል። የሚቶኮንድሪያል ክብነት የሚሰላው በቀመር [4π∙(አካባቢ/ፔሪሜትር 2)] ነው። የሚቶኮንድሪያል ኢስታ ሞርፎሎጂ ተተነተነ እና በሁለት ምድቦች (“ቱቡላር” እና “ብላስተር”) በዋና ቅርጾቻቸው መሠረት ተከፍሏል።
አውቶፋጎሶም/ሊሶሶም ቁጥር እና የጥግግት ትንተና። በዲጂታል ምስል ውስጥ የእያንዳንዱን አውቶፋጎሶም/ሊሶሶም ቅርጾች በእጅ ለመዘርዘር የImageJ ሶፍትዌርን ይጠቀሙ። አውቶፋጎሶም/ሊሶሶም አካባቢ የሚገለጸው የእያንዳንዱን ሴል አጠቃላይ አውቶፋጎሶም/ሊሶሶም መዋቅር ስፋት በሳይቶፕላዝም አካባቢ (ሳይቶፕላዝም አካባቢ=ሴል አካባቢ-ኒውክሊየስ አካባቢ) ×100 በመከፋፈል የሚሰላ መቶኛ ነው። የአውቶፋጎሶም/ሊሶሶም ጥግግት የሚሰላው ጠቅላላውን ቁጥር በሴል ውስጥ ባለው አውቶፋጎሶም/ሊሶሶም መዋቅሮች ብዛት (በሳይቶፕላዝም አካባቢ አንፃር) (ሳይቶፕላዝሚክ አካባቢ = የሴል አካባቢ-ኒውክሊየስ አካባቢ) በመከፋፈል ነው።
ለአጣዳፊ ክፍልፋይ እና ለናሙና ዝግጅት መለያ መስጠት። የግሉኮስ መለያ ለሚያስፈልጋቸው ሙከራዎች፣ የአጣዳፊ የአንጎል ቁርጥራጮችን ወደ ቅድመ-ኢንኩቤሽን ክፍል ያስተላልፉ፣ ይህም የተሟሟ ካርቦን (95% O2 እና 5% CO2)፣ ከፍተኛ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM የሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-ግሉኮስ፣ 1.0 mM CaCl2 እና 2.0 mM MgCl2፣ ከ pH 7.4 እና 310 እስከ 320 mOsm የተስተካከለ)፣ በዚህ ውስጥ ግሉኮስ 13 C 6- የግሉኮስ ምትክ (Eurisotop፣ የካታሎግ ቁጥር CLM-1396) ነው። የፒሩቫት መለያ የሚያስፈልጋቸው ሙከራዎችን ለማድረግ፣ የአጣዳፊ የአንጎል ቁርጥራጮችን ወደ ከፍተኛ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM ሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-glucose፣ 1.0 mM CaCl2 ያስተላልፉ እና 2.0mM MgCl2 ይጨምሩ፣ ከ pH 7.4 እና 310 እስከ 320mOsm ያስተካክሉ)፣ እና 1mM 1-[1-13C]ፒሩቫት (Eurisotop፣ የካታሎግ ቁጥር CLM-1082) ይጨምሩ። ክፍሎቹን ለ90 ደቂቃዎች በ37°ሴ ያቀፉ። በሙከራው መጨረሻ ላይ ክፍሎቹ በፍጥነት 75 mM አሞኒየም ካርቦኔት የያዘ የውሃ መፍትሄ (pH 7.4) ታጥበዋል፣ ከዚያም በ40:40:20 (v:v:v) አሴቶኒትሪል (ACN): ሜታኖል: ውሃ። ክፍሎቹ በበረዶ ላይ ለ30 ደቂቃዎች ከተቀቡ በኋላ፣ ናሙናዎቹ በ21,000 ግራም ለ10 ደቂቃዎች በ4°ሴ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል፣ እና ግልጽ የሆነው ሱፐርናታንት በSpeedVac ኮንሰንትሬተር ውስጥ ደርቋል። የተገኘው የደረቀ የሜታቦላይት ፔሌት እስኪተነተን ድረስ በ-80°ሴ ተከማችቷል።
የ13 ሲ-መለያ የተደረገባቸው አሚኖ አሲዶች ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ-ጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ትንተና። ለፈሳሽ ክሮማቶግራፊ-ጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ትንተና፣ የሜታቦላይት ፔሌት በ75 μl የLC-MS ደረጃ ውሃ (Honeywell) ውስጥ እንደገና ተንጠለጠለ። በ4°ሴ ለ5 ደቂቃዎች በ21,000 ግራም ሴንትሪፉጌሽን ከተደረገ በኋላ፣ 20 μl የተጣራ ሱፐርናታንት ለአሚኖ አሲድ ፍሰት ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል፣ የተቀረው ማውጣት ደግሞ ወዲያውኑ ለአኒዮን ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል (ከታች ይመልከቱ)። የአሚኖ አሲድ ትንተና የተከናወነው ቀደም ሲል በተገለጸው የቤንዞይል ክሎራይድ ዴሪቫቲዜሽን ፕሮቶኮል (55፣ 56) በመጠቀም ነው። በመጀመሪያው ደረጃ፣ 10 μl የ100 mM ሶዲየም ካርቦኔት (ሲግማ-አልድሪች) በ20 μl የሜታቦላይት ማውጣት ላይ ተጨምሮ ከዚያም 10 μl የ2% ቤንዞይል ክሎራይድ (ሲግማ-አልድሪች) ወደ LC ደረጃ ACN ተጨምሯል። ናሙናው ለአጭር ጊዜ ተዘዋውሮ ከዚያም በ21,000 ግራም ለ5 ደቂቃዎች በ20°ሴ ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። የተጣራውን ሱፐርናታንት ወደ 2 ሚሊ ሊትር አውቶሳምፕለር ብልቃጥ ሾጣጣ የመስታወት ማስገቢያ (200 μl መጠን) ወዳለው ሾጣጣ የመስታወት ማስገቢያ (200 μl መጠን) ያስተላልፉ። ናሙናዎቹ የተተነተኑት ከQ-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ከፍተኛ ጥራት ያለው ትክክለኛነት ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትር (Thermo Fisher Scientific) ጋር የተገናኘውን Acquity iClass እጅግ በጣም ከፍተኛ አፈፃፀም ያለው የLC ስርዓት (Waters) በመጠቀም ነው። ለመተንተን፣ የተወሰደው ናሙና 2 μl 1.8 μm ቅንጣቶችን በያዘ 100 × 1.0 ሚሜ ከፍተኛ ጥንካሬ ያለው የሲሊካ T3 አምድ (Waters) ውስጥ ተወግቷል። የፍሰት መጠኑ 100 μl/ደቂቃ ሲሆን የቋት ስርዓቱ ቋት A (10 mM አሞኒየም ፎርማት እና 0.15% ፎርሚክ አሲድ በውሃ ውስጥ) እና ቋት B (ACN) ያካትታል። ቅልመት እንደሚከተለው ነው፡ 0%B በ0 ደቂቃዎች፤ 0%B። ከ0 እስከ 15% B በ0 እስከ 0.1 ደቂቃዎች፤ ከ15 እስከ 17% B በ0.1 እስከ 0.5 ደቂቃዎች፤ ከ17 እስከ 55% በ0.5 እስከ 14 ደቂቃዎች፤ ከ55 እስከ 70% በ14 እስከ 14.5 ደቂቃዎች፤ ከ14.5 እስከ 70 እስከ 100% B በ18 ደቂቃዎች፤ ከ100% B በ18 እስከ 19 ደቂቃዎች፤ ከ100 እስከ 0% B በ19 እስከ 19.1 ደቂቃዎች፤ ከ0% B በ19.1 እስከ 28 ደቂቃዎች (55፣ 56)። የQE-HF የጅምላ ስፔክትሮሜትር ከ50 እስከ 750 ባለው m/z (የጅምላ/የቻርጅ ጥምርታ) በአዎንታዊ ionization ሁነታ ይሰራል። የተተገበረው ጥራት 60,000 ሲሆን የተገኘው የጌን መቆጣጠሪያ (AGC) አዮን ኢላማ 3×106 ሲሆን ከፍተኛው የአዮን ጊዜ 100 ሚሊሰከንዶች ነው። የሚሞቀው የኤሌክትሮስፕሬይ አዮንኢዜሽን (ESI) ምንጭ በ3.5 ኪ.ቮ የሚረጭ ቮልቴጅ፣ በ250°ሴ የሚደርስ የካፒላሪ ሙቀት፣ በ60 AU (የዘፈቀደ አሃዶች) እና በ20 AU 250°ሴ ረዳት የአየር ፍሰት ይሰራል። የS ሌንስ ወደ 60 AU ተቀናብሯል።
የ13C ምልክት የተደረገባቸው ኦርጋኒክ አሲዶች የአኒዮን ክሮማቶግራፊ-ኤምኤስ ትንተና። የቀረው የሜታቦላይት ፕሪሲፕል (55μl) የተተነተነው ከQE-HF የጅምላ ስፔክትሮሜትር (Thermo Fisher Scientific) ጋር የተገናኘ የዲዮኔክስ አዮን ክሮማቶግራፊ ስርዓት (ICS 5000+፣ Thermo Fisher Scientific) በመጠቀም ነው። ባጭሩ፣ 5μl የሜታቦላይት ማውጣት በHPLC (2 ሚሜ × 250 ሚሜ፣ የቅንጣት መጠን 4 μm፣ Thermo Fisher Scientific) በተገጠመለት የዲዮኔክስ IonPac AS11-HC አምድ ውስጥ በ1 የመሙያ ጥምርታ ውስጥ በPush-in ከፊል ሉፕ ሁነታ ውስጥ ተለክቷል። የዲዮኔክስ IonPac AG11-HC ጠባቂ አምድ (2 ሚሜ x 50 ሚሜ፣ 4 μm፣ Thermo Fisher Scientific)። የአምድ ሙቀት በ30°ሴ ይጠበቃል፣ እና አውቶሳምፕለሩ ወደ 6°ሴ ተቀናብሯል። በኤሉየንት ጀነሬተር በኩል የፖታስየም ሃይድሮክሳይድ ግራዲየንት ለማመንጨት ከዲዮን የተሰራ የፖታስየም ሃይድሮክሳይድ ካርትሬጅ ይጠቀሙ። የሜታቦላይቶች መለያየት በ380μl/ደቂቃ የፍሰት ፍጥነት፣ የሚከተለውን ቅልመት ተግባራዊ ማድረግ፡ ከ0 እስከ 3 ደቂቃዎች፣ 10 mM KOH፤ ከ3 እስከ 12 ደቂቃዎች፣ ከ10 እስከ 50 mM KOH፤ ከ12 እስከ 19 ደቂቃዎች፣ ከ50 እስከ 100 mM KOH፤ ከ19 እስከ 21 ደቂቃዎች፣ 100 mM KOH፤ ከ21 እስከ 21.5 ደቂቃዎች፣ ከ100 እስከ 10 mM KOH። አምድ ከ10 mM KOH በታች ለ8.5 ደቂቃዎች እንደገና ተስተካክሏል።
የተለቀቁት ሜታቦላይቶች ከአምዱ በኋላ ከ150μl/min የኢሶፕሮፓኖል ማሟያ ዥረት ጋር ይጣመራሉ ከዚያም በአሉታዊ አዮኒዜሽን ሁነታ ወደሚሰራ ከፍተኛ ጥራት ያለው የጅምላ ስፔክትሮሜትር ይመራሉ። MS ከ m/z 50 እስከ 750 ያለውን የጅምላ ክልል በ60,000 ጥራት እየተከታተለ ነው። AGC ወደ 1×106 ተቀናብሯል፣ እና ከፍተኛው የአዮን ጊዜ በ100 ms ላይ ይቆያል። የሞቀው የ ESI ምንጭ በ3.5 kV የሚረጭ ቮልቴጅ ላይ ተንቀሳቅሷል። የአዮን ምንጭ ሌሎች ቅንብሮች እንደሚከተለው ናቸው፡- የካፕላሪ ሙቀት 275°ሴ፤ የሼት ጋዝ ፍሰት፣ 60 AU፤ ረዳት የጋዝ ፍሰት፣ 20 AU በ300°ሴ እና የS ሌንስ ቅንብር ወደ 60 AU።
የ13C መለያ የተደረገባቸው ሜታቦላይቶች የውሂብ ትንተና። የኢሶቶፕ ጥምርታ የውሂብ ትንተና ለማድረግ የTraceFinder ሶፍትዌር (ስሪት 4.2፣ Thermo Fisher Scientific) ይጠቀሙ። የእያንዳንዱ ውህድ ማንነት በአስተማማኝ የማጣቀሻ ውህድ ተረጋግጦ በተናጥል ተተነተነ። የኢሶቶፕ ማበልጸጊያ ትንተና ለማከናወን፣ የእያንዳንዱ 13C ኢሶቶፕ (Mn) የተወጣው የአዮን ክሮማቶግራም (XIC) ስፋት ከ[M + H] + የተወሰደ ሲሆን፣ n አሚኖ አሲዶችን ለመተንተን ወይም [MH] + አኒየኖችን ለመተንተን የሚያገለግል የዒላማ ውህድ የካርቦን ቁጥር ነው። የXIC የጅምላ ትክክለኛነት በሚሊዮን ከአምስት ክፍሎች ያነሰ ሲሆን የRT ትክክለኛነት 0.05 ደቂቃዎች ነው። የማበልጸጊያ ትንተና የሚከናወነው የእያንዳንዱ የተገኘ አይሶቶፕ ጥምርታ ከተዛማጅ ውህድ የሁሉም አይዞቶፖች ድምር ጋር በማስላት ነው። እነዚህ ሬሾዎች ለእያንዳንዱ አይሶቶፕ እንደ መቶኛ እሴቶች ተሰጥተዋል፣ እና ውጤቶቹ ቀደም ሲል እንደተገለፀው (42) እንደ ሞላር በመቶ ማበልጸጊያ (MPE) ይገለፃሉ።
የቀዘቀዘው የነርቭ ሴል ፔሌት በበረዶ ቀዝቃዛ 80% ሜታኖል (v/v) ውስጥ ሆሞዳላይዜሽን ተደርጎለታል፣ ተበርዟል እና በ-20°ሴ ለ30 ደቂቃዎች ተቆፍሯል። ናሙናውን እንደገና አዙረው በ+4°ሴ ለ30 ደቂቃዎች ያዋህዱት። ናሙናው በ4°ሴ ለ5 ደቂቃዎች በ21,000 ግራም ሴንትሪፉጅ ተደርጎበታል፣ ከዚያም የተገኘው ሱፐርናታንት በ25°ሴ በSpeedVac ኮንሰንትሬተር በመጠቀም ለቀጣይ ትንተና ደርቋል። ከላይ እንደተገለጸው፣ የLC-MS ትንተና በተደረደሩት ሴሎች አሚኖ አሲዶች ላይ ተካሂዷል። TraceFinder (ስሪት 4.2፣ Thermo Fisher Scientific) በመጠቀም የውሂብ ትንተና የተከናወነው የእያንዳንዱን ውህድ ሞኖኢሶቶፒክ ክብደት በመጠቀም ነው። የሜታቦላይት ውሂብ ቁጥራዊ መደበኛነት የተከናወነው የቅድመ-ፕሮሴስኮር ሶፍትዌር ጥቅል (57) በመጠቀም ነው።
የመቁረጫ ዝግጅት። አይጡ በካርቦን ዳይኦክሳይድ በፍጥነት ሰመመን ተሰጥቶት ጭንቅላቱ ተቆርጧል፣ አንጎሉ በፍጥነት ከራስ ቅሉ ተወግዷል፣ እና በበረዶ የተሞላው የሚንቀጠቀጥ ቢላዋ (HM-650 V፣ Thermo Fisher Scientific፣ Walldorf፣ Germany) ከ300 እስከ 375 μm ሳጊታል ክፍሎች ለመቁረጥ ጥቅም ላይ ውሏል ቀዝቃዛ የካርቦን ጋዝፊኬሽን (95% O2 እና 5% CO2) ዝቅተኛ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM ሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-ግሉኮስ፣ 1.0 mM CaCl2 እና 6.0 mM MgCl2 ከ pH 7.4 እና 310 እስከ 330 mOsm ጋር ይስተካከላል። የተገኙትን የአንጎል ቁርጥራጮች ከፍተኛ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl፣ 2.5 mM KCl፣ 1.25 mM ሶዲየም ፎስፌት ቋት፣ 25.0 mM NaHCO3፣ 25.0 mM d-ግሉኮስ፣ 4.0 mM CaCl2 እና mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 እና 310 እስከ 320 mOsm ወዳለው ክፍል ያስተላልፉ። ቁርጥራጮቹን ከመቅረጽዎ በፊት ወደነበሩበት ሁኔታ ከ20 እስከ 30 ደቂቃዎች ያስቀምጡ።
ቀረጻ። ቋሚ የመቅጃ ክፍል እና 20x የውሃ መጥለቅያ ኦብጀክት ሌንስ (ሳይንቲፊካ) ያለው የማይክሮስኮፕ ደረጃ ለሁሉም ቀረጻዎች ጥቅም ላይ ውሏል። የፑርኪንጄ ሴሎች በ (i) የሰውነት መጠን፣ (ii) የሴሬቤልየም አናቶሚክ አቀማመጥ እና (iii) የፍሎረሰንት mtYFP ዘጋቢ ጂን አገላለጽ ተለይተዋል። ከ5 እስከ 11 ሜጎህምስ ጫፍ የመቋቋም ችሎታ ያለው የፓች ፒፔት በቦሮሲሊኬት የመስታወት ካፕላሪ (GB150-10፣ 0.86 ሚሜ×1.5 ሚሜ×100 ሚሜ፣ የሳይንስ ምርቶች፣ ሆፍሃይም፣ ጀርመን) እና አግድም ፒፔት መሳሪያዎች (P-1000፣ ሱተር)፣ ኖቫቶ፣ ካሊፎርኒያ ተከናውኗል። ሁሉም ቀረጻዎች የተከናወኑት በELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi ኤሌክትሮኒክ GmbH፣ Tam፣ ጀርመን) ሲሆን ይህም በሶፍትዌር ሲግናል (ስሪት 6.0፣ ካምብሪጅ ኤሌክትሮኒክ፣ ካምብሪጅ፣ ዩኬ) ቁጥጥር ስር ነበር። ሙከራው የተቀዳው በ12.5 kHz የናሙና ፍጥነት ነው። ምልክቱ የሚጣራው በሁለት የአጭር ጊዜ የቤሰል ማጣሪያዎች ሲሆን በቅደም ተከተል 1.3 እና 10 kHz የመቁረጥ ድግግሞሾች አሉት። የሜምብሬሙ እና የፓይፔቱ አቅም በማጉያ ወረዳው ይካሳል። ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት በሆካዎ ሶፍትዌር (ስሪት 2.8፣ ሃማማትሱ፣ ገርደን፣ ጀርመን) ቁጥጥር ስር በነበረው ኦርካ-ፍላሽ 4.0 ካሜራ (ሃማማትሱ፣ ገርደን፣ ጀርመን) ቁጥጥር ስር ነው።
መደበኛ የሙሉ ሕዋስ ውቅር እና ትንተና። ከመቅዳትዎ በፊት ወዲያውኑ፣ ፒፔቱን የሚከተሉትን ንጥረ ነገሮች የያዘውን ውስጣዊ መፍትሄ ይሙሉት፡ 4.0 mM KCl፣ 2.0 mM NaCl፣ 0.2 mM EGTA፣ 135.0 mM ፖታሲየም ግሉኮኔት፣ 10.0 mM Hepes፣ 4.0 mM ATP (Mg)፣ 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) እና 10.0 mM creatinine phosphate ወደ pH 7.25 ተስተካክለዋል፣ እና የኦስሞቲክ ግፊቱ 290 mOsm (sucrose) ነበር። ሽፋኑን ለመስበር 0 pA ኃይል ከተተገበረ በኋላ ወዲያውኑ የማረፊያ ሽፋን አቅም ተለክቷል። የግብዓት መቋቋም የሚለካው -40፣ -30፣ -20 እና -10 pA ሃይፐርፖላራይዝድ ጅረቶችን በመተግበር ነው። የቮልቴጅ ምላሹን መጠን ይለኩ እና የግብዓት መቋቋምን ለማስላት የኦህምን ህግ ይጠቀሙ። ድንገተኛ እንቅስቃሴ በቮልቴጅ ክላምፕ ውስጥ ለ5 ደቂቃዎች ተመዝግቧል፣ እና sPSC በIgor Pro (ስሪት 32 7.01፣ WaveMetrics፣ Lake Oswego፣ Oregon፣ USA) በከፊል አውቶማቲክ የማወቂያ ስክሪፕት በመጠቀም ተለይቶ ተለክቷል። የIV ኩርባ እና የቋሚ ሁኔታ ጅረት የሚለካው ባትሪውን በተለያዩ እምቅ አቅም (ከ -110 mV ጀምሮ) በመጨፍለቅ እና ቮልቴጅን በ5 mV ደረጃዎች በመጨመር ነው። የAP ምርት የተፈተነው ዲፖላራይዜሽን ጅረትን በመተግበር ነው። ዲፖላራይዜሽን ጅረት ጅረትን በመተግበር ሴልን በ -70 mV ይዝጉት። የእያንዳንዱን የመቅጃ ክፍል የደረጃ መጠን ለብቻው ያስተካክሉ (ከ10 እስከ 60 pA)። ከፍተኛውን የAP ድግግሞሽ የሚያስከትሉትን የpulse spikes በእጅ በመቁጠር ከፍተኛውን የAP ድግግሞሽ ያሰሉ። የAP ገደቡ የሚተነተነው በመጀመሪያ አንድ ወይም ከዚያ በላይ APዎችን የሚያስነሳውን የዲፖላራይዜሽን ጅረት ሁለተኛ ተዋጽኦ በመጠቀም ነው።
የተቦረቦረ የጥልፍ ውቅር እና ትንተና። በመደበኛ ፕሮቶኮሎች የተቦረቦረ የጥልፍ ቀረጻ ያከናውኑ። የሚከተሉትን ንጥረ ነገሮች የሌሉት ATP እና GTP-ነጻ ፒፔት ይጠቀሙ፡ 128 mM ግሉኮኔት K፣ 10 mM KCl፣ 10 mM Hepes፣ 0.1 mM EGTA እና 2 mM MgCl2፣ እና ወደ pH 7.2 (KOH በመጠቀም) ያስተካክሉ። የሴል ሽፋን ቁጥጥር ያልተደረገበት መተላለፊያን ለመከላከል ATP እና GTP ከሴሉላር መፍትሄ ውስጥ ይገለላሉ። የተቦረቦረ የጥልፍ መዝገብ ለማግኘት የአምፎቴሪሲንን በያዘ ውስጣዊ መፍትሄ (በግምት ከ200 እስከ 250 μg/ml፤ G4888፣ ሲግማ-አልድሪች) የተሞላ ነው። አምፎቴሪሲን በዲሜቲል ሰልፋይድ (የመጨረሻ ክምችት፡ 0.1 እስከ 0.3%፤ DMSO፤ D8418፣ ሲግማ-አልድሪች) ውስጥ ተሟጧል። ጥቅም ላይ የዋለው የDMSO ክምችት በተጠኑት የነርቭ ሴሎች ላይ ምንም አይነት ጉልህ ተጽእኖ አልነበረውም። በቡጢ ሂደት ወቅት የቻናል መቋቋም (Ra) ያለማቋረጥ ክትትል ተደርጎበታል፣ እና ሙከራው የተጀመረው የRa እና AP ስፋት ከተረጋጋ በኋላ (20-40 ደቂቃዎች) ነው። ድንገተኛ እንቅስቃሴ የሚለካው በቮልቴጅ እና/ወይም በአሁን ክላምፕ ውስጥ ለ2 እስከ 5 ደቂቃዎች ነው። የውሂብ ትንተና የተከናወነው Igor Pro (ስሪት 7.05.2፣ WaveMetrics፣ USA)፣ Excel (ስሪት 2010፣ Microsoft Corporation፣ Redmond፣ USA) እና GraphPad Prism (ስሪት 8.1.2፣ GraphPad Software Inc.፣ La Jolla፣ CA) በመጠቀም ነው። ድንገተኛ APዎችን ለመለየት፣ የIgorPro's NeuroMatic v3.0c ተሰኪ ጥቅም ላይ ይውላል። ለእያንዳንዱ መዝገብ በተናጠል የሚስተካከል የተወሰነ ገደብ በመጠቀም APዎችን በራስ-ሰር ይለዩ። የስፒክ ክፍተትን በመጠቀም፣ ከፍተኛው ፈጣን የስፒክ ድግግሞሽ እና አማካይ የስፒክ ድግግሞሽ ያለው የስፒክ ድግግሞሽ ይወስኑ።
የፒኤንኤ ለይቶ ማግለል። ቀደም ሲል ከታተመው ፕሮቶኮል ጋር በመላመድ፣ ፒኤንኤዎች በተወሰነ ደረጃ (58) ከመዳፊት ሴሬቤልየም ተጠርገው በበረዶ-ቀዝቃዛ ዲሶሲዬሽን መካከለኛ ውስጥ ተቆርጠው ተቆርጠው ተቆርጠዋል [HBSS Ca2+ እና Mg2+ ሳይኖር፣ በ20 mM ግሉኮስ፣ ፔኒሲሊን (50 U/ml) እና ስትሬፕቶማይሲን (0.05 mg/ml) ተጨምሮ]፣ ከዚያም መካከለኛውን በፓፔን ውስጥ ተቀላቅሏል [HBSS፣ በ1-ሳይስቴይን·HCl (1 mg/ml)፣ በፓፔን (16 U/ml) እና በዴኦክሲራይቦኑክሊየስ I (DNase I፤ 0.1 mg/ml) ተጨምሮ]። በ30°ሴ ለ30 ደቂቃዎች ያክሙ። በመጀመሪያ ሕብረ ሕዋሳቱን በእንቁላል አክታ (10 ሚ.ግ./ሚሊ)፣ BSA (10 ሚ.ግ./ሚሊ) እና DNase (0.1 ሚ.ግ./ሚሊ) በያዘው የHBSS መካከለኛ ክፍል ውስጥ ያጠቡ፤ ከዚያም 20 ሚ.ግ. ግሉኮስ በያዘው የHBSS መካከለኛ ክፍል ውስጥ በHBSS፣ ፔኒሲሊን (50 ዩ/ሚሊ)፣ ስትሬፕቶማይሲን (0.05 ሚ.ግ./ሚሊ) እና DNase (0.1 ሚ.ግ./ሚሊ) ውስጥ ቀስ ብለው ይፈጩ። የተገኘው የሴል እገዳ በ70 μm ሴል ማጣሪያ በኩል ተጣርቶ ከዚያም ሴሎቹ በሴንትሪፉጌሽን (1110 rpm፣ 5 ደቂቃዎች፣ 4°ሴ) ተለጥፈው እንደገና በመደርደር መካከለኛ ክፍል ውስጥ ተዘርግተዋል [HBSS፣ በ20 ሚ.ግ. ግሉኮስ፣ 20% የፅንስ ቦቪን ሴረም፣ ፔኒሲሊን (50 ዩ/ሚሊ) እና ስትሬፕቶማይሲን (0.05 ሚ.ግ./ሚሊ)]፤ የሴል ህያውነትን በፕሮፒዲየም አዮዳይድ ይገምግሙ እና የሴል ጥግግቱን ከ1×106 እስከ 2×106 ሴሎች/ሚሊ ያስተካክሉ። ከፍሰት ሳይቶሜትሪ በፊት፣ እገዳው በ50 μm ሴል ማጣሪያ በኩል ተጣርቶ ነበር።
የፍሰት ሳይቶሜትር። የሕዋስ መደርደር የተከናወነው በ4°ሴ ሲሆን በFACSAria III ማሽን (BD Biosciences) እና FACSDIva ሶፍትዌር (BD Biosciences፣ ስሪት 8.0.1) በመጠቀም ነው። የሕዋስ እገዳው የተደረደረው በ20 psi ግፊት በ~2800 ክስተቶች/ሰከንድ ፍጥነት በ100 μm ኖዝል በመጠቀም ነው። ባህላዊ የጌት መስፈርቶች (የሕዋስ መጠን፣ የቢሞዳል መድልዎ እና የመበታተን ባህሪያት) ከሌሎች የሕዋስ ዓይነቶች PNን በትክክል ማግለል ማረጋገጥ ስለማይችሉ፣ የጌት ስትራቴጂው የሚቀመጠው በmitoYFP+ ​​እና በመቆጣጠሪያ ሚቶYFP − አይጦች ውስጥ ባለው የYFP ጥንካሬ እና ራስ-ፍሎረሰንስ ቀጥተኛ ንፅፅር ላይ በመመስረት ነው። YFP ናሙናውን በ488 nm የሌዘር መስመር በማቃጠል ይደሰታል፣ ​​እና ምልክቱ የሚታወቀው በ530/30 nm ባንድ ማለፊያ ማጣሪያ ነው። በmitoYFP+ ​​አይጦች ውስጥ፣ የRosa26-mitoYFP ዘጋቢ ጂን አንጻራዊ ጥንካሬ የነርቭ አካልን እና የአክሰን ቁርጥራጮችን ለመለየትም ጥቅም ላይ ይውላል። 7-AAD በ561 nm ቢጫ ሌዘር ተደስቷል እና የሞቱ ሴሎችን ለማስወገድ በ675/20 nm ባንድፓስ ማጣሪያ ተገኝቷል። አስትሮሳይቶችን በተመሳሳይ ጊዜ ለመለየት የሴል እገዳው በACSA-2-APC ተቀባ፣ ከዚያም ናሙናው በ640 nm የሌዘር መስመር ተለጠፈ፣ እና ምልክቱን ለመለየት 660/20 nm ባንድፓስ ማጣሪያ ጥቅም ላይ ውሏል።
የተሰበሰቡት ሴሎች በሴንትሪፉጌሽን (1110 rpm፣ 5 ደቂቃዎች፣ 4°ሴ) ተቀርጸው ጥቅም ላይ እስኪውሉ ድረስ በ-80°ሴ ተከማችተዋል። የMfn2cKO አይጦች እና የድመት ቡችሎቻቸው የአሠራር ተለዋዋጭነትን ለመቀነስ በተመሳሳይ ቀን ይመደባሉ። የFACS የውሂብ አቀራረብ እና ትንተና የተከናወነው የFlowJo ሶፍትዌር (FlowJo LLC፣ Ashland፣ Oregon፣ USA) በመጠቀም ነው።
ከላይ እንደተጠቀሰው (59)፣ ቅጽበታዊ PCR ዲኤንኤ ከተደረደሩ የነርቭ ሴሎች ለቀጣይ የmtDNA መጠን ለመለየት ይጠቅማል። መስመራዊነት እና የወሰን ትብነት መጀመሪያ ላይ በተለያዩ የሕዋሶች ብዛት ላይ qPCR በማስኬድ ተፈትነዋል። ባጭሩ፣ 50 mM tris-HCl (pH 8.5)፣ 1 mM EDTA፣ 0.5% Tween 20 እና ፕሮቲንሴዝ K (200 ng/ml) የያዘ የሊሲስ ቋት ውስጥ 300 PN ይሰብስቡ እና በ55°ሴ ለ120 ደቂቃዎች በ55°ሴ ያቀዘቅዙ። ህዋሶቹ የፕሮቲንሴዝ K ሙሉ በሙሉ እንዳይነቃቁ ለማረጋገጥ በ95°ሴ ለ10 ደቂቃዎች ተጨማሪ ታክማን ፕሮቤሽን (Thermo Fisher) በመጠቀም mtDNA በ7900HT Real-Time PCR ስርዓት (Thermo Fisher Scientific) ውስጥ በግማሽ-ኳንቲቲቲቭ PCR ተለክቷል። ሳይንስ፣ የካታሎግ ቁጥር Mm04225274_s1)፣ mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific፣ የካታሎግ ቁጥር AIVI3E8) እና 18S (Thermo Fisher Scientific፣ የካታሎግ ቁጥር Hs99999901_s1) ጂኖች።
የፕሮቲን ናሙና ዝግጅት። መፍትሄውን በ95°ሴ ለ10 ደቂቃዎች በማሞቅ እና በሊሲስ ቋት ውስጥ በማሞቅ [6 M ጉዋኒዲን ክሎራይድ፣ 10 mM ትሪስ(2-ካርቦክሲኢቲል) ፎስፊን ሃይድሮክሎራይድ፣ 10 mM ክሎሮአሲኤታሚድ እና 100 mM ትሪስ-ላይሴ የቀዘቀዘ የነርቭ እንክብሎች በHCl ውስጥ]። በባዮሩፕተር (ዲያጀኖድ) ላይ ለ10 ደቂቃዎች (30 ሰከንዶች የልብ ምት / 30 ሰከንዶች የአፍታ ቆይታ)። ናሙናው በ20 mM ትሪስ-ኤችሲኤል (pH 8.0) ውስጥ 1:10 ተበርዟል፣ ከ300 ng ትራይፕሲን ወርቅ (ፕሮሜጋ) ጋር ተቀላቅሎ፣ እና ሙሉ መፈጨት ለማግኘት በ37°ሴ በአንድ ሌሊት ታቅፏል። በሁለተኛው ቀን ናሙናው በ20,000 ግራም ለ20 ደቂቃዎች ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። ሱፐርናታንቱ በ0.1% ፎርሚክ አሲድ ተበርዟል፣ እና መፍትሄው በራሱ በተዘጋጀው StageTips ጨው ተበርዟል። ናሙናው በ45°ሴ በSpeedVac መሳሪያ (Eppendorf concentrator plus 5305) ውስጥ ደርቋል፣ ከዚያም ፔፕቲዱ በ0.1% ፎርሚክ አሲድ ውስጥ ተንጠልጥሏል። ሁሉም ናሙናዎች በተመሳሳይ ሰው በተመሳሳይ ጊዜ ተዘጋጅተዋል። የአስትሮሳይት ናሙናዎችን ለመተንተን፣ 4 μg ዴሳልትድ ፔፕታይዶች በታንደም የጅምላ መለያ (TMT10plex፣ ካታሎግ ቁጥር 90110፣ Thermo Fisher Scientific) በ1፡20 የፔፕታይድ ወደ TMT reagent ጥምርታ ተሰይመዋል። ለTMT መለያ፣ 0.8 mg የTMT reagent በ70 μl አንሃይድሮስ ACN ውስጥ እንደገና ተሰቅሏል፣ እና የደረቀው ፔፕታይድ ወደ 9 μl 0.1 M TEAB (ትሪኤቲላሞኒየም ባይካርቦኔት) እንደገና ተቀላቅሏል፣ በዚህም በACN ውስጥ 7 μl የTMT reagent ተጨምሯል። ትኩረቱ 43.75% ነበር። ከ60 ደቂቃዎች በኋላ፣ ምላሹ በ2 μl 5% ሃይድሮክሲላሚን ጠፍቷል። መለያ የተሰጣቸው ፔፕታይዶች ተሰብስበው፣ ደርቀው፣ እንደገና በ200μl 0.1% ፎርሚክ አሲድ (FA) ውስጥ እንደገና ተሰቅለው፣ ለሁለት ተከፍለው፣ ከዚያም በራስ-ሰር በተሰራ StageTips በመጠቀም ጨው ተጨምረዋል። ​​UltiMate 3000 እጅግ በጣም ከፍተኛ አፈፃፀም ፈሳሽ ክሮማቶግራፍ (UltiMate 3000 እጅግ በጣም ከፍተኛ አፈፃፀም ፈሳሽ ክሮማቶግራፍ) በመጠቀም፣ ከሁለቱ ግማሾች አንዱ በ1ሚሜ x 150ሚሜ Acquity ክሮማቶግራፊክ አምድ ላይ በ130Å1.7μm C18 ቅንጣቶች (ውሃዎች፣ የካታሎግ ቁጥር SKU: 186006935) በተሞላ (ውሃዎች፣ የካታሎግ ቁጥር SKU: 186006935) ላይ ተከፋፍሏል። Thermo Fisher Scientific)። ፔፕታይዶችን በ30μl/ደቂቃ የፍሰት ፍጥነት ይለያዩ፣ ከ1% እስከ 50% ቋት B ለ85 ደቂቃዎች በደረጃ ቅልመት 96 ደቂቃዎች፣ ከ50% እስከ 95% ቋት B ለ3 ደቂቃዎች፣ ከዚያም ለ95% ቋት B ለ8 ደቂቃዎች፤ ቋት ኤ 5% ACN እና 10 mM አሞኒየም ባይካርቦኔት (ABC) ሲሆን ቋት ቢ ደግሞ 80% ACN እና 10 mM ABC ነው። ክፍልፋዮችን በየ3 ደቂቃው ሰብስቡና በሁለት ቡድን (1 + 17፣ 2 + 18፣ ወዘተ) አጣምሯቸው በቫክዩም ሴንትሪፉጅ ውስጥ ያድርጓቸው።
የLC-MS/MS ትንተና። ለጅምላ ስፔክትሮሜትሪ፣ ፔፕታይዶች (ቁጥር r119.aq) በ25 ሴ.ሜ፣ 75 μm ውስጣዊ ዲያሜትር ባለው PicoFrit አናሊቲካል አምድ (አዲስ ተጨባጭ ሌንስ፣ የክፍል ቁጥር PF7508250) ላይ ተለያይተዋል፣ በ1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ መካከለኛ (ዶ/ር ሜይሽ፣ ምንት)፣ EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific፣ ጀርመን) የተገጠመላቸው። አምድ በ50°ሴ ተጠብቆ ቆይቷል። ባፈሮች A እና B በውሃ ውስጥ 0.1% ፎርሚክ አሲድ እና በ80% ACN ውስጥ 0.1% ፎርሚክ አሲድ በቅደም ተከተል ናቸው። ፔፕታይዶች ከ6% እስከ 31% ቋት B ለ65 ደቂቃዎች እና ከ31% እስከ 50% ቋት B ለ5 ደቂቃዎች በ200 nl/ደቂቃ ቅልመት ተለይተዋል። የተለቀቁት ፔፕታይዶች በኦርቢትራፕ Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ላይ ተተነተኑ። የፔፕታይድ ፕሪከርሰር m/z መለኪያ የሚከናወነው ከ350 እስከ 1500 ሜ/ዝ ባለው ክልል ውስጥ 120,000 ጥራት ባለው ነው። 27% መደበኛ የሆነ የግጭት ኃይልን በመጠቀም፣ ከ2 እስከ 6 የሚደርስ የኃይል መሙያ ሁኔታ ያለው በጣም ጠንካራው ፕሪከርሰር ለከፍተኛ ኃይል C ትራፕ ዲሶሲዬሽን (HCD) ክሊቫጅ ተመርጧል። የዑደቱ ጊዜ ወደ 1 ሰከንድ ተቀናብሯል። የፔፕታይድ ክፍልፋይ m/z እሴት በ 5 × 104 ትንሹን የAGC ኢላማ እና ከፍተኛው የ 86 ms መርፌ ጊዜን በመጠቀም በ ion ወጥመድ ውስጥ ተለክቷል። ከተበታተነ በኋላ ፕሪከርሰሩ ለ 45 ሰከንድ በተለዋዋጭ ማግለል ዝርዝር ውስጥ ተቀምጧል። በቲኤምቲ መለያ የተሰጣቸው ፔፕታይዶች በ50 ሴ.ሜ፣ 75 μm Acclaim PepMap አምድ (Thermo Fisher Scientific፣ ካታሎግ ቁጥር 164942) ላይ ተለያይተዋል፣ እና የፍልሰት ስፔክትራው በከፍተኛ መስክ ያልተመጣጠነ የሞገድ ቅርጽ አየኖች (FAIMS) መሳሪያዎች (Thermo Fisher Scientific) በተገጠመለት ኦርቢትራፕ ሉሞስ ትሪብሪድ የጅምላ ስፔክትሮሜትር (Thermo Fisher Scientific) ላይ ተተነተነ። በማመሳሰል ቅድመ-ሁኔታው ላይ በመመስረት የተመረጠው MS3 ለTMT ሪፖርት የአዮን ምልክት መለኪያ ጥቅም ላይ ይውላል። የፔፕታይድ መለያየት የተከናወነው በEASY-nLC 1200 ላይ ሲሆን 90% መስመራዊ ቀስ በቀስ ኤሉሽን በመጠቀም ከ6% እስከ 31% የቋት ክምችት አለው፤ ቋት A 0.1% FA ነበር፣ እና ቋት B 0.1% FA እና 80% ACN ነበር። የትንታኔው አምድ በ50°ሴ ይሰራል። የመጀመሪያውን ፋይል በFAIMS የካሳ ቮልቴጅ መሰረት ለመከፋፈል ፍሪስታይል (ስሪት 1.6፣ Thermo Fisher Scientific) ይጠቀሙ።
የፕሮቲን መለየት እና መጠን። የተቀናጀ የአንድሮሜዳ የፍለጋ ሞተርን በመጠቀም፣ የመጀመሪያው መረጃ የተተነተነው MaxQuant ስሪት 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) በመጠቀም ነው። ከAequorea victoria የተገኙትን የCre recombinase እና YFP ቅደም ተከተሎችን በተጨማሪ፣ የፔፕታይድ ቁርጥራጭ ስፔክትራ የመዳፊት ማጣቀሻ ፕሮቲኦም ቀኖናዊ ቅደም ተከተል እና የኢሶፎርም ቅደም ተከተል (ፕሮቲኦም ID UP000000589፣ ከUniProt በግንቦት 2017 የወረደ) ተፈልጓል። የሜቲዮኒን ኦክሳይድ እና የፕሮቲን N-ተርሚናል አሲቲሌሽን እንደ ተለዋዋጭ ማሻሻያዎች ተቀምጠዋል፤ የሳይስቴይን ካርባሞይል ሜቲሌሽን እንደ ቋሚ ማሻሻያዎች ተቀምጧል። የምግብ መፈጨት መለኪያዎች ወደ “specificity” እና “trypsin/P” ተቀምጠዋል። ለፕሮቲን መለያነት የሚያገለግሉት ዝቅተኛው የፔፕታይዶች እና የሬዘር ፔፕታይዶች ብዛት 1 ነው፤ ዝቅተኛው ልዩ የፔፕታይዶች ብዛት 0 ነው። በፔፕታይድ ካርታ ማመሳሰል ሁኔታዎች ስር፣ የፕሮቲን መለያ መጠን 0.01 ነበር። “ሁለተኛው ፔፕታይድ” አማራጭ ነቅቷል። በተለያዩ የመጀመሪያ ፋይሎች መካከል የተሳኩ መለያዎችን ለማስተላለፍ "በሩጫዎች መካከል ማዛመድ" የሚለውን አማራጭ ይጠቀሙ። ከመለያ-ነጻ መጠን (LFQ) (60) የLFQ ዝቅተኛውን ጥምርታ ብዛት 1 ይጠቀሙ። የLFQ ጥንካሬ በእያንዳንዱ የጊዜ ነጥብ ቢያንስ በአንድ የጂኖታይፕ ቡድን ውስጥ ቢያንስ ሁለት ትክክለኛ እሴቶችን ያጣራል፣ እና ከ0.3 ስፋት ካለው መደበኛ ስርጭት የተወሰደ እና ወደ 1.8 ዝቅ ይላል። የLFQ ውጤቶችን ለመተንተን የፐርሴስ የኮምፒውተር መድረክ (https://maxquant.net/perseus/) እና R (https://r-project.org/) ይጠቀሙ። ለልዩ አገላለጽ ትንተና (61) የሊማ ሶፍትዌር ፓኬጅ ባለ ሁለት መንገድ መካከለኛ የቲ ሙከራ ጥቅም ላይ ውሏል። የዳሰሳ መረጃ ትንተና የሚከናወነው ggplot፣ FactoMineR፣ factoextra፣ GGally እና pheatmap በመጠቀም ነው። በTMT ላይ የተመሠረተ ፕሮቲዮሚክስ መረጃ የተተነተነው MaxQuant ስሪት 1.6.10.43 በመጠቀም ነው። በሴፕቴምበር 2018 ከወረደው የዩኒፕሮት የሰው ፕሮቲኦሚክስ የውሂብ ጎታ ጥሬ የፕሮቲኦሚክስ መረጃን ይፈልጉ። ትንታኔው በአምራቹ የቀረበውን የኢሶቶፕ ንፅህና ማስተካከያ ፋክተርን ያካትታል። ለልዩነት አገላለጽ ትንተና በR ውስጥ ሊማ ይጠቀሙ። የመጀመሪያው መረጃ፣ የውሂብ ጎታ ፍለጋ ውጤቶች እና የውሂብ ትንተና የስራ ፍሰት እና ውጤቶች ሁሉም በPRIDE አጋር ማከማቻ በኩል በPRIDE አጋር ማከማቻ በኩል ይቀመጣሉ። የውሂብ ስብስብ መለያ PXD019690።
ተግባራዊ ማብራሪያዎች ትንተናውን ያበለጽጋሉ። የኢንጀኒቲ ፓዝዌይ ትንተና (QIAGEN) መሳሪያ በ8 ሳምንታት ውስጥ የተቀመጠው የውሂብ ተግባራዊ የማብራሪያ ቃላት ብልጽግናን ለመወሰን ጥቅም ላይ ውሏል (ምስል 1)። በአጭሩ፣ ከLC-MS/MS (ታንደም ማሰስ ስፔክትሮሜትሪ) የውሂብ ትንተና የተገኘው የቁጥር ፕሮቲን ዝርዝር ከሚከተሉት የማጣሪያ መስፈርቶች ጋር ጥቅም ላይ ይውላል፡- Mus musculus እንደ ዝርያ እና ዳራ ተመርጧል፣ እና ምድቡ በቤንጃሚን ለ0.05 ወይም ከዚያ በታች ለማበልጸግ የተስተካከለው P እሴት ጉልህ እንደሆነ ይቆጠራል። ለዚህ ግራፍ፣ በተስተካከለው P እሴት ላይ በመመስረት በእያንዳንዱ ክላስተር ውስጥ ያሉ አምስት ከመጠን በላይ ምድቦች ይታያሉ። የቤንጃሚን፣ የክሪገር እና የየኩቲሊ ባለ ሁለት ደረጃ መስመራዊ የማበልጸጊያ ፕሮግራምን በመጠቀም በርካታ የቲ-ሙከራ ዘዴዎችን በመጠቀም፣ የቤንጃሚን፣ የክሪገር እና የየኩቲሊ (Q = 5%) ባለ ሁለት ደረጃ መስመራዊ የማበልጸጊያ ፕሮግራምን በመጠቀም፣ የጊዜ ኮርስ የፕሮቲን አገላለጽ ትንተና በእያንዳንዱ ምድብ ውስጥ በተለዩት አስፈላጊ እጩዎች ላይ ይከናወናል፣ እና እያንዳንዱ ረድፍ ለብቻው ይተነተናል። ወጥ የሆነ SD መቀበል አያስፈልግም።
የዚህን ጥናት ውጤቶች ከታተሙ የውሂብ ጎታዎች ጋር ለማነፃፀር እና በስእል 1 ላይ የቬን ዲያግራም ለማመንጨት፣ የቁጥር ፕሮቲን ዝርዝሩን ከMitoCarta 2.0 ማብራሪያዎች (24) ጋር አጣምረናል። ዲያግራሙን ለማውጣት የመስመር ላይ መሳሪያውን Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) በመጠቀም ይጠቀሙ።
ለፕሮቲዮሚክስ ትንተና ጥቅም ላይ ስለሚውሉ የስታቲስቲክስ ሂደቶች ዝርዝር መረጃ ለማግኘት፣ እባክዎን ተጓዳኝ የቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ክፍልን ይመልከቱ። ለሌሎች ሙከራዎች ሁሉ፣ ዝርዝር መረጃ በተዛማጅ አፈ ታሪክ ውስጥ ይገኛል። ሌላ ካልተገለጸ በስተቀር፣ ሁሉም መረጃዎች እንደ አማካኝ ± SEM ይገለጻሉ፣ እና ሁሉም የስታቲስቲክስ ትንታኔዎች የተከናወኑት በ GraphPad Prism 8.1.2 ሶፍትዌር ነው።
ለዚህ ጽሑፍ ተጨማሪ ቁሳቁሶችን ለማግኘት እባክዎ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ን ይመልከቱ።
ይህ በCreative Commons Attribution-Non-Commercial License ውል መሠረት የተሰራጨ ክፍት መዳረሻ ያለው ጽሑፍ ሲሆን የመጨረሻው አጠቃቀም ለንግድ ጥቅም ካልሆነ እና የመጀመሪያው ስራ ትክክል ከሆነ በማንኛውም ሚዲያ ውስጥ መጠቀም፣ ማሰራጨት እና ማባዛት ያስችላል። ማጣቀሻ።
ማሳሰቢያ፡ የኢሜይል አድራሻዎን እንዲያቀርቡ የምንጠይቅዎት እርስዎ ለገጹ የሚመክሩት ሰው ኢሜይሉን እንዲያዩት እንደሚፈልጉ እና አይፈለጌ መልዕክት እንዳልሆነ እንዲያውቅ ብቻ ነው። ምንም አይነት የኢሜይል አድራሻዎችን አንይዝም።
ይህ ጥያቄ ጎብኚ መሆንዎን ለመፈተሽ እና በራስ-ሰር የአይፈለጌ መልዕክት ማስገባትን ለመከላከል ይጠቅማል።
በ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ላርሰን
የአካል ጉዳተኛ የነርቭ ሴሎች ፕሮቲዮሚክስ ትንተና እንደሚያሳየው የሜታቦሊክ ፕሮግራሞች የነርቭ ሥርዓትን ለመከላከል ይንቀሳቀሳሉ።
በ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ላርሰን
የአካል ጉዳተኛ የነርቭ ሴሎች ፕሮቲዮሚክስ ትንተና እንደሚያሳየው የሜታቦሊክ ፕሮግራሞች የነርቭ ሥርዓትን ለመከላከል ይንቀሳቀሳሉ።
©2020 የአሜሪካ የሳይንስ እድገት ማህበር። ሁሉም መብቶች የተጠበቁ ናቸው. AAAS የHINARI፣ AGORA፣ OARE፣ CHORUS፣ CLOCKSS፣ CrossRef እና COUNTER አጋር ነው። ScienceAdvances ISSN 2375-2548.