Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ውጤት፣ የአሳሽዎን አዲስ ስሪት እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን ያሰናክሉ)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጥ ወይም ጃቫስክሪፕት እያሳየን ነው።
ፕሮፒዮኒክ አሲድ (PPA) እንደ ኦቲዝም ስፔክትረም ዲስኦርደር ባሉ የነርቭ ልማት ችግሮች ውስጥ የሚቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ሚናን ለማጥናት ይጠቅማል። PPA የማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስን፣ ሜታቦሊዝምን እና የለውጥ ለውጥን እንደሚያስተጓጉል ይታወቃል። ሆኖም፣ የፒኤፒኤ (PPA) በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ፣ ፊሽን እና ውህደት ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በእነዚህ ዘዴዎች ውስብስብ የጊዜያዊ ተፈጥሮ ምክንያት ችግር ውስጥ ገብቷል። እዚህ፣ ፒኤፒኤ (PPA) በነርቭ-መሰል SH-SY5Y ሴሎች ውስጥ በማይቶኮንድሪያል ultrastructure፣ ሞርፎሎጂ እና ተለዋዋጭነት ላይ እንዴት ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ለመመርመር ተጓዳኝ የቁጥር ምስል ቴክኒኮችን እንጠቀማለን። ፒኤፒኤ (5 mM) በማይቶኮንድሪያል አካባቢ (p < 0.01)፣ በፌሬት ዲያሜትር እና ዙሪያ (p < 0.05) እና በአካባቢ 2 (p < 0.01) ላይ ጉልህ የሆነ ቅነሳ አስከትሏል። የሚቶኮንድሪያል ክስተት አመልካች ትንተና በፊሽን እና በፉዥን ክስተቶች ላይ ከፍተኛ ጭማሪ (p < 0.05) አሳይቷል፣ በዚህም በውጥረት ሁኔታዎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ኔትወርክን ታማኝነት ይጠብቃል። በተጨማሪም፣ የcMYC (p < 0.0001)፣ NRF1 (p < 0.01)፣ TFAM (p < 0.05)፣ STOML2 (p < 0.0001) እና OPA1 (p < 0.05) mRNA አገላለጽ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል። 01)። ይህ በውጥረት ሁኔታዎች ውስጥ ተግባሩን ለመጠበቅ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ፣ ባዮጄኔሲስ እና ተለዋዋጭነት እንደገና መገንባትን ያሳያል። መረጃዎቻችን ፒኤፒኤ በማይቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነት ላይ ስላለው ተጽእኖ አዲስ ግንዛቤ ይሰጣሉ እና በማይቶኮንድሪያል ውጥረት ምላሾች ውስጥ የተሳተፉትን ውስብስብ የቁጥጥር ዘዴዎችን ለማጥናት የምስል ቴክኒኮችን ጥቅም ያጎላሉ።
ሚቶኮንድሪያ በኢነርጂ ምርት እና ባዮሲንተሲስ ውስጥ ከተለመዱት ሚናዎች ባሻገር በተለያዩ የሴሉላር ተግባራት ውስጥ ዋና ተዋናዮች ናቸው። ሚቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም የካልሲየም ምልክት ማድረጊያ፣ ሜታቦሊዝም እና ሬዶክስ ሆሞስታሲስ፣ የኢንፍላማቶሪ ምልክት ማድረጊያ፣ የኤፒጄኔቲክ ማሻሻያዎች፣ የሴል መስፋፋት፣ ልዩነት እና በፕሮግራም የተቀመጠ የሴል ሞት1 ቁልፍ ተቆጣጣሪ ነው። በተለይም፣ ሚቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም ለነርቭ እድገት፣ ለመትረፍ እና ተግባር ወሳኝ ሲሆን በተለያዩ የነርቭ በሽታ ምልክቶች ላይ በስፋት ይሳተፋል2,3,4።
ባለፉት አስርት ዓመታት ውስጥ፣ የሜታቦሊክ ሁኔታ የነርቭ ጅኔሲስ፣ የልዩነት፣ የብስለት እና የፕላስቲክነት ማዕከላዊ ተቆጣጣሪ ሆኖ ብቅ ብሏል5,6። በቅርብ ጊዜ፣ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና ዳይናሚክስ በተለይም አስፈላጊ የሆኑ የሚቶሲስ ክፍሎች ሆነዋል፣ ይህም በሴሎች ውስጥ ጤናማ ሚቶኮንድሪያል ክምችትን የሚጠብቅ ተለዋዋጭ ሂደት ነው። የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ የሚቆጣጠረው ከማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ እና ባዮኢነርጂቲክስ እስከ ሚቶኮንድሪያል ፊሽን፣ ፊውዥን፣ ትራንስፖርት እና ክሊራንስ 7,8 ባሉ ውስብስብ እርስ በርስ ጥገኛ መንገዶች ነው። ከእነዚህ የተዋሃዱ ዘዴዎች ውስጥ ማናቸውንም መቋረጥ ጤናማ የማይቶኮንድሪያል ኔትወርኮችን ጥገና ያደናቅፋል እና ለነርቭ ልማት ጥልቅ ተግባራዊ ውጤቶች አሉት9,10። በእርግጥም፣ የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ አለመቆጣጠር በብዙ የአእምሮ፣ የነርቭ ነርቭ እና የነርቭ ልማት ችግሮች ውስጥ ይታያል፣ የኦቲዝም ስፔክትረም ዲስኦርደርስ (ASD) 11,12።
ASD ውስብስብ የጄኔቲክ እና የኤፒጄኔቲክ አርክቴክቸር ያለው የተለያየ የነርቭ ልማት መዛባት ነው። የASD ውርስ አጠራጣሪ አይደለም፣ ነገር ግን መሰረታዊው የሞለኪውላር ኢቶሎጂ በደንብ አልተረዳም። ከቅድመ ክሊኒካዊ ሞዴሎች፣ ክሊኒካዊ ጥናቶች እና ባለብዙ-ኦሚክስ ሞለኪውላር የውሂብ ስብስቦች የተገኙ መረጃዎች በASD13,14 ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር እየጨመረ የመጣ ማስረጃ ይሰጣሉ። ቀደም ሲል በASD በሽተኞች ቡድን ውስጥ ጂኖም-አቀፍ የዲኤንኤ ሜቲሌሽን ምርመራ አድርገናል እና በማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም መንገዶች ላይ የተሰባሰቡ የተለያዩ ሜቲሌላይዝድ ጂኖችን ለይተናል15። በመቀጠልም የማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ እና ዳይናሚክስ ማዕከላዊ ተቆጣጣሪዎች ልዩነት ሜቲሌሽን ሪፖርት አድርገናል፣ ይህም በASD16 ውስጥ ከጨመረው የ mtDNA ቅጂ ቁጥር እና ከተለወጠ የሽንት ሜታቦሊዝም መገለጫ ጋር የተቆራኘ ነው። መረጃችን የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ እና ሆሞስታሲስ በASD ፓቶፊዚዮሎጂ ውስጥ ማዕከላዊ ሚና እንደሚጫወቱ የሚያሳይ እየጨመረ የሚሄድ ማስረጃ ይሰጣል። ስለዚህ፣ በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ፣ ሞርፎሎጂ እና ተግባር መካከል ያለውን ግንኙነት ሜካኒስቲክ ግንዛቤ ማሻሻል በሁለተኛ ደረጃ ሚቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ተለይተው በሚታወቁ የነርቭ በሽታዎች ላይ ቀጣይነት ያለው ምርምር ቁልፍ ግብ ነው።
ሞለኪውላዊ ቴክኒኮች ብዙውን ጊዜ በሚቶኮንድሪያል የጭንቀት ምላሾች ውስጥ የተወሰኑ ጂኖች ሚናን ለማጥናት ያገለግላሉ። ሆኖም፣ ይህ አካሄድ በሚቶኮንድሪያል የቁጥጥር ዘዴዎች ባለብዙ ገጽታ እና ጊዜያዊ ተፈጥሮ ሊገደብ ይችላል። ከዚህም በላይ፣ በተለይም የተወሰነ ቁጥር ያላቸው ጂኖች በተለምዶ ስለሚተነተኑ፣ የ mitochondrial ጂኖች ልዩነት አገላለጽ የተግባር ለውጦች ቀጥተኛ ያልሆነ አመላካች ነው። ስለዚህ፣ የማይቶኮንድሪያል ተግባርን እና ባዮኢነርጂቲክስን ለማጥናት የበለጠ ቀጥተኛ ዘዴዎች ቀርበዋል17. የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ከማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጋር በቅርበት የተቆራኘ ነው። የማይቶኮንድሪያል ቅርፅ፣ ግንኙነት እና መዋቅር ለኃይል ምርት እና ለማቶኮንድሪያል እና ለሴል ህልውና ወሳኝ ናቸው5,18። ከዚህም በላይ፣ የሚቶሲስ የተለያዩ ክፍሎች በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ለውጦች ላይ ያተኩራሉ፣ ይህም እንደ ጠቃሚ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር የመጨረሻ ነጥቦች ሆነው ሊያገለግሉ እና ለቀጣይ ሜካኒስቲክ ጥናቶች መሠረት ሊሆኑ ይችላሉ።
የሚቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ በቀጥታ በትራንስሚሽን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) በመጠቀም ሊታይ ይችላል፣ ይህም የሴሉላር አልትራስተሩክሽን ዝርዝር ጥናት ያስችላል። TEM በሴል ህዝብ ውስጥ በጂን ግልባጭ፣ በፕሮቲን አገላለጽ ወይም በማይቶኮንድሪያል ተግባራዊ መለኪያዎች ላይ ብቻ ከመመካት ይልቅ የ mitochondrial cristae ሞርፎሎጂ፣ ቅርፅ እና መዋቅር በቀጥታ በግለሰብ ሚቶኮንድሪያ መፍትሄ ላይ በዓይነ ሕሊናው ይሳያል17,19,20። በተጨማሪም፣ TEM በማይቶኮንድሪያ እና በሌሎች ኦርጋኔሎች መካከል ያሉ ግንኙነቶችን ጥናት ያመቻቻል፣ እነዚህም እንደ ኢንዶፕላስሚክ ሬቲኩለም እና አውቶፋጎሶሞች፣ እነዚህም በማይቶኮንድሪያ ተግባር እና ሆሞስታሲስ21,22 ውስጥ ቁልፍ ሚና ይጫወታሉ። ስለዚህ፣ ይህ TEM በተወሰኑ መንገዶች ወይም ጂኖች ላይ ከማተኮርዎ በፊት የማይቶኮንድሪያል ዲስኩርን ለማጥናት ጥሩ መነሻ ያደርገዋል። የማይቶኮንድሪያ ተግባር ከኒውሮፓቶሎጂ ጋር የበለጠ ተዛማጅ እየሆነ ሲሄድ፣ በብልቃጥ ውስጥ የማይቶኮንድሪያ ሞርፎሎጂ እና ተለዋዋጭነት በቀጥታ እና በቁጥር ማጥናት መቻል ግልጽ ፍላጎት አለ።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ፣ በኦቲዝም ስፔክትረም ዲስኦርደር ውስጥ በሚቶኮንድሪያል ዲስኩር ነርቭ ሞዴል ውስጥ በሚቶኮንድሪያል ዲስኩር ሞዴሊንግ ውስጥ የሚቶኮንድሪያል ዲስኩር ሞዴሊንግ እንመረምራለን። ቀደም ሲል የፕሮፒዮኒል-ኮአ ካርቦክሲላዝ ቤታ (PCCB) ልዩነት ሜቲሌሽን ሪፖርት አድርገናል፣ ይህም በማይቶኮንድሪያል ፕሮፒዮኒል-ኮአ ካርቦክሲላዝ ኢንዛይም PCC ንዑስ ክፍል ነው። የፒሲሲ አለመቆጣጠር ፕሮፒዮኒል ተዋጽኦዎችን መርዛማ ክምችት እንደሚያመጣ ይታወቃል፣ ፕሮፒዮኒል አሲድ (PPA)23,24,25ን ጨምሮ። ፒፒኤ የነርቭ ሜታቦሊዝምን እንደሚያስተጓጉል እና በቪቮ ውስጥ ባህሪን እንደሚቀይር ታይቷል፣ እና በASD26,27,28 ውስጥ የተሳተፉ የነርቭ ልማት ዘዴዎችን ለማጥናት የተቋቋመ የእንስሳት ሞዴል ነው። በተጨማሪም፣ ፒፒኤ በማይቶኮንድሪያል ዲስኩር አቅምን፣ ባዮጄኔሲስን እና የመተንፈሻ አካላትን በብልቃጥ ውስጥ እንደሚያስተጓጉል ሪፖርት ተደርጓል፣ እና በነርቭ ሴሎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዲስኩር ሞርፎሎጂን ለመምሰል በስፋት ጥቅም ላይ ውሏል29,30። ሆኖም፣ በፒፒኤ ምክንያት የሚፈጠረው የማይቶኮንድሪያል ዲስኩር በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና ዲስኩር ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በደንብ አልተረዳም።
ይህ ጥናት በSH-SY5Y ሴሎች ውስጥ ባለው የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ፣ ተለዋዋጭነት እና ተግባር ላይ የፒኤፒኤ ተጽእኖዎችን ለመለካት ተጓዳኝ የምስል ቴክኒኮችን ይጠቀማል። በመጀመሪያ፣ በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና በአልትራስትሩክቸር17,31,32 ላይ ለውጦችን በዓይነ ሕሊናችን ለማየት የቲኤም ዘዴ አዘጋጅተናል። የማይቶኮንድሪያል33 ተለዋዋጭ ባህሪን ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ በፒኤኤፍ ውጥረት ስር ባለው የፊሽን እና የፊውዥን ክስተቶች፣ በማይቶኮንድሪያል ቁጥር እና መጠን መካከል ያለውን ሚዛን ለመለካት የማይቶኮንድሪያል ክስተት ሎካላይዘር (MEL) ትንተና ተጠቅመናል። በመጨረሻም፣ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና ተለዋዋጭነት በባዮጄኔሲስ፣ በፊሽን እና በፊውዥን ውስጥ በተሳተፉ ጂኖች አገላለጽ ላይ ከሚደረጉ ለውጦች ጋር የተቆራኙ መሆናቸውን መርምረናል። አንድ ላይ ተዳምረን መረጃችን የማይቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነትን የሚቆጣጠሩትን ዘዴዎች ውስብስብነት የማብራራት ተግዳሮትን ያሳያል። የቲኤምኢን ማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን በSH-SY5Y ሴሎች ውስጥ ሊለካ የሚችል የማይቶኮንድሪያል መጨረሻ ነጥብ አድርጎ በማጥናት ረገድ ያለውን ጥቅም እናጎላለን። በተጨማሪም፣ የቲኤምኢ መረጃ ለሜታቦሊክ ጭንቀት ምላሽ የሚሰጡ ተለዋዋጭ ክስተቶችን ከሚይዙ የምስል ቴክኒኮች ጋር ሲጣመር እጅግ በጣም ጥሩውን መረጃ እንደሚሰጥ እናጎላለን። የነርቭ ሴሎችን ሚቶሲስ የሚደግፉ የሞለኪውላር ተቆጣጣሪ ዘዴዎች ተጨማሪ መግለጫ የነርቭ ሥርዓትን እና የነርቭ በሽታዎችን በሚቶኮንድሪያል ክፍል ላይ ጠቃሚ ግንዛቤ ሊሰጥ ይችላል።
የማይቶኮንድሪያል ጭንቀትን ለማነሳሳት፣ የSH-SY5Y ሴሎች በ3 mM እና 5 mM ሶዲየም ፕሮፒዮኔት (NaP) በመጠቀም በPPA ታክመዋል። ከTEM በፊት፣ ናሙናዎች ከፍተኛ ግፊት ባለው ማቀዝቀዣ እና ማቀዝቀዣ በመጠቀም ለክሪዮጀኒክ ናሙና ዝግጅት ተዳርገዋል (ምስል 1a)። በሦስት ባዮሎጂካል ቅጂዎች ላይ የማይቶኮንድሪያል ህዝቦችን ስምንት ሞርፎሎጂካል መለኪያዎችን ለመለካት አውቶማቲክ የሆነ የማይቶኮንድሪያል ምስል ትንተና ቧንቧ ገንብተናል። የፒኤፒኤ ሕክምና አራት መለኪያዎችን በከፍተኛ ሁኔታ እንደለወጠ ደርሰንበታል፡ አካባቢ 2፣ ስፋት፣ ዙሪያ እና የፌሬት ዲያሜትር (ምስል 1b–e)። አካባቢ 2 በ3 mM እና 5 mM የፒኤፒኤ ሕክምና (p = 0.0183 እና p = 0.002 በቅደም ተከተል) በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 1b)፣ አካባቢ (p = 0.003)፣ ዙሪያ (p = 0.0106) እና የፌሬት ዲያሜትር ሁሉም በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሰዋል። ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነጻጸር በ5 mM የሕክምና ቡድን ውስጥ ጉልህ የሆነ ቅነሳ (p = 0.0172) ታይቷል (ምስል 1c–e)። በአካባቢው እና በዙሪያው ላይ ጉልህ የሆነ ቅነሳ እንደሚያሳየው በ5 mM PPA የታከሙ ህዋሶች ትንሽ፣ የበለጠ ክብ ሚቶኮንድሪያ እንደነበራቸው እና እነዚህ ሚቶኮንድሪያ ከቁጥጥር ህዋሶች ውስጥ ካሉት ያነሰ ርዝመት እንዳላቸው ያሳያል። ይህ ደግሞ በፌሬት ዲያሜትር ላይ ከፍተኛ ቅነሳ ጋር የሚጣጣም ነው፣ ይህም በቅንጣት ጠርዞች መካከል ያለውን ትልቁን ርቀት መቀነስን የሚያመለክት ገለልተኛ መለኪያ ነው። በክሪስታይ እጅግ በጣም መዋቅር ላይ የተደረጉ ለውጦች ታይተዋል፡ ክሪስታኢው በፒኤፒኤ ውጥረት ተጽዕኖ ስር ብዙም ግልጽ አልሆነም (ምስል 1a፣ ፓነል B)። ሆኖም፣ ሁሉም ምስሎች የክሪስታይን እጅግ በጣም አወቃቀር በግልጽ አላንጸባረቁም፣ ስለዚህ የእነዚህ ለውጦች መጠናዊ ትንተና አልተከናወነም። እነዚህ የTEM መረጃዎች ሶስት ሊሆኑ የሚችሉ ሁኔታዎችን ሊያንፀባርቁ ይችላሉ፡ (1) ፒኤፒኤ መበታተንን ያጎላል ወይም ውህደትን ይከለክላል፣ ይህም አሁን ያለው ሚቶኮንድሪያ በመጠን እንዲቀንስ ያደርጋል፤ (2) የተሻሻለ ባዮጄኔሲስ አዲስ፣ ትንሽ ሚቶኮንድሪያ ይፈጥራል ወይም (3) ሁለቱንም ዘዴዎች በአንድ ጊዜ ያነሳሳል። እነዚህ ሁኔታዎች በቲኤምኢ ሊለዩ ባይችሉም፣ ጉልህ የሆኑ የሞርፎሎጂ ለውጦች በፒኤፒኤ ውጥረት ስር በሚቶኮንድሪያል ሆሞስታሲስ እና ተለዋዋጭነት ላይ ለውጦችን ያመለክታሉ። በመቀጠልም እነዚህን ተለዋዋጭነቶች እና ከስር ያሉትን ሊሆኑ የሚችሉ ዘዴዎችን የበለጠ ለመግለጽ ተጨማሪ መለኪያዎችን ዳስሰናል።
የፕሮፒዮኒክ አሲድ (PPA) የ mitochondrial ሞርፎሎጂን እንደገና ያወጣል። (ሀ) የሚቶኮንድሪያል መጠን እንደሚቀንስ እና ሚቶኮንድሪያል መጠን እንደሚቀንስ የሚያሳዩ የተወካይ ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) ምስሎች የፒኤፒአይ ሕክምናን በመጨመር ያነሱ እና የበለጠ ክብ እንደሚሆኑ ያሳያሉ፤ 0 mM (ያልታከመ)፣ 3 mM እና 5 mM በቅደም ተከተል። ቀይ ቀስቶች ሚቶኮንድሪያን ያመለክታሉ። (ለ–ሠ) በፒኤፒአይ የታከሙ SH-SY5Y ሴሎች ለቲኤምኢ ተዘጋጅተው ውጤቶቹ በፊጂ/ምስልጄ በመጠቀም ተተነተኑ። ከስምንቱ መለኪያዎች ውስጥ አራቱ በቁጥጥር (ያልታከመ፣ 0 mM PPA) እና በታከሙ (3 mM እና 5 mM PPA) ሴሎች መካከል ጉልህ ልዩነቶችን አሳይተዋል። (ለ) ክልል 2፣ (ሐ) አካባቢ፣ (መ) ፔሪሜትር፣ (ሠ) የፌሬት ዲያሜትር። ጉልህ ልዩነቶችን ለመወሰን የልዩነት (ቁጥጥር ከህክምና ጋር) እና የዱንኔት ባለብዙ ንፅፅር ሙከራ የአንድ አቅጣጫ ትንተና (p < 0.05) ጥቅም ላይ ውለዋል። የውሂብ ነጥቦች ለእያንዳንዱ ነጠላ ሕዋስ አማካይ ሚቶኮንድሪያል እሴትን ይወክላሉ፣ እና የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± SEMን ይወክላሉ። የሚታየው መረጃ n = 3ን ይወክላል፣ ቢያንስ 24 ሴሎችን በአንድ ድግግሞሽ፤ በአጠቃላይ 266 ምስሎች ተተነተኑ፤ * የሚያመለክተው p < 0.05፣ ** p < 0.01ን ነው።
ሚቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ለፒኤፒኤ እንዴት ምላሽ እንደሚሰጥ የበለጠ ለመግለጽ፣ ሚቶኮንድሪያንን በቴትራሜቲልሮዳሚን ኤቲል ኤስተር (TMRE) ቀለም ቀባን እና በ3 እና 5 mM PPA ከ24 ሰዓታት በኋላ ሚቶኮንድሪያንን አካባቢያዊ ለማድረግ እና ለመለካት የጊዜ-ጊዜ ማይክሮስኮፒ እና የMEL ትንተና ተጠቅመናል። የፊሽን እና የውህደት ክስተቶች አያያዝ። (ምስል 2a)። የኤምኤል ትንተና ከተደረገ በኋላ ሚቶኮንድሪያን የማይቶኮንድሪያል መዋቅሮችን ብዛት እና አማካይ መጠናቸውን ለመለካት ተጨማሪ ተተንትነዋል። ከፊሽን [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] እና ፊሽን [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] እና ፊሽን [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ክስተቶች ጋር ሲነጻጸር በ5 mM ላይ የሚከሰቱ የፊሽን ክስተቶች ብዛት ትንሽ ግን ጉልህ ጭማሪ አስተውለናል (ምስል 3ለ)። የ mitochondria ቁጥር በሁለቱም በ3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] እና 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ምስል 3c)፣ የእያንዳንዱ ማይቶኮንድሪያል መዋቅር አማካይ መጠን ግን ሳይለወጥ ቆይቷል (ምስል 3c)። 3d)። ይህ አንድ ላይ ሲወሰድ፣ የማይቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነት እንደገና መገንባት የማይቶኮንድሪያል ኔትወርክን ትክክለኛነት በተሳካ ሁኔታ የሚጠብቅ የማካካሻ ምላሽ ሆኖ ያገለግላል። በ3 mM PPA ላይ የመለያየት ክስተቶች ቁጥር መጨመር የሚቶኮንድሪያል ቁጥር መጨመር በከፊል በማይቶኮንድሪያል ፊሽዮን ምክንያት እንደሆነ ይጠቁማል፣ ነገር ግን አማካይ የማይቶኮንድሪያል መጠን በመሠረቱ ሳይለወጥ ስለሚቆይ፣ ባዮጄኔሲስ እንደ ተጨማሪ የማካካሻ ምላሽ ሊገለል አይችልም። ሆኖም፣ እነዚህ መረጃዎች በ TEM ከሚታዩት ትናንሽ፣ ክብ ማይቶኮንድሪያል መዋቅሮች ጋር የሚጣጣሙ ሲሆኑ በ PPA ምክንያት በሚመጡት የማይቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነት ላይ ጉልህ ለውጦችን ያሳያሉ።
ፕሮፒዮኒክ አሲድ (PPA) የኔትወርክ ታማኝነትን ለመጠበቅ ተለዋዋጭ ሚቶኮንድሪያል ማሻሻያ እንዲፈጠር ያደርጋል። የSH-SY5Y ሴሎች ተቀርፀው፣ በ3 እና 5 mM PPA ለ24 ሰዓታት ታክመዋል እና በTMRE እና Hoechst 33342 ቀለም የተቀቡ እና በመቀጠልም የMEL ትንተና ተሰጥቷቸዋል። (ሀ) ለእያንዳንዱ ሁኔታ በጊዜ 2 (t2) ላይ ቀለም እና የሁለትዮሽ ከፍተኛ ጥንካሬ ትንበያዎችን የሚያሳዩ የሚወክሉ የጊዜ-ማለፊያ ማይክሮስኮፒ ምስሎች። በእያንዳንዱ ሁለትዮሽ ምስል ውስጥ የተገለጹ የተመረጡ ክልሎች በጊዜ ሂደት ተለዋዋጭነትን ለማሳየት በሦስት የተለያዩ የጊዜ ክፈፎች (t1-t3) ተሻሽለው በ3D ይታያሉ፤ የውህደት ክስተቶች በአረንጓዴ ተደምቀዋል፤ የፊሽን ክስተቶች በአረንጓዴ ተደምቀዋል። በቀይ ይታያሉ። (ለ) በአንድ ሁኔታ አማካይ ተለዋዋጭ ክስተቶች ብዛት። (ሐ) በሴል አማካይ የማይቶኮንድሪያል መዋቅሮች ብዛት። (መ) በሴል ውስጥ የእያንዳንዱ የማይቶኮንድሪያል መዋቅር አማካይ መጠን (µm3)። የሚታየው መረጃ በአንድ የሕክምና ቡድን ውስጥ n = 15 ሴሎችን ይወክላል። የሚታዩት የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± SEM፣ የመለኪያ አሞሌ = 10 μm፣ * p < 0.05 ይወክላሉ።
ፕሮፒዮኒክ አሲድ (PPA) ከማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጋር የተያያዙ ጂኖችን የትራንስክሪፕሽን እገዳ ያስከትላል። የSH-SY5Y ሴሎች ለ24 ሰዓታት በ3 እና 5 mM PPA ታክመዋል። አንጻራዊ የጂን መጠን RT-qPCR በመጠቀም ተከናውኖ ወደ B2M መደበኛ ሆኗል። ሚቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ ጂኖች (a) cMYC፣ (b) TFAM፣ (c) NRF1 እና (d) NFE2L2። ሚቶኮንድሪያል ፉዥን እና ፊሽን ጂኖች (e) STOML2፣ (f) OPA1፣ (g) MFN1፣ (h) MFN2 እና (i) DRP1 ተፈትነዋል። ጉልህ ልዩነቶች (p < 0.05) በአንድ አቅጣጫ ANOVA (ቁጥጥር vs. ሕክምና) እና የዱንኔት ባለብዙ ንጽጽር ሙከራ ተፈትነዋል፡ * p < 0.05፣ ** p < 0.01 ያመለክታል፣ እና **** p < 0.0001 ያመለክታል። አሞሌዎች አማካይ አገላለጽን ± SEM ይወክላሉ። የሚታየው መረጃ n = 3 (STOML2፣ OPA1፣ TFAM)፣ n = 4 (cMYC፣ NRF1፣ NFE2L2) እና n = 5 (MFN1፣ MFN2፣ DRP1) ባዮሎጂያዊ ድግግሞሾችን ይወክላል።
ከTEM እና MEL የተገኙ መረጃዎች ፒኤፒኤ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን እና ተለዋዋጭነትን እንደሚቀይር ያመለክታሉ። ሆኖም ግን፣ እነዚህ የምስል ቴክኒኮች እነዚህን ሂደቶች የሚያንቀሳቅሱትን መሰረታዊ ዘዴዎች ግንዛቤ አይሰጡም። ስለዚህ ለፒኤፒኤ ሕክምና ምላሽ ለመስጠት የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ፣ ባዮጄኔሲስ እና ሚቶሲስ ዘጠኝ ቁልፍ ተቆጣጣሪዎች የኤምአርኤንኤ አገላለጽ መርምረናል። የሴል ማይሎማ ኦንኮጂን (cMYC)፣ የኑክሌር የመተንፈሻ አካላት ፋክተር (NRF1)፣ የማይቶኮንድሪያል ትራንስክሪፕሽን ፋክተር 1 (TFAM)፣ NFE2-እንደ ትራንስክሪፕሽን ፋክተር BZIP (NFE2L2)፣ ጋስቲሪን-እንደ ፕሮቲን 2 (STOML2)፣ የኦፕቲካል ነርቭ እየመነመኑ 1 (OPA1)፣ ሚቶፉሲን 1 (MFN1)፣ ሚቶፉሲን 2 (MFN2) እና ከዳይናሚን ጋር የተያያዘ ፕሮቲን 1 (DRP1) ከ24 ሰዓታት በኋላ ለካን። 3 mM (p = 0.0053፣ p = 0.0415 እና p < 0.0001፣ በቅደም ተከተል) እና 5 mM (p = 0.0031፣ p = 0.0233፣ p < 0.0001) የPPA ሕክምናን ተመልክተናል። (ምስል 3a–c)። የኤምአርኤንኤ አገላለጽ መቀነስ በመጠን ላይ የተመሰረተ ነበር፡ የcMYC፣ NRF1 እና TFAM አገላለጽ በቅደም ተከተል በ3 mM በ5.7፣ 2.6 እና 1.9 ጊዜ ቀንሷል፣ እና በ5 mM በ11.2፣ 3 እና 2.2 ጊዜ ቀንሷል። በአንጻሩ፣ ማዕከላዊው የሬዶክስ ባዮጄኔሲስ ጂን NFE2L2 በማንኛውም የPPA ክምችት አልተለወጠም፣ ምንም እንኳን ተመሳሳይ መጠን ላይ የተመሰረተ የመቀነስ አዝማሚያ ቢታይም (ምስል 3d)።
እንዲሁም በፍሳሽ እና በፍሳሽ ቁጥጥር ውስጥ የተሳተፉትን የክላሲካል ጂኖች አገላለጽ መርምረናል። STOML2 በፍሳሽ፣ በማይቶፋጂ እና በባዮጄኔሲስ ውስጥ እንደሚሳተፍ ይታሰባል፣ እና አገላለጹ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (p < 0.0001) በ3 mM (2.4-እጥፍ ለውጥ) እና 5 mM (2.8-እጥፍ ለውጥ) PPA (ምስል 1)። 3d)። በተመሳሳይ፣ የOPA1 የፍሳሽ ጂን አገላለጽ በ3 mM (1.6-እጥፍ ለውጥ) እና 5 mM (1.9-እጥፍ ለውጥ) PPA (p = 0.006 እና p = 0.0024 በቅደም ተከተል) ቀንሷል (ምስል 3f)። ሆኖም፣ በ24-ሰዓት PPA ውጥረት ውስጥ በፍሳሽ ጂኖች MFN1፣ MFN2 ወይም በፍሳሽ ጂን DRP1 አገላለጽ ላይ ጉልህ ልዩነቶችን አላገኘንም (ምስል 3g–i)። በተጨማሪም፣ የአራት ውህደት እና የፊሽን ፕሮቲኖች (OPA1፣ MFN1፣ MFN2 እና DRP1) ደረጃዎች በተመሳሳይ ሁኔታዎች ውስጥ እንዳልተለወጡ ደርሰንበታል (ምስል 4a–d)። እነዚህ መረጃዎች በአንድ ጊዜ ውስጥ አንድ ነጥብ የሚያንፀባርቁ መሆናቸውን እና በPPA ውጥረት የመጀመሪያ ደረጃዎች ወቅት በፕሮቲን አገላለጽ ወይም በእንቅስቃሴ ደረጃዎች ላይ ለውጦችን ላያንፀባርቁ እንደሚችሉ ልብ ማለት አስፈላጊ ነው። ሆኖም፣ በcMYC፣ NRF1፣ TFAM፣ STOML2 እና OPA1 አገላለጽ ላይ ጉልህ ቅነሳዎች የማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም፣ ባዮጄኔሲስ እና ዳይናሚክስ ላይ ጉልህ የሆነ የትራንስክሪፕሽን መዛባት ያመለክታሉ። በተጨማሪም፣ እነዚህ መረጃዎች በማይቶኮንድሪያል ተግባር ውስጥ የመጨረሻ-ሁኔታ ለውጦችን በቀጥታ ለማጥናት የምስል ቴክኒኮችን ጥቅም ያጎላሉ።
የፕሮፒዮኒክ አሲድ (PPA) ሕክምና ከተደረገ በኋላ የፉዥን እና የፊሽን ፋክተር ፕሮቲን መጠን አልተለወጠም። የSH-SY5Y ሴሎች ለ24 ሰዓታት በ3 እና 5 mM PPA ታክመዋል። የፕሮቲን ደረጃዎች በዌስተርን ብሎት ትንተና ተለክተዋል፣ እና የመግለፅ ደረጃዎች ወደ አጠቃላይ ፕሮቲን መደበኛ ሆነዋል። አማካይ የፕሮቲን አገላለጽ እና የዒላማ እና የጠቅላላ ፕሮቲን ተወካይ የምዕራባዊ ነጠብጣቦች ይታያሉ። a – OPA1፣ b – MFN1፣ c – MFN2፣ d – DRP1። አሞሌዎች አማካይ ± SEMን ይወክላሉ፣ እና የሚታየው መረጃ የn = 3 ባዮሎጂካል ቅጂዎችን ይወክላሉ። በርካታ ንጽጽሮች (p < 0.05) የተከናወኑት የአንድ አቅጣጫ ልዩነት ትንተና እና የዱንኔት ሙከራን በመጠቀም ነው። የመጀመሪያው ጄል እና ብሎት በምስል S1 ውስጥ ይታያሉ።
የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ከሜታቦሊክ፣ የልብና የደም ቧንቧ እና የጡንቻ በሽታዎች እስከ የነርቭ በሽታዎች1,10 ድረስ ካሉ ባለብዙ ስርዓት በሽታዎች ጋር የተቆራኘ ነው። ብዙ የነርቭ እና የነርቭ በሽታዎች ከማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር ጋር የተቆራኙ ሲሆኑ፣ እነዚህ ኦርጋኔሎች በአንጎል የህይወት ዘመን ውስጥ ያላቸውን ጠቀሜታ ያጎላሉ። እነዚህ በሽታዎች የፓርኪንሰን በሽታ፣ የአልዛይመር በሽታ እና ASD3,4,18 ያካትታሉ። ሆኖም፣ እነዚህን በሽታዎች ለማጥናት የአንጎል ቲሹ ማግኘት አስቸጋሪ ነው፣ በተለይም በሜካኒካል ደረጃ፣ የሴሉላር ሞዴል ስርዓቶችን አስፈላጊ አማራጭ ያደርገዋል። በዚህ ጥናት፣ በኒዩሮናል በሽታዎች ውስጥ የሚታየውን የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደርን እንደገና ለማጤን በPPA የታከመ SH-SY5Y ሴሎችን በመጠቀም የሴሉላር ሞዴል ስርዓት እንጠቀማለን፣ በተለይም በኦቲዝም ስፔክትረም ዲስኦርደርስ። ይህንን የፒኤፒኤ ሞዴል በኒውሮንስ ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስን ለማጥናት መጠቀም የASDን መንስኤ ግንዛቤ ሊሰጥ ይችላል።
በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ላይ ለውጦችን ለማየት TEMን የመጠቀም እድልን ዳስሰናል። TEM ውጤታማነቱን ከፍ ለማድረግ በትክክል ጥቅም ላይ መዋል እንዳለበት ልብ ማለት አስፈላጊ ነው። የክሪዮ-ናሙናዎች ዝግጅት በአንድ ጊዜ የሴሉላር ክፍሎችን በማስተካከል እና የቅርሶች መፈጠርን በመቀነስ የነርቭ መዋቅሮችን በተሻለ ሁኔታ ለመጠበቅ ያስችላል34. ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የነርቭ-መሰል SH-SY5Y ሴሎች ያልተበላሹ ንዑስ ሴሉላር ኦርጋኔሎች እና የተራዘሙ ሚቶኮንድሪያ እንዳላቸው አስተውለናል (ምስል 1a)። ይህ በኒውሮናል ሴል ሞዴሎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን ለማጥናት የክሪዮጄኒክ ዝግጅት ቴክኒኮችን ጠቀሜታ ያጎላል። ምንም እንኳን የቁጥር መለኪያዎች የTEM መረጃን ተጨባጭ ትንተና ለማድረግ ወሳኝ ቢሆኑም፣ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ለውጦችን ለማረጋገጥ ምን ልዩ መለኪያዎች መለካት እንዳለባቸው አሁንም ምንም መግባባት የለም። በቁጥር የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ17,31,32 ላይ ባደረጉ በርካታ ጥናቶች ላይ በመመስረት፣ ስምንት የሞርፎሎጂ መለኪያዎችን የሚለካ አውቶማቲክ የማይቶኮንድሪያል ምስል ትንተና ቧንቧ ገንብተናል፣ እነሱም፡ አካባቢ፣ አካባቢ2፣ የገጽታ ጥምርታ፣ ፔሪሜትር፣ ክብ ቅርጽ፣ ዲግሪ፣ የፌሬት ዲያሜትር እና ክብ ቅርጽ።
ከእነዚህም መካከል፣ PPA የቦታ 2፣ ስፋት፣ ዙሪያ እና የፌሬት ዲያሜትር በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 1ለ–ሠ)። ይህም ሚቶኮንድሪያ ትንሽ እና የበለጠ ክብ እየሆነ መምጣቱን አሳይቷል፣ ይህም ከPPA30 የተነሳው ሚቶኮንድሪያ ውጥረት ለ72 ሰዓታት ከተከሰተ በኋላ በሚቶኮንድሪያ አካባቢ መቀነስን ከሚያሳዩት ቀደም ሲል ከተደረጉ ጥናቶች ጋር የሚጣጣም ነው። እነዚህ ሞርፎሎጂካል ባህሪያት ሚቶኮንድሪያላንስ ፊሽንን ሊያመለክቱ ይችላሉ፣ ይህም የተበላሹ ክፍሎችን ከማይቶኮንድሪያላንስ ኔትወርክ ውስጥ በመያዝ በሚቶኮንዲሪያል ኔትወርክ ውስጥ በመበላሸታቸው ምክንያት በሚቶኮንዲሪያል 35,36,37 በኩል እንዲወድቁ ለማድረግ አስፈላጊ ሂደት ነው። በሌላ በኩል፣ አማካይ የማይቶኮንድሪያላንስ መጠን መቀነስ ከባዮጄኔሲስ መጨመር ጋር ሊዛመድ ይችላል፣ ይህም አነስተኛ አዲስ የሚወጣ ሚቶኮንድሪያ እንዲፈጠር ያደርጋል። የጨመረው የስብራት ወይም የባዮጄኔሲስ መጨመር ሚቶኮንድሪያላንስ ውጥረትን ለመከላከል ሚቶኮንድሪያላንስን ለመጠበቅ የማካካሻ ምላሽን ይወክላል። ሆኖም፣ የቀነሰ የማይቶኮንድሪያ እድገት፣ የተዳከመ ውህደት ወይም ሌሎች ሁኔታዎች ሊገለሉ አይችሉም።
በTEM የተፈጠሩ ከፍተኛ ጥራት ያላቸው ምስሎች በግለሰብ ሚቶኮንድሪያ ደረጃ የሞርፎሎጂ ባህሪያትን ለመወሰን ቢፈቅዱም፣ ይህ ዘዴ በአንድ ጊዜ ባለ ሁለት ገጽታ ቅጽበታዊ ገጽ እይታዎችን ያመነጫል። ለሜታቦሊክ ውጥረት ተለዋዋጭ ምላሾችን ለማጥናት፣ ሚቶኮንድሪያንን በTMRE ቀለም ቀባን እና የጊዜ-ጊዜ ማይክሮስኮፒን ከMEL ትንተና ጋር ተጠቅመናል፣ ይህም በጊዜ ሂደት በሚቶኮንድሪያ ኔትወርክ ውስጥ ለውጦችን በከፍተኛ ፍጥነት የሚያሳይ 3D እይታን ያስችላል33,38። በPPA ውጥረት ስር በሚቶኮንድሪያ ዳይናሚክስ ውስጥ ስውር ግን ጉልህ ለውጦችን አስተውለናል (ምስል 2)። በ3 mM፣ የፍሰት ክስተቶች ብዛት በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል፣ የፍሰት ክስተቶች ግን በቁጥጥር ውስጥ እንደነበረው ተመሳሳይ ሆነው ቀጥለዋል። የፍሰት እና የፍሰት ክስተቶች ብዛት በ5 mM PPA ላይ ታይቷል፣ ነገር ግን እነዚህ ለውጦች በግምት ተመጣጣኝ ነበሩ፣ ይህም የፍሰት እና የፍሰት ኪነቲክስ በከፍተኛ ክምችት ሚዛን ላይ እንደሚደርሱ ይጠቁማል (ምስል 2ለ)። አማካይ ሚቶኮንድሪያ መጠን በሁለቱም በ3 እና 5 mM PPA ላይ ሳይለወጥ ቆይቷል፣ ይህም የሚቶኮንድሪያ ኔትወርክ ታማኝነት እንደተጠበቀ ያሳያል (ምስል 2d)። ይህ ተለዋዋጭ ሚቶኮንድሪያል ኔትወርኮች ለቀላል ሜታቦሊዝም ውጥረት ምላሽ የመስጠት ችሎታቸውን ያንፀባርቃል፣ የኔትወርክ መበታተን ሳያስከትሉ ሆሞስታሲስን ውጤታማ በሆነ መንገድ ለማቆየት። በ3 mM PPA፣ የስብራት መጨመር ወደ አዲስ ሚዛን ሽግግርን ለማበረታታት በቂ ነው፣ ነገር ግን በከፍተኛ የፒፒኤ ክምችት ምክንያት ለሚመጣው ጭንቀት ምላሽ ለመስጠት የበለጠ ጥልቅ የኪነቲክ እድሳት ያስፈልጋል።
የ mitochondria ቁጥር በሁለቱም የPPA የጭንቀት ክምችት ጨምሯል፣ ነገር ግን አማካይ የ mitochondrial መጠን በከፍተኛ ሁኔታ አልተለወጠም (ምስል 2ሐ)። ይህ ምናልባት በባዮጄኔሲስ መጨመር ወይም በመከፋፈል ምክንያት ሊሆን ይችላል፤ ሆኖም ግን፣ በአማካይ የ mitochondrial መጠን ጉልህ በሆነ መልኩ መቀነስ በማይኖርበት ጊዜ፣ ባዮሲንተሲስ የመጨመር እድሉ ከፍተኛ ነው። ሆኖም፣ በስእል 2 ላይ ያለው መረጃ ሁለት የማካካሻ ዘዴዎችን መኖር ይደግፋል፡- የፊሽን ክስተቶች ብዛት መጨመር፣ ከሚቶኮንድሪያል ፊሽን መጨመር ጋር የሚጣጣም እና የክስተቶች ብዛት መጨመር፣ ከማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ ጋር የሚጣጣም። በመጨረሻም፣ ለቀላል ጭንቀት ተለዋዋጭ ማካካሻ ፊሽን፣ ፊውዥን፣ ባዮጄኔሲስን እና ሚቶፋጊን የሚያካትቱ በተመሳሳይ ጊዜ ሂደቶችን ሊያካትት ይችላል። ምንም እንኳን ቀደምት ደራሲዎች PPA ሚቶሲስ30,39 እና ሚቶፋጊ29ን እንደሚያሻሽል ቢያሳዩም፣ ለPPA ምላሽ የ mitochondrial fission እና የፊውዥን ተለዋዋጭነት እንደገና ለመገንባት ማስረጃ እናቀርባለን። እነዚህ መረጃዎች በTEM የተስተዋሉትን የሞርፎሎጂ ለውጦች ያረጋግጣሉ እና ከPPA-የተፈጠረ የ mitochondrial dysfunction ጋር የተያያዙ ዘዴዎችን የበለጠ ግንዛቤ ይሰጣሉ።
የTEMም ሆነ የMEL ትንተና በተስተዋሉት የሞርፎሎጂ ለውጦች ስር ያሉትን የጂን ተቆጣጣሪ ዘዴዎች ቀጥተኛ ማስረጃ ስላላቀረቡ፣ በማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም፣ ባዮጄኔሲስ እና ዳይናሚክስ ውስጥ የተሳተፉትን ጂኖች የአር ኤን ኤ አገላለጽ መርምረናል። የcMYC ፕሮቶ-ኦንኮጂን በማይቶኮንድሪያል፣ ግላይኮሊሲስ፣ አሚኖ አሲድ እና ፋቲ አሲድ ሜታቦሊዝም40 ቁጥጥር ውስጥ የተሳተፈ የትራንስክሪፕሽን ፋክተር ነው። በተጨማሪም፣ cMYC NRF1 እና TFAM41ን ጨምሮ በማይቶኮንድሪያል ግልባጭ፣ ትርጉም እና ውስብስብ ስብሰባ ውስጥ የተሳተፉ ወደ 600 የሚጠጉ ሚቶኮንድሪያል ጂኖችን አገላለጽ እንደሚቆጣጠር ይታወቃል። NRF1 እና TFAM ሁለት የሚቶኮንድሪያል ተቆጣጣሪዎች ሲሆኑ፣ mtDNA መባዛትን ለማግበር ከPGC-1α በታች ሆነው ይሰራሉ። ይህ መንገድ በcAMP እና AMPK ምልክት የሚነቃ ሲሆን ለኃይል ወጪ እና ለሜታቦሊክ ውጥረት ስሜታዊ ነው። እንዲሁም የፒኤፒኤ ውጤቶች በኦክሲዴቲቭ ውጥረት ሊተላለፉ ይችሉ እንደሆነ ለማወቅ የማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ የሬዶክስ ተቆጣጣሪ የሆነውን NFE2L2 መርምረናል።
ምንም እንኳን የNFE2L2 አገላለጽ ሳይለወጥ ቢቆይም፣ በ3 mM እና 5 mM PPA ሕክምና ከተደረገ በኋላ ለ24 ሰዓታት በcMYC፣ NRF1 እና TFAM አገላለጽ ላይ ወጥ የሆነ የመጠን ጥገኛ ቅናሽ አግኝተናል (ምስል 3a–c)። የcMYC አገላለጽ መቀነስ ቀደም ሲል ለማይቶኮንድሪያል ውጥረት42 ምላሽ እንደሆነ ሪፖርት ተደርጓል፣ እና በተቃራኒው የcMYC አገላለጽ መቀነስ የማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝምን፣ የኔትወርክ ግንኙነትን እና የሜምብራል ፖላራይዜሽን43ን በማደስ የማይቶኮንድሪያል ችግርን ሊያስከትል ይችላል። የሚገርመው ነገር፣ cMYC በማይቶኮንድሪያል ፊሽን እና ፊውዥን42,43 ቁጥጥር ውስጥም ይሳተፋል እና በሴል ክፍፍል44 ወቅት DRP1 ፎስፈረስሌሽን እና ሚቶኮንድሪያል አካባቢያዊነትን እንደሚጨምር እንዲሁም በኒውሮንያል ግንድ ሴሎች45 ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂካል እድሳትን እንደሚያስተካክል ይታወቃል። በእርግጥም፣ cMYC ጉድለት ያለባቸው ፋይብሮብላስትስ በPPA43 ውጥረት ምክንያት ከሚመጡ ለውጦች ጋር በሚስማማ መልኩ የሚቶኮንድሪያል መጠን መቀነስ ያሳያሉ። እነዚህ መረጃዎች በcMYC እና በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ መካከል አስደሳች ግን እስካሁን ግልጽ ያልሆነ ግንኙነትን ያሳያሉ፣ ይህም ለወደፊቱ የፒኤፒኤ ውጥረት-የተፈጠረ እድሳት ጥናቶች አስደሳች ኢላማ ይሰጣል።
የNRF1 እና የTFAM ቅነሳ cMYC እንደ አስፈላጊ የትራንስክሪፕሽን አክቲቪተር ሚና ጋር የሚጣጣም ነው። እነዚህ መረጃዎች ፒኤፒኤ በ22 ሰዓታት ውስጥ የNRF1 mRNA አገላለጽን እንደቀነሰ የሚያሳዩ ቀደም ሲል በሰው ልጅ የአንጀት ካንሰር ሴሎች ላይ ከተደረጉ ጥናቶች ጋር የሚጣጣሙ ናቸው፣ ይህም ከATP መሟጠጥ እና ከ ROS46 መጨመር ጋር የተያያዘ ነው። እነዚህ ደራሲዎች የTFAM አገላለጽ በ8.5 ሰዓታት እንደጨመረ ሪፖርት አድርገዋል ነገር ግን በ22 ሰዓታት ወደ መሰረታዊ ደረጃዎች ተመልሰዋል። በተቃራኒው፣ ኪም እና ሌሎች (2019) በSH-SY5Y ሴሎች ውስጥ ለ4 ሰዓታት የPPA ውጥረት ከተከሰተ በኋላ የTFAM mRNA አገላለጽ በከፍተኛ ሁኔታ እንደቀነሰ አሳይተዋል፤ ሆኖም ግን፣ ከ72 ሰዓታት በኋላ፣ የTFAM ፕሮቲን አገላለጽ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል እና የmtDNA ቅጂ ቁጥር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል። ስለዚህ፣ ከ24 ሰዓታት በኋላ የተመለከትናቸው የማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ ጂኖች ቁጥር መቀነስ የማይቶኮንድሪያል ብዛት መጨመር ቀደም ባሉት ጊዜያት ከባዮጄኔሲስ ማግበር ጋር የተያያዘ መሆኑን አያካትትም። ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት PPA በSH-SY5Y ሴሎች ውስጥ PGC-1α mRNA እና ፕሮቲን በ4 ሰዓት ከ30 ደቂቃ ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ያሻሽላል፣ ፕሮፒዮኒክ አሲድ ደግሞ በፒጂሲ-1α በኩል በጥጃ ሄፓቶሳይቶች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስን በ12 ሰዓት ከ39 ደቂቃ ውስጥ ያሳድጋል። የሚገርመው ነገር፣ PGC-1α የNRF1 እና TFAM ቀጥተኛ የትራንስክሪፕሽን ተቆጣጣሪ ብቻ ሳይሆን የMFN2 እና DRP1 እንቅስቃሴን በመቆጣጠር እና በመዋሃድ እንደሚቆጣጠር ታይቷል። አንድ ላይ ሲጠቃለል፣ ይህ በፒኤፒኤ ምክንያት የሚፈጠሩ የማይቶኮንድሪያል ማካካሻ ምላሾችን የሚቆጣጠሩ ዘዴዎችን በቅርበት ያጣምራል። ከዚህም በላይ፣ መረጃችን በፒኤፒኤ ውጥረት ስር የባዮጄኔሲስ እና የሜታቦሊዝም ግልባጭ ቁጥጥር ጉልህ የሆነ አለመመጣጠን ያንፀባርቃል።
የ STOML2፣ OPA1፣ MFN1፣ MFN2 እና DRP1 ጂኖች በማይቶኮንድሪያል ፊሽዮን፣ ፊውዥን እና ዳይናሚክስ ማዕከላዊ ተቆጣጣሪዎች መካከል ናቸው37,48,49። በሚቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ውስጥ የተሳተፉ ሌሎች ብዙ ጂኖች አሉ፣ ሆኖም ግን፣ STOML2፣ OPA1 እና MFN2 ቀደም ሲል በASD ቡድኖች ውስጥ በተለያየ መልኩ ሜቲላይትድ እንደሆኑ ተረጋግጧል፣16 እና በርካታ ገለልተኛ ጥናቶች በእነዚህ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች ላይ ለማይቶኮንድሪያል ውጥረት ምላሽ ለመስጠት ለውጦችን ሪፖርት አድርገዋል50,51። 52. የ OPA1 እና STOML2 አገላለጽ በ3 mM እና 5 mM PPA ሕክምና በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 3e፣ f)። OPA1 ከ MFN1 እና 2 ጋር በቀጥታ መስተጋብር በኩል ከሚቶኮንድሪያል ፊውዥን ክላሲካል ተቆጣጣሪዎች አንዱ ሲሆን በክሪስታኢ ማሻሻያ እና በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ53 ውስጥ ሚና ይጫወታል። የ STOML2 ትክክለኛ ሚና በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ውስጥ ግልጽ አይደለም፣ ነገር ግን ማስረጃዎች እንደሚያሳዩት በማይቶኮንድሪያል ፊውዥን፣ ባዮጄኔሲስ እና ሚቶፋጊ ውስጥ ሚና ይጫወታል።
STOML2 የማይቶኮንድሪያል የመተንፈሻ አካላት ትስስርን እና የመተንፈሻ ሰንሰለት ውህዶችን በመፍጠር ረገድ ይሳተፋል54,55 እና የካንሰር ሴሎችን የሜታቦሊክ ባህሪያት በእጅጉ እንደሚቀይር ታይቷል56። ጥናቶች እንደሚያሳዩት STOML2 ከ BAN እና ካርዲዮሊፒን ጋር በመተባበር የማይቶኮንድሪያል ሽፋን አቅምን እና ባዮጄኔሲስን ያበረታታል 55, 57, 58። በተጨማሪም፣ ገለልተኛ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በ STOML2 እና PINK1 መካከል ያለው መስተጋብር ሚቶፋጂ59,60ን ይቆጣጠራል። በተለይም፣ STOML2 ከ MFN2 ጋር በቀጥታ እንደሚገናኝ እና እንደሚያረጋጋ ሪፖርት ተደርጓል፣ እንዲሁም ለ OPA1 መበላሸት ተጠያቂ የሆነውን ፕሮቲሴስን በመከልከል ረጅም የ OPA1 ኢሶፎርሞችን በማረጋጋት ረገድ ትልቅ ሚና ይጫወታል53,61,62። በ PPA ምላሾች ውስጥ የሚታየው የ STOML2 አገላለጽ መቀነስ እነዚህን የውህደት ፕሮቲኖች በዩቢኪቲን እና ፕሮቲሶም ጥገኛ መንገዶች48 አማካኝነት ለመበስበስ የበለጠ ተጋላጭ ሊያደርጋቸው ይችላል። ምንም እንኳን STOML2 እና OPA1 ለPPA በተለዋዋጭ ምላሽ ውስጥ ያላቸው ትክክለኛ ሚና ግልጽ ባይሆንም፣ የእነዚህ የውህደት ጂኖች አገላለጽ መቀነስ (ምስል 3) በፍሳሽ እና በፍሳሽ መካከል ያለውን ሚዛን ሊያዛባ እና ወደ ሚቶኮንድሪያል መጠን መቀነስ ሊያመራ ይችላል (ምስል 3)። 1)።
በሌላ በኩል፣ የ OPA1 ፕሮቲን አገላለጽ ከ24 ሰዓታት በኋላ ሳይለወጥ ቆይቷል፣ የ MFN1፣ MFN2 ወይም DRP1 mRNA እና የፕሮቲን መጠን ከ PPA ሕክምና በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ አልተለወጠም (ምስል 3g-i፣ ምስል 4)። ይህ በማይቶኮንድሪያል ውህደት እና በፊሽን ውስጥ የተሳተፉትን እነዚህን ምክንያቶች በመቆጣጠር ላይ ምንም ለውጦች አለመኖራቸውን ሊያመለክት ይችላል። ሆኖም፣ እያንዳንዳቸው እነዚህ አራት ጂኖች የፕሮቲን እንቅስቃሴን የሚቆጣጠሩ በድህረ-ትራንስክሪፕት ማሻሻያዎች (PTMs) ቁጥጥር የሚደረግባቸው መሆናቸውን ልብ ሊባል ይገባል። OPA1 ሁለት የተለያዩ ኢሶፎርሞችን 63 ለማምረት በማይቶኮንድሪያል ውስጥ በፕሮቲዮሊቲክ የተከፋፈሉ ስምንት አማራጭ የስፕሊስ ልዩነቶች አሉት። በረጅም እና አጭር ኢሶፎርሞች መካከል ያለው ሚዛን በመጨረሻ በማይቶኮንድሪያል ውህደት እና በማይቶኮንድሪያል አውታረ መረብ 64 ጥገና ውስጥ የ OPA1ን ሚና ይወስናል። የ DRP1 እንቅስቃሴ የሚቆጣጠረው በካልሲየም/ካልሞዱሊን-ጥገኛ ፕሮቲን ኪናሴ II (CaMKII) ፎስፈረሌሽን ሲሆን የ DRP1 መበላሸት በ ubiquitination እና SUMOylation65 ቁጥጥር ይደረግበታል። በመጨረሻም፣ ሁለቱም DRP1 እና MFN1/2 GTPases ናቸው፣ ስለዚህ እንቅስቃሴ በማይቶኮንድሪያ 66 ውስጥ ባለው የጂቲፒ ምርት መጠን ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። ስለዚህ፣ የእነዚህ ፕሮቲኖች አገላለጽ ቋሚ ቢሆንም፣ ይህ ያልተስተካከለ የፕሮቲን እንቅስቃሴን ወይም አካባቢያዊነትን ላያንፀባርቅ ይችላል67,68። በእርግጥም፣ አሁን ያሉት የ PTM ፕሮቲን ሪዘርቬሽኖች ብዙውን ጊዜ አጣዳፊ የጭንቀት ምላሾችን ለማስታረቅ ኃላፊነት ያለው የመጀመሪያው የመከላከያ መስመር ሆነው ያገለግላሉ። በእኛ ሞዴል ውስጥ መካከለኛ የሜታቦሊክ ውጥረት በሚኖርበት ጊዜ፣ PTM የእነዚህን ጂኖች በ mRNA ወይም በፕሮቲን ደረጃ ተጨማሪ ማግበር ሳያስፈልግ የውህደት እና የፊሽን ፕሮቲኖች እንቅስቃሴ እንዲጨምር የሚያደርገው ዕድሉ ሰፊ ነው።
ከላይ የተጠቀሰው መረጃ አንድ ላይ ተዳምሮ የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ውስብስብ እና በጊዜ ላይ የተመሰረተ ቁጥጥርን እና እነዚህን ዘዴዎች በማብራራት ረገድ ያሉትን ተግዳሮቶች ያጎላል። የጂን አገላለጽን ለማጥናት በመጀመሪያ በመንገዱ ላይ የተወሰኑ ኢላማ ጂኖችን መለየት አስፈላጊ ነው። ሆኖም፣ መረጃዎቻችን እንደሚያሳዩት በተመሳሳይ መንገድ ላይ ያሉ ጂኖች ለተመሳሳይ ጭንቀት በተመሳሳይ መንገድ ምላሽ አይሰጡም። እንዲያውም፣ ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በተመሳሳይ መንገድ ውስጥ ያሉ የተለያዩ ጂኖች የተለያዩ የጊዜያዊ ምላሽ መገለጫዎችን ሊያሳዩ ይችላሉ። በተጨማሪም፣ በጽሑፍ እና በጂን ተግባር መካከል ያለውን ግንኙነት የሚያበላሹ ውስብስብ የድህረ-ትራንስክሪፕሽን ዘዴዎች አሉ። የፕሮቲዮሚክ ጥናቶች የ PTMs እና የፕሮቲን ተግባር ተጽእኖ ግንዛቤ ሊሰጡ ይችላሉ፣ ነገር ግን ዝቅተኛ የውጤት ዘዴዎችን፣ ከፍተኛ የምልክት-ወደ-ጫጫታ ጥምርታዎችን እና ደካማ ጥራትን ጨምሮ ተግዳሮቶችን ያስከትላሉ።
በዚህ አውድ፣ የቲኤም እና ኤምኤልን በመጠቀም የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂን ማጥናት በሚቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነት እና ተግባር መካከል ስላለው ግንኙነት እና ይህ በሽታን እንዴት እንደሚነካ መሰረታዊ ጥያቄዎችን ለመመለስ ትልቅ አቅም አለው። ከሁሉም በላይ ደግሞ፣ ቲኤም የማይቶኮንድሪያል ደካማነት እና ተለዋዋጭነት እንደ ኮንቬንቴንት መጨረሻ ነጥብ የሚለካ ቀጥተኛ ዘዴን ያቀርባል51። MEL እንዲሁም በሶስት-ልኬት ሴሉላር አካባቢ ውስጥ የመለያየት እና የውህደት ክስተቶችን በዓይነ ሕሊናችን ለማየት ቀጥተኛ ዘዴን ይሰጣል፣ ይህም በጂን አገላለጽ ላይ ለውጦች ባይኖሩም እንኳ ተለዋዋጭ የማይቶኮንድሪያል ዳግም ግንባታን መጠን እንዲለካ ያስችላል33። እዚህ ላይ በሁለተኛ ደረጃ ሚቶኮንድሪያል በሽታዎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ምስል ቴክኒኮችን ጥቅም እናጎላለን። እነዚህ በሽታዎች በተለምዶ አጣዳፊ የማይቶኮንድሪያል ጉዳት ሳይሆን በማይቶኮንድሪያል አውታረ መረቦች ስውር እድሳት በሚታወቀው ሥር የሰደደ መለስተኛ ሜታቦሊክ ውጥረት ተለይተው ይታወቃሉ። ሆኖም፣ በከባድ ውጥረት ስር ሚቶሲስን ለመጠበቅ የሚያስፈልገው የማይቶኮንድሪያል ካሳ ጥልቅ ተግባራዊ ውጤቶች አሉት። በነርቭ ሳይንስ አውድ ውስጥ፣ የእነዚህን የማካካሻ ዘዴዎች የተሻለ ግንዛቤ ከማይቶኮንድሪያል ደካማነት ጋር የተያያዘውን ፕሊዮትሮፒክ ኒውሮፓቶሎጂ አስፈላጊ መረጃ ሊሰጥ ይችላል።
በመጨረሻም፣ መረጃዎቻችን በጂን አገላለጽ፣ በፕሮቲን ማሻሻያዎች እና በነርቭ ማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ የሚቆጣጠሩ የፕሮቲን እንቅስቃሴ መካከል ያለውን ውስብስብ መስተጋብር ተግባራዊ ውጤት ለመረዳት የምስል ቴክኒኮችን ጠቀሜታ ያጎላሉ። በASD ውስጥ ስላለው ማይቶኮንድሪያል ክፍል ግንዛቤ ለማግኘት በነርቭ ሴል ሞዴል ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደርን ለመምሰል PPAን ተጠቅመናል። በPPA የታከሙ የSH-SY5Y ሴሎች በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ላይ ለውጦችን አሳይተዋል፡ ሚቶኮንድሪያ ትንሽ እና ክብ ሆነ፣ እና ክሪስታ በTEM ሲታዩ በደንብ አልተገለጹም። የMEL ትንተና እንደሚያሳየው እነዚህ ለውጦች የሚከሰቱት ለመለስተኛ ሜታቦሊዝም ውጥረት ምላሽ ለመስጠት የማይቶኮንድሪያል ኔትወርክን ለመጠበቅ ከስብራት እና ከውህደት ክስተቶች መጨመር ጋር ተያይዞ ነው። ከዚህም በላይ፣ PPA የማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም እና ሆሞስታሲስ የትራንስክሪፕሽን ደንብን በእጅጉ ያደናቅፋል። cMYC፣ NRF1፣ TFAM፣ STOML2 እና OPA1 በPPA ውጥረት የተስተጓጎሉ ቁልፍ የማይቶኮንድሪያል ተቆጣጣሪዎች እንደሆኑ ለይተናል እና በፒኤኤም ምክንያት የሚከሰቱ ለውጦችን በማቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና ተግባር በማስተባበር ረገድ ሚና ሊጫወቱ ይችላሉ። በጂን አገላለጽ እና በፕሮቲን እንቅስቃሴ፣ በአካባቢያዊነት እና በድህረ-ትርጉም ማሻሻያዎች ላይ በPPA ምክንያት የሚከሰቱ ጊዜያዊ ለውጦችን በተሻለ ሁኔታ ለመለየት የወደፊት ጥናቶች ያስፈልጋሉ። የእኛ መረጃ የማይቶኮንድሪያል የጭንቀት ምላሽን የሚያስታግሱ የቁጥጥር ዘዴዎች ውስብስብነት እና እርስ በርስ መተሳሰርን ያጎላል፣ እንዲሁም የTEM እና ሌሎች የምስል ቴክኒኮችን ለበለጠ ዒላማ የተደረጉ ሜካኒስቲክ ጥናቶች ያለውን ጥቅም ያሳያል።
የSH-SY5Y የሴል መስመር (ECACC፣ 94030304-1VL) የተገዛው ከሲግማ-አልድሪች ነው። የSH-SY5Y ሴሎች በዱልቤኮ የተሻሻለው የኢግል መካከለኛ/F-12 ንጥረ ነገር ድብልቅ (DMEM/F-12) እና L-ግሉታሚን (SC09411፣ ScienCell) ውስጥ በ25 ሴ.ሜ 2 ብልቃጦች ውስጥ በ20% የፅንስ የከብት ሴረም (FBS) (10493106፣ ThermoFisher Scientific) እና 1% ፔኒሲሊን-ስትሬፕቶማይሲን (P4333-20ML፣ Sigma-Aldrich) በ37 °C፣ 5% CO2 ተጨምረው ወደ 80% ኮንፍሉዌንሲ ተከፋፍለዋል። ሴሎች በ300 ግራም ሴንትሪፉጅድ ተደርገው በግምት 7 × 105 ሴሎች/ሚሊ ሊትር በሆነ ጥግግት ተሸፍነዋል። ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት በ19-22 ባሉት አንቀጾች መካከል ባሉት ያልተለዩ የSH-SY5Y ሴሎች ላይ ነው። PPA እንደ NaP ይሰጣል። የNaP ዱቄት (CAS ቁጥር 137-40-6፣ የኬሚካል ፎርሙላ C3H5NaO2፣ P5436-100G፣ Sigma-Aldrich) በሞቀ MilliQ ውሃ ውስጥ እስከ 1 M ክምችት ድረስ ይቀልጡት እና በ4 °C ያስቀምጡ። በሕክምናው ቀን፣ ይህንን መፍትሄ ከ1 M PPA እስከ 3 mM እና 5 mM PPA በሴረም-ነጻ መካከለኛ (DMEM/F-12 ከL-glutamine ጋር) ይቀልጡት። ለሁሉም ሙከራዎች የሕክምናው ክምችት PPA (0 mM፣ መቆጣጠሪያ)፣ 3 mM እና 5 mM PPA አልነበረም። ሙከራዎች ቢያንስ በሦስት ባዮሎጂካል ቅጂዎች ተካሂደዋል።
የSH-SY5Y ሴሎች በ25 ሴ.ሜ 5 ብልቃጦች ውስጥ በ5.5 × 105 ሴሎች/ሚሊ ሊትር ፍጥነት ተዘርተው ለ24 ሰዓታት አድገዋል። የፒፒኤ ሕክምናው ከ24 ሰዓታት በፊት ወደ ብልቃጡ ተጨምሯል። የሴል እንክብሎችን በተለመደው የአጥቢ እንስሳት ቲሹ ንዑስ ባህል ፕሮቶኮሎች (ከላይ እንደተገለጸው) ይሰብስቡ። የሴል እንክብሉን በ100 µl 2.5% ግሉታራልዴይድ፣ 1 × PBS ውስጥ እንደገና ያቆዩ እና እስኪሰራ ድረስ በ4 °C ያስቀምጡ። የSH-SY5Y ሴሎች ሴሎቹን ለመበጥበጥ እና 2.5% ግሉታራልዴይድ፣ 1 × PBS መፍትሄን ለማስወገድ ለአጭር ጊዜ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። ደለልን በተጣራ ውሃ ውስጥ በተዘጋጀ 4% አጋሮዝ ጄል ውስጥ እንደገና ያቆዩት (የአጋሮዝ እና የደለል መጠን ጥምርታ 1፡1 ነው)። የአጋሮዝ ቁርጥራጮች በጠፍጣፋ ሳህኖች ላይ በፍርግርግ ላይ ተቀምጠው ከፍተኛ ግፊት ከመቀዘቀዙ በፊት በ1-ሄክሳዴሴን ተሸፍነዋል። ናሙናዎቹ በ100% ደረቅ አሴቶን ውስጥ በ-90°ሴ ለ24 ሰዓታት ቀዝቅዘዋል። ከዚያም የሙቀት መጠኑ ወደ -80°ሴ ከፍ ብሏል እና 1% ኦስሚየም ቴትሮክሳይድ እና 0.1% ግሉታራዴይድ መፍትሄ ተጨምሯል። ናሙናዎቹ ለ24 ሰዓታት በ -80°ሴ ተቀምጠዋል። ከዚህ በኋላ የሙቀት መጠኑ ቀስ በቀስ ለብዙ ቀናት ወደ ክፍል ሙቀት ጨምሯል፡ ከ -80°ሴ እስከ -50°ሴ ለ24 ሰዓታት፣ እስከ -30°ሴ ለ24 ሰዓታት፣ እስከ -10°ሴ ለ24 ሰዓታት እና በመጨረሻም ወደ ክፍል ሙቀት።
ክሪዮጀኒክ ዝግጅት ከተደረገ በኋላ፣ ናሙናዎቹ በሬዚን ተሸፍነው እጅግ በጣም ቀጭን ክፍሎች (እስከ 100 nm) በሌይካ ሬይቸርት አልትራኩትኤስ አልትራማይክሮቶም (ሌይካ ማይክሮሲስተም) በመጠቀም ተሠርተዋል። ክፍሎቹ በ2% ዩራኒል አሲቴት እና በእርሳስ ሲትሬት ተቀርጸዋል። ናሙናዎቹ በ200 kV (Lab6 ማስተላለፊያ) የሚሰራ FEI Tecnai 20 ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (ThermoFisher (ቀደም ሲል FEI)፣ አይንሆቨን፣ ኔዘርላንድስ) እና ትሪዲየም የኢነርጂ ማጣሪያ የተገጠመለት የጋታን ሲሲዲ ካሜራ (ጋታን፣ ዩኬ) በመጠቀም ታይተዋል።
በእያንዳንዱ ቴክኒካል ቅጂ፣ ቢያንስ 24 ነጠላ የሕዋስ ምስሎች ተገኝተዋል፣ ይህም በአጠቃላይ 266 ምስሎች ነው። ሁሉም ምስሎች የተተነተኑት የክልል ፍላጎት (ROI) ማክሮ እና የሚቶኮንድሪያ ማክሮን በመጠቀም ነው። የማይቶኮንድሪያ ማክሮ በታተሙ ዘዴዎች17,31,32 ላይ የተመሰረተ ሲሆን በፊጂ/ImageJ69 ውስጥ የTEM ምስሎችን ከፊል-አውቶማቲክ ባች ሂደት ይፈቅዳል። ባጭሩ፡ ምስሉ የተገለበጠ እና የተገለበጠ የሚሽከረከር ኳስ ዳራ መቀነስ (60 ፒክስል ራዲየስ) እና የኤፍኤፍቲ ባንድፓስ ማጣሪያ (በቅደም ተከተል 60 እና 8 ፒክስል የላይኛው እና የታችኛው ወሰኖችን በመጠቀም) እና የ5% የአቅጣጫ መቻቻል ያለው ቀጥ ያለ መስመር መጨቆን በመጠቀም ነው። የተሰራው ምስል ከፍተኛውን የኢንትሮፒ ስልተ ቀመር በመጠቀም በራስ-ሰር ገደብ ይደረግበታል እና የሁለትዮሽ ጭምብል ይፈጠራል። በጥሬ TEM ምስሎች ውስጥ በእጅ ከተመረጡ ROIዎች ጋር የተያያዙ የምስል ክልሎች ተወስደዋል፣ ሚቶኮንድሪያን የሚለዩ እና የፕላዝማ ሽፋን እና ሌሎች ከፍተኛ ንፅፅር ክልሎችን አያካትትም። ለእያንዳንዱ የተወጣ ROI፣ ከ600 ፒክስል በላይ የሆኑ ሁለትዮሽ ቅንጣቶች ተተነተኑ፣ እና የቅንጣት ስፋት፣ ፔሪሜትር፣ ዋና እና ጥቃቅን ዘንጎች፣ የፌሬት ዲያሜትር፣ ክብነት እና ክብነት የተለኩት የፊጂ/ImageJ አብሮገነብ የመለኪያ ተግባራትን በመጠቀም ነው። ሜሪል፣ ፍሊፕፖ እና ስትራክ (2017)፣ አካባቢ 2፣ የቅንጣት ገጽታ ጥምርታ (ዋና እስከ ጥቃቅን የዘንግ ጥምርታ) እና የቅርጽ ፋክተር (FF)ን ተከትሎ ከእነዚህ መረጃዎች የተሰላ ሲሆን፣ FF = ፔሪሜትር 2/4ፒአይ x አካባቢ። የፓራሜትሪክ ቀመር ፍቺ በሜሪል፣ ፍሊፕፖ እና ስትራክ (2017) ውስጥ ይገኛል። የተጠቀሱት ማክሮዎች በጊትሃብ ላይ ይገኛሉ (የውሂብ ተገኝነት መግለጫን ይመልከቱ)። በአማካይ፣ በግምት 5,600 ቅንጣቶች በPPA ሕክምና ተተነተኑ፣ በአጠቃላይ ወደ 17,000 የሚጠጉ ቅንጣቶች (መረጃ አልታየም)።
የSH-SH5Y ሴሎች በአንድ ሌሊት እንዲጣበቁ በ8-ክፍል የባህል ምግቦች (ThermoFisher, #155411) ውስጥ ተቀምጠዋል ከዚያም በTMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) እና Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ይቀባሉ። ማቅለም። ምስሎቹ የተገኙት በ10 ደቂቃ አካባቢ ውስጥ በ405 nm እና 561 nm ሌዘር በመጠቀም ሲሆን ጥሬ ምስሎች የተገኙት በ12 ተከታታይ የጊዜ ነጥቦች ላይ በምስል ክፈፎች መካከል 0.2 μm የሆነ የaz ደረጃ ያላቸው 10 የምስል ማይክሮግራፎችን የያዙ z-stacks ሆነው ነው። ምስሎቹ የተሰበሰቡት በLCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 ሌንስ በመጠቀም በCarl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 ሱፐር-ሪዞሉሽን ፕላትፎርም (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) በመጠቀም ነው። ምስሎቹ ቀደም ሲል የተገለጸውን የቧንቧ መስመር እና የImageJ ተሰኪ በመጠቀም በImageJ ውስጥ የተተነተኑት የውህደት እና የፊሽን ክስተቶችን፣ አማካይ የ mitochondrial መዋቅሮችን ብዛት እና በሴል33 አማካይ የ mitochondrial መጠንን ለመለካት ነው። የMEL ማክሮዎች በGitHub ላይ ይገኛሉ (የውሂብ ተገኝነት መግለጫን ይመልከቱ)።
የSH-SY5Y ሴሎች ከህክምናው በፊት ለ24 ሰዓታት በ6-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ በ0.3 × 106 ሴሎች/mL ጥግግት ተበቅለዋል። አር ኤን ኤ በትንሹ ማሻሻያዎችን በማድረግ ፈጣን-RNA™ Miniprep ፕሮቶኮል (ZR R1055፣ Zymo Research) በመጠቀም ተወግዷል፡ ከማስወገድዎ በፊት በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 300 μl የRNA lysis buffer ይጨምሩ እና እያንዳንዱን ናሙና እንደ የመጨረሻ ደረጃ በ30 μl DNase/RNase exlution. -free ውሃ ያርቁ። ሁሉም ናሙናዎች በናኖድሮፕ ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer በመጠቀም ብዛትና ጥራት ተፈትሸዋል። ከሴል ሊሴቶች የተገኘው አጠቃላይ ፕሮቲን የተገኘው በ200 μl RIPA lysis buffer በመጠቀም ሲሆን የፕሮቲን ክምችት በብራድፎርድ ፕሮቲን ምርመራ70 በመጠቀም ተለካ።
የcDNA ውህደት የተከናወነው በአምራቹ መመሪያ መሰረት በቴትሮ™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043፣ ሜሪዲያን ባዮሳይንስ) በመጠቀም ሲሆን አንዳንድ ማሻሻያዎችን በማድረግ ነው። cDNA በ20-μl ግብረመልሶች ከ0.7 እስከ 1 μg አጠቃላይ አር ኤን ኤ በመጠቀም ተዋህዷል። ፕሪመሮች ቀደም ሲል ከታተሙ ወረቀቶች 42፣ 71፣ 72፣ 73፣ 74፣ 75፣ 76፣ 77፣ 78 (ሠንጠረዥ S1) ተመርጠዋል እና ተጓዳኝ መመርመሪያዎች የተነደፉት ከተቀናጀ የዲኤንኤ ቴክኖሎጂዎች የPrimerQuest መሣሪያ በመጠቀም ነው። ሁሉም የፍላጎት ጂኖች ወደ ኒውክሊየር B2M ጂን መደበኛ ተደርገዋል። የSTOML2፣ NRF1፣ NFE2L2፣ TFAM፣ cMYC እና OPA1 የጂን አገላለጽ በRT-qPCR ተለክቷል። ዋናው ድብልቅ LUNA Taq polymerase (M3003L፣ New England Biolabs)፣ 10 μM ወደፊት እና ተገላቢጦሽ ፕሪመሮች፣ cDNA እና PCR-ደረጃ ውሃ ያካተተ ሲሆን ይህም ለእያንዳንዱ ምላሽ የመጨረሻ መጠን 10 μL ያስገኛል። የመከፋፈል እና የፊስሽን ጂኖች (DRP1፣ MFN1/2) በTaqMan multiplex ምርመራዎች ተለክቷል። Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S፣ New England Biolabs) በአምራቹ መመሪያ መሰረት በትንሽ ማሻሻያዎች ጥቅም ላይ ውሏል። ባለብዙ መለኪያ RT-qPCR ዋና ድብልቅ 1X LUNA Taq polymerase፣ 10 μM ወደፊት እና ተገላቢጦሽ ፕሪመሮች፣ 10 μM ፕሮቤ፣ cDNA እና PCR-ደረጃ ውሃ ያካትታል፣ ይህም ለእያንዳንዱ ምላሽ የመጨረሻ መጠን 20 μL አስገኝቷል። RT-qPCR የተከናወነው በRotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—ተከታታይ ቁጥር፡ R0618110) በመጠቀም ነው። የብስክሌት ሁኔታዎች በሰንጠረዥ S1 ውስጥ ይታያሉ። ሁሉም የcDNA ናሙናዎች በሦስት እጥፍ ተባዝተው በአስር እጥፍ ዲሉሽን በመጠቀም መደበኛ ኩርባ ተፈጥረዋል። የውሂብ መባዛት 30,72ን ለማረጋገጥ በሶስት እጥፍ ናሙናዎች ውስጥ ያሉ ውጫዊ ናሙናዎች ከትንታኔው ተወግደዋል። አንጻራዊ የጂን አገላለጽ የተሰላው በ2-ΔΔCt79 ዘዴ ነው።
የፕሮቲን ናሙናዎች (60 μg) ከላኤምሊ የመጫኛ ቋት ጋር በ2፡1 ጥምርታ ተቀላቅለው በ12% ቀለም በሌለው የፕሮቲን ጄል (ባዮ-ራድ #1610184) ላይ ተተግብረዋል። ፕሮቲኖች የትራንስ-ብሎት ቱርቦ ሲስተም (#170-4155፣ ባዮ-ራድ) በመጠቀም ወደ PVDF (ፖሊቪኒሊዲን ፍሎራይድ) ሽፋን (#170-84156፣ ባዮ-ራድ) ተላልፈዋል። ሽፋኑ ታግዶ በተገቢው ዋና ፀረ እንግዳ አካላት (OPA1፣ MFN1፣ MFN2 እና DRP1) (1፡1000 የተቀላቀለ) ለ48 ሰዓታት ተጨምሮ፣ ከዚያም በሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት (1፡10,000) ለ1 ሰዓት ተጨምሯል። ከዚያም ሽፋኑ በክላሪቲ ዌስተርን ECL Substrate (#170-5061፣ ባዮ-ራድ) በመጠቀም ተቀርጿል እና በባዮ-ራድ ኬሚዶክ MP ሲስተም ተመዝግቧል። የImageLab ስሪት 6.1 ለዌስተርን ብሎት ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል። የመጀመሪያው ጄል እና ብሎት በስእል S1 ላይ ይታያሉ። ፀረ-ሰው መረጃ በሰንጠረዥ S2 ውስጥ ቀርቧል።
የውሂብ ስብስቦች ቢያንስ ሦስት ገለልተኛ ናሙናዎች አማካይ (SEM) አማካኝ እና መደበኛ ስህተት ሆነው ቀርበዋል። የውሂብ ስብስቦች የጋውሲያን ስርጭት እና እኩል መደበኛ ልዩነቶችን ከመገመትዎ በፊት እና ትንታኔዎቹን ከመቀጠልዎ በፊት የሻፒሮ-ዊልክስ ፈተናን (ሌላ ካልተገለጸ በስተቀር) በመጠቀም ለመደበኛነት ተፈትነዋል። የውሂብ ስብስቡን በፊሸር MEL LSD (p < 0.05)፣ የአንድ መንገድ ANOVA (ህክምና ከቁጥጥር አማካኝ) እና የዱንኔትን አስፈላጊነት ለመወሰን የብዙ ንፅፅር ሙከራን ከመተንተን በተጨማሪ (p < 0.05)። ጉልህ የሆኑ የp እሴቶች በግራፉ ውስጥ እንደ *p < 0.05፣ **p < 0.01፣ ***p < 0.001፣ ****p < 0.0001 ይታያሉ። ሁሉም የስታቲስቲክስ ትንታኔዎች እና ግራፎች የተከናወኑ እና የተፈጠሩት በ GraphPad Prism 9.4.0 በመጠቀም ነው።
የTEM ምስል ትንተና የፊጂ/ImageJ ማክሮዎች በጂትሆብ ላይ በይፋ ይገኛሉ፦ https://github.com/caaja/TEMMitoMacro። የMitochondrial Event Locator (MEL) ማክሮ በጂትሆብ ላይ በይፋ ይገኛል፦ https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin።
ሜሊያና ኤ.፣ ዴቪ ኤንኤም እና ቪጃያ ኤ. ሚቶኮንድሪያ፡ የሜታቦሊዝም፣ የሆሞስታሲስ፣ የጭንቀት፣ የእርጅና እና የኤፒጄኔቲክስ ዋና ተቆጣጣሪዎች። ኢንዶኔዥያ። ባዮሜዲካል ሳይንስ። ጄ. 13፣ 221–241 (2021)።
ቤን-ሻቻር፣ ዲ. በስኪዞፈሪንያ ውስጥ ባለ ብዙ ገጽታ ማይቶኮንድሪያል ዲስኦርደር፣ ውስብስብ I እንደ የፓቶሎጂ ኢላማ። ስኪዞፈሪንያ። ምንጭ። 187፣ 3–10 (2017)።
ቦዝ፣ ኤ. እና ቤል፣ ኤምኤፍ በፓርኪንሰን በሽታ ውስጥ የሚቶኮንድሪያል መዛባት። ጄ. ኒውሮኬሚስትሪ። 139፣ 216–231 (2016)።
ሻርማ ቪኬ፣ ሲንግ ቲጂ እና ሜህታ ቪ. የተጨነቀ ሚቶኮንድሪያ፡ በአልዛይመር በሽታ ውስጥ የወረራ ኢላማዎች። ሚቶኮንድሪያ 59፣ 48–57 (2021)።
ቤሌንገር ፒ.፣ ዱዋርቴ ጄኤምኤን፣ ሹክ ፒኤፍ እና ፌሬራ ጂኬ ሚቶኮንድሪያ እና አንጎል፡ ባዮኢነርጂቲክስ እና ሌሎችም። ኒውሮቶክሲንስ። ምንጭ። 36፣ 219–238 (2019)።
ራንጋራጁ፣ ቪ. እና ሌሎችም። ፕሊዮትሮፒክ ሚቶኮንድሪያ፡- ሚቶኮንድሪያ በነርቭ እድገት እና በሽታ ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ። ጄ. ኒውሮሳይንስ። 39፣ 8200–8208 (2019)።
ካርዳኖ-ራሞስ፣ ሲ. እና ሞራይስ፣ ቪኤ ሚቶኮንድሪያል ባዮጄኔሲስ በነርቭ ሴሎች ውስጥ፡ እንዴት እና የት። ዓለም አቀፋዊነት። ጄ. ሞህር። ሳይንስ። 22፣ 13059 (2021)።
ዩ፣ አር.፣ ሌንዳል፣ ዩ.፣ ኒስተር፣ ኤም. እና ዣኦ፣ ጄ. የአጥቢ እንስሳት ሚቶኮንድሪያል ተለዋዋጭነት ደንብ፡ እድሎች እና ተግዳሮቶች። ግንባር። ኢንዶክሪን። (ላውሳን) 11፣ 374 (2020)።
ካቾ፣ ኤም. እና ስላክ፣ አርኤስ በኒውሮጄኔሲስ ቁጥጥር ውስጥ የሚቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ፡ ከማደግ እስከ አዋቂ አእምሮ። እድገት። ተለዋዋጭ። 247፣ 47–53 (2018)።