Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት ለCSS የተወሰነ ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳሃኝነት ሁነታን እንዲያጠፉ) እንመክራለን። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
ከፍተኛ የመጫኛ ይዘት ያላቸው የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች (NPs) በተለያዩ የመጠን ቅጾች የተለያዩ አተገባበሮችን አግኝተዋል። ይህ ሥራ የማቀዝቀዝ-ማድረቂያ እና የሚረጭ-ማድረቂያ ሂደቶች በኢንሱሊን የተጫኑ የቺቶሳን ናኖፓርቲክሎች አወቃቀር ላይ ያላቸውን ተጽእኖ ለመገምገም ያለመ ነው፣ እንደ ክሪዮፕሮቴክታንት ማኒቶል ወይም ያለሱ። እንዲሁም የእነዚህን ናኖፓርቲክሎች ጥራት እንደገና በመፍታት ገምግመናል። ከድርቀት በፊት፣ የቺቶሳን/ሶዲየም ትሪፖሊፎስፌት/ኢንሱሊን ክሮስ-ሊንክድ ናኖፓርቲክሎች የቅንጣት መጠን ወደ 318 nm እንዲደርስ ተመቻችቷል፣ PDI 0.18 ነበር፣ የመክፈያ ቅልጥፍናው 99.4% ነበር፣ እና ጭነቱ 25.01% ነበር። ከተገነባ በኋላ፣ ማኒቶል ሳይጠቀም በማቀዝቀዝ-ማድረቂያ ዘዴ የተመረቱት በስተቀር ሁሉም ናኖፓርቲክሎች ክብ ቅንጣታቸውን ጠብቀዋል። በማኒቶል ውስጥ ከሚረጩት በማኒቶል ውስጥ ከሚረጩት ከማኒቶል ውስጥ ከሚገኙት ናኖፓርቲክሎች ጋር ሲነጻጸር፣ ማኒቶል-ነጻ የሚረጭ-የደረቁ ናኖፓርቲክሎች ትንሹን አማካይ የቅንጣት መጠን (376 nm) እና ከፍተኛውን የመጫኛ ይዘት (25.02%) አሳይተዋል። በማድረቅ ወይም በማቀዝቀዝ-ማድረቅ ዘዴዎች የመክተት መጠን (98.7%) እና PDI (0.20)። ማኒቶል ሳይረጭ በማድረቅ የደረቁ ናኖፓርቲክሎች ፈጣን የኢንሱሊን ልቀት እና የሴሉላር ቅበላ ከፍተኛ ውጤታማነት አስገኝተዋል። ይህ ጥናት እንደሚያሳዩት የሚረጭ ማድረቅ ከባህላዊ የማድረቅ ዘዴዎች ጋር ሲነጻጸር ክሪዮፕሮቴክታንት ሳያስፈልግ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎችን ውሃ ሊያሟጥጥ ይችላል፣ ይህም የበለጠ የመጫኛ አቅም፣ ዝቅተኛ የመደመር መስፈርቶች እና የአሠራር ወጪዎች ከፍተኛ ጥቅም ይፈጥራል።
ኢንሱሊን እና የመድኃኒት ዝግጅቶቹ በ19221፣2፣3 ከተገኘበት ጊዜ ጀምሮ የአይነት 1 የስኳር በሽታ (T1DM) እና የአይነት 2 የስኳር በሽታ (T1DM) ያለባቸውን ታካሚዎች ሕይወት አድነዋል። ሆኖም ግን፣ ከፍተኛ የሞለኪውላር ክብደት ፕሮቲን በመሆኑ፣ ኢንሱሊን በቀላሉ ይዋሃዳል፣ በፕሮቲዮላይቲክ ኢንዛይሞች ይከፋፈላል እና በመጀመሪያ-ማለፊያ ውጤት ይወገዳል። የአይነት 1 የስኳር በሽታ እንዳለባቸው የተረጋገጡ ሰዎች በቀሪው ህይወታቸው የኢንሱሊን መርፌ ያስፈልጋቸዋል። መጀመሪያ ላይ የአይነት 2 የስኳር በሽታ እንዳለባቸው የተረጋገጡ ብዙ ታካሚዎች የረጅም ጊዜ የኢንሱሊን መርፌ ያስፈልጋቸዋል። ዕለታዊ የኢንሱሊን መርፌዎች ለእነዚህ ግለሰቦች የዕለት ተዕለት ህመም እና ምቾት ማጣት ከባድ ምንጭ ሲሆኑ በአእምሮ ጤና ላይ አሉታዊ ተጽእኖ አላቸው። በዚህም ምክንያት፣ እንደ የአፍ ውስጥ የኢንሱሊን አስተዳደር ያሉ አነስተኛ ምቾት ማጣት የሚያስከትሉ ሌሎች የኢንሱሊን አስተዳደር ዓይነቶች በስፋት እየተጠኑ ነው5 ምክንያቱም በዓለም ዙሪያ በግምት 5 ቢሊዮን የስኳር በሽታ ያለባቸውን ሰዎች የኑሮ ጥራት የመመለስ አቅም ስላላቸው።
የናኖፓርቲክል ቴክኖሎጂ በአፍ የሚወሰድ ኢንሱሊን ለመውሰድ በሚደረጉ ሙከራዎች ላይ ጉልህ የሆነ እድገት አሳይቷል4,6,7። ኢንሱሊንን ወደ ተወሰኑ የሰውነት ክፍሎች ለማድረስ ውጤታማ በሆነ መንገድ የሚሸፍን እና የሚከላከል። ሆኖም ግን፣ የናኖፓርቲክል ቀመሮች አጠቃቀም በርካታ ገደቦች አሉት፣ በዋናነት በቅንጣት እገዳዎች የመረጋጋት ችግሮች ምክንያት። አንዳንድ ስብስቦች በማከማቻ ጊዜ ሊከሰቱ ይችላሉ፣ ይህም የኢንሱሊን የተጫኑ ናኖፓርቲክሎች ባዮአቫሊቲነትን ይቀንሳል8። በተጨማሪም፣ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች (NPs) መረጋጋትን ለማረጋገጥ የናኖፓርቲክሎች እና የኢንሱሊን ፖሊመር ማትሪክስ የኬሚካል መረጋጋት ግምት ውስጥ መግባት አለበት። በአሁኑ ጊዜ፣ የማቀዝቀዝ-ማድረቂያ ቴክኖሎጂ በማከማቻ ጊዜ ያልተፈለጉ ለውጦችን በመከላከል የተረጋጋ NPs ለመፍጠር የወርቅ ደረጃ ነው።
ይሁን እንጂ፣ በረዶ-ማድረቅ የNPs ክብ መዋቅር በበረዶ ክሪስታሎች ሜካኒካዊ ውጥረት እንዳይጎዳ ለመከላከል ክሪዮፕሮቴክተሮችን መጨመር ይጠይቃል። ይህ ክሪዮፕሮቴክታንቱ አብዛኛውን የክብደት ጥምርታ ስለሚይዝ ከሊዮፊላይዜሽን በኋላ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች ጭነትን በእጅጉ ይቀንሳል። ስለዚህ፣ የሚመረቱት የኢንሱሊን NPs ብዙውን ጊዜ እንደ የአፍ ውስጥ ታብሌቶች እና የአፍ ውስጥ ፊልሞች ያሉ ደረቅ የዱቄት ፎርሙላዎችን ለማምረት ተስማሚ አይደሉም፣ ምክንያቱም የኢንሱሊን የሕክምና መስኮት ለማግኘት ከፍተኛ መጠን ያላቸው ደረቅ ናኖፓርቲክሎች ያስፈልጋሉ።
የሚረጭ ማድረቂያ በመድኃኒት ኢንዱስትሪ ውስጥ ከሚገኙ ፈሳሽ ደረጃዎች ደረቅ ዱቄቶችን ለማምረት የታወቀ እና ርካሽ የኢንዱስትሪ ደረጃ ሂደት ነው10,11. የቅንጣት ምስረታ ሂደቱን መቆጣጠር በርካታ ባዮአክቲቭ ውህዶችን በአግባቡ መጠቅለል ያስችላል 12, 13. በተጨማሪም፣ በአፍ አስተዳደር የተሸፈኑ ፕሮቲኖችን ለማዘጋጀት ውጤታማ ዘዴ ሆኗል። በሚረጭ ማድረቅ ወቅት ውሃ በጣም በፍጥነት ይተናል፣ ይህም የቁስሉ እምብርት የሙቀት መጠን ዝቅተኛ እንዲሆን ይረዳል11,14፣ ይህም የሙቀት-ስሜታዊ ክፍሎችን ለመሸፈን ያስችላል። ከመድረቁ በፊት፣ የሽፋን ቁሱ የታሸጉ ንጥረ ነገሮችን የያዘውን መፍትሄ በደንብ ተመሳሳይ መሆን አለበት11,14. ከማቀዝቀዣ-ማድረቅ በተለየ፣ በሚረጭ ማድረቅ ውስጥ ከመክተት በፊት ተመሳሳይነት በድርቅ ወቅት የመክተት ውጤታማነትን ያሻሽላል። የሚረጭ-ማድረቂያ የመክተት ሂደቱ ክሪዮፕሮቴክታንትስ ስለማያስፈልገው፣ የሚረጭ-ማድረቅ ከፍተኛ የመጫኛ ይዘት ያላቸውን የደረቁ NPs ለማምረት ሊያገለግል ይችላል።
ይህ ጥናት የቺቶሳን እና የሶዲየም ትሪፖሊፎስፌት የአዮን ጄል ዘዴን በመጠቀም በኢንሱሊን የተጫኑ NPs ምርትን ሪፖርት ያደርጋል። የአዮን ጄልሽን በተወሰኑ ሁኔታዎች ውስጥ በሁለት ወይም ከዚያ በላይ አዮኒክ ዝርያዎች መካከል በኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብር በኩል ናኖፓርቲክሎችን ለማምረት የሚያስችል የዝግጅት ዘዴ ነው። ሁለቱም የቀዘቀዘ-ማድረቂያ እና የሚረጭ-ማድረቂያ ቴክኒኮች የተመቻቸውን የቺቶሳን/ሶዲየም ትሪፖሊፎስፌት/ኢንሱሊን ክሮስ-ሊንክ ናኖፓርቲክሎችን ለማድረቅ ጥቅም ላይ ውለዋል። ከድርቀት በኋላ፣ ሞርፎሎጂያቸው በSEM ተተነተነ። የድጋሚ ውህደት ችሎታቸው የመጠን ስርጭታቸውን፣ የገጽታ ክፍያቸውን፣ PDI፣ የመክተት ቅልጥፍናን እና የመጫኛ ይዘታቸውን በመለካት ተገምግሟል። በተለያዩ ድርቀት ዘዴዎች የሚመረቱ የሬሶቢልላይዝድ ናኖፓርቲክሎች ጥራት የኢንሱሊን መከላከያቸውን፣ የመልቀቂያ ባህሪያቸውን እና የሴሉላር ቅበላ ውጤታማነትን በማነፃፀር ተገምግሟል።
የተቀላቀለው መፍትሄ ፒኤች እና የቺቶሳን እና የኢንሱሊን ጥምርታ የመጨረሻዎቹን NPs የቅንጣት መጠን እና የመክተት ቅልጥፍና (EE) ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩ ሁለት ቁልፍ ምክንያቶች ናቸው፣ ምክንያቱም በቀጥታ የአዮኖትሮፒክ ጄሌሽን ሂደትን ስለሚነኩ። የተቀላቀለው መፍትሄ ፒኤች ከቅንጣት መጠን እና ከኮፕሌሽን ቅልጥፍና ጋር በእጅጉ የተቆራኘ መሆኑን ታይቷል (ምስል 1a)። በምስል 1a ላይ እንደሚታየው፣ pH ከ4.0 ወደ 6.0 ሲጨምር፣ አማካይ የቅንጣት መጠን (nm) ቀንሷል እና EE በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል፣ pH ደግሞ ወደ 6.5 ሲጨምር፣ አማካይ የቅንጣት መጠን መጨመር ጀመረ እና EE ሳይለወጥ ቆይቷል። የቺቶሳን እና የኢንሱሊን ጥምርታ ሲጨምር፣ አማካይ የቅንጣት መጠንም ይጨምራል። በተጨማሪም፣ ናኖፓርቲክሎች ከ2.5:1 (w/w) በላይ በሆነ የቺቶሳን/ኢንሱሊን የጅምላ ጥምርታ ሲዘጋጁ በEE ላይ ምንም ለውጥ አልታየም (ምስል 1ለ)። ስለዚህ፣ በዚህ ጥናት ውስጥ ያሉት ምርጥ የዝግጅት ሁኔታዎች (pH 6.0፣ የቺቶሳን/ኢንሱሊን የጅምላ ጥምርታ 2.5:1) ለማዘጋጀት ጥቅም ላይ ውለዋል። ለተጨማሪ ጥናት በኢንሱሊን የተጫኑ ናኖፓርቲክሎች። በዚህ የዝግጅት ሁኔታ፣ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች አማካይ የቅንጣት መጠን ወደ 318 nm እንዲደርስ ተመቻችቷል (ምስል 1ሐ)፣ PDI 0.18 ነበር፣ የመክተት ቅልጥፍና 99.4% ነበር፣ የዜታ እምቅ አቅም 9.8 mv ነበር፣ እና የኢንሱሊን ጭነት 25.01% (m/m) ነበር። በማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) ውጤቶች ላይ በመመስረት፣ የተመቻቹ ናኖፓርቲክሎች በአንጻራዊነት ተመሳሳይ መጠን ያላቸው ክብ ቅርጽ ያላቸው እና የተለዩ ነበሩ (ምስል 1መ)።
የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች መለኪያ ማመቻቸት፡ (ሀ) የፒኤች መጠን በኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች አማካይ ዲያሜትር እና የመክተት ቅልጥፍና (EE) ላይ ያለው ተጽእኖ (በቺቶሳን እና በኢንሱሊን 5:1 የጅምላ ጥምርታ የተዘጋጀ)፤ (ለ) ቺቶሳን እና የኢንሱሊን የጅምላ ጥምርታ በአማካይ ዲያሜትር እና የመክተት ቅልጥፍና (EE) ላይ ያለው ተጽእኖ (በፒኤች 6 የተዘጋጀ)፤ (ሐ) የተመቻቹ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች የቅንጣት መጠን ስርጭት፤ (መ) የተመቻቹ የኢንሱሊን NPs የTEM ማይክሮግራፍ።
ቺቶሳን ደካማ ፖሊኤሌክትሮላይት ሲሆን 6.5 pKa ያለው መሆኑ ይታወቃል። በአሲድ ሚዲያ ውስጥ አዎንታዊ ቻርጅ ይደረግለታል ምክንያቱም ዋናው አሚኖ ቡድኑ በሃይድሮጂን አየኖች 15 ስለሚመነጭ ነው። ስለዚህ፣ ብዙውን ጊዜ አሉታዊ ቻርጅ የተደረጉ ማክሮሞለኪውሎችን ለመሸፈን እንደ ተሸካሚ ያገለግላል። በዚህ ጥናት፣ ቺቶሳን ኢንሱሊንን በ 5.3 ኢሶኤሌክትሪክ ነጥብ ለመሸፈን ጥቅም ላይ ውሏል። ቺቶሳን እንደ ሽፋን ቁሳቁስ ጥቅም ላይ ስለሚውል፣ መጠኑ ሲጨምር የናኖፓርቲክሎች ውጫዊ ሽፋን ውፍረት በተመሳሳይ መጠን ይጨምራል፣ ይህም አማካይ የቅንጣት መጠን እንዲጨምር ያደርጋል። በተጨማሪም፣ ከፍተኛ የቺቶሳን መጠን ተጨማሪ ኢንሱሊንን ሊሸፍን ይችላል። በእኛ ሁኔታ፣ የቺቶሳን እና የኢንሱሊን ጥምርታ 2.5:1 ሲደርስ EE ከፍተኛ ነበር፣ እና ጥምርታው እየጨመረ ሲሄድ በEE ላይ ምንም ጉልህ ለውጥ አልነበረም።
ከቺቶሳን እና ኢንሱሊን ጥምርታ በተጨማሪ፣ ፒኤች በ NPs ዝግጅት ውስጥ ወሳኝ ሚና ተጫውቷል። ጋን እና ሌሎች 17 የፒኤች መጠን በቺቶሳን ናኖፓርቲክሎች ቅንጣት መጠን ላይ ያለውን ተጽእኖ አጥንተዋል። ፒኤች 6.0 እስኪደርስ ድረስ የቅንጣት መጠን ቀጣይነት ያለው መቀነስ አግኝተዋል፣ እና በፒኤች > 6.0 ላይ የቅንጣት መጠን ጉልህ ጭማሪ ታይቷል፣ ይህም ከምናያቸው ምልከታዎች ጋር የሚስማማ ነው። ይህ ክስተት የሚከሰተው የፒኤች መጠን እየጨመረ ሲሄድ የኢንሱሊን ሞለኪውል አሉታዊ የገጽታ ክፍያ ስለሚያገኝ፣ ከቺቶሳን/ሶዲየም ትሪፖሊፎስፌት (TPP) ውስብስብ ጋር ኤሌክትሮስታቲክ መስተጋብርን ስለሚደግፍ፣ አነስተኛ የቅንጣት መጠን እና ከፍተኛ EE በመፍጠር ነው። ሆኖም፣ ፒኤች ወደ 6.5 ሲስተካከል፣ በቺቶሳን ላይ ያሉት አሚኖ ቡድኖች ተወግደዋል፣ ይህም የቺቶሳን መታጠፍ አስከትሏል። ስለዚህ፣ ከፍተኛ ፒኤች ለቲፒፒ እና ኢንሱሊን የአሚኖ አየኖችን መጋለጥ አነስተኛ ያደርገዋል፣ ይህም ዝቅተኛ የመስቀል ትስስር፣ ትልቅ የመጨረሻ አማካይ የቅንጣት መጠን እና ዝቅተኛ EE ያስከትላል።
የቀዘቀዙ እና የሚረጩ የደረቁ ኤንፒዎች ሞርፎሎጂካል ባህሪያት ትንተና የተሻሉ የእርጥበት እና የዱቄት መፈጠር ቴክኒኮችን መምረጥ ይችላል። ተመራጭው ዘዴ የመድኃኒት መረጋጋትን፣ ወጥ የሆነ የቅንጣት ቅርፅን፣ ከፍተኛ የመድኃኒት ጭነት እና ጥሩ የመሟሟት አቅምን በዋናው መፍትሄ ውስጥ ማቅረብ አለበት። በዚህ ጥናት፣ ሁለቱን ቴክኒኮች በተሻለ ሁኔታ ለማነፃፀር፣ 1% ማኒቶል ያላቸው ወይም የሌላቸው የኢንሱሊን ኤንፒዎች በድርቅ ጊዜ ጥቅም ላይ ውለዋል። ማኒቶል ለማቀዝቀዝ እና ለመርጨት ለማድረቅ በተለያዩ ደረቅ የዱቄት ቀመሮች ውስጥ እንደ ትልቅ ወኪል ወይም ክሪዮፕሮቴክታንት ጥቅም ላይ ይውላል። ማኒቶል የሌላቸው ሊዮፊሊዝድ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች፣ በስእል 2a ላይ እንደሚታየው፣ ትልቅ፣ መደበኛ ያልሆነ እና ሻካራ ገጽታዎች ያሉት ከፍተኛ ቀዳዳ ያለው የዱቄት መዋቅር በኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (SEM) ቅኝት ታይቷል። ከድርቀት በኋላ በዱቄቱ ውስጥ ጥቂት የተለዩ ቅንጣቶች ተገኝተዋል (ምስል 2ሠ)። እነዚህ ውጤቶች አብዛኛዎቹ ኤንፒዎች ያለ ምንም ክሪዮፕሮቴክታንት በበረዶ-ማድረቅ ወቅት እንደተበከሉ ያመለክታሉ። 1% ማኒቶል የያዙ ለደረቁ እና ለሚረጩ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች፣ ለስላሳ ገጽታዎች ያላቸው ክብ ናኖፓርቲክሎች ታይተዋል (ምስል 2ለ፣መ፣ፍ፣ሰ)።ማኒቶል ሳይኖረው የሚረጩ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች ክብ ቅርጽ ቢኖረውም በላዩ ላይ የተሸበሸቡ ሆነው ቆይተዋል (ምስል 2ሐ)።ሉላዊ እና የተሸበሸቡ ቦታዎች ከዚህ በታች ባለው የመልቀቂያ ባህሪ እና የሴሉላር ቅበላ ሙከራዎች ውስጥ የበለጠ ተብራርተዋል። በደረቁ NPs ላይ በሚታየው መልኩ ላይ በመመስረት፣ ሁለቱም የሚረጩ የደረቁ NPs ያለማኒቶል እና NPs ያለማኒቶል የሚቀዘቅዙ እና በማኒቶል የሚረጩ ጥቃቅን NPs ዱቄቶችን ያስገኛሉ (ምስል 2f፣g፣h)። በቅንጣቢው ገጽታዎች መካከል ያለው የገጽታ ስፋት በጨመረ ቁጥር የመሟሟት እድሉ ከፍ ያለ ሲሆን በዚህም ምክንያት የመልቀቂያ መጠኑ ከፍ ያለ ነው።
የተለያዩ የተሟሟ የኢንሱሊን NPs ሞርፎሎጂ፡ (ሀ) ማኒቶል የሌላቸው የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs የSEM ምስል፤ (ለ) ከማኒቶል ጋር የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs የSEM ምስል፤ (ሐ) ማኒቶል የሌላቸው የSEM ምስል፤ (መ) ከማኒቶል ጋር የደረቀ የኢንሱሊን NPs የSEM ምስል፤ (ሠ) ማኒቶል የሌለው የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs ዱቄት ምስል፤ (ረ) ከማኒቶል ጋር የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs ምስል፤ (ሰ) ማኒቶል የሌለው የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs ዱቄት ምስል፤ (ሰ) ማኒቶል የሌለው የሊዮፊልዝድ ኢንሱሊን NPs ዱቄት ምስል፤ (ሸ) ከማኒቶል ጋር የደረቀ የኒMPs ዱቄት ምስል።
በማቀዝቀዝ-ማድረቅ ወቅት፣ ማኒቶል እንደ ክሪዮፕሮቴክት ሆኖ ያገለግላል፣ ኤንፒዎችን በአሞርፎስ መልክ ይይዛል እና በበረዶ ክሪስታሎች ጉዳት ይከላከላል19። በተቃራኒው፣ በሚረጭ ማድረቅ ወቅት የማቀዝቀዝ እርምጃ የለም። ስለዚህ በዚህ ዘዴ ማኒቶል አያስፈልግም። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ ማኒቶል የሌላቸው የሚረጩ የደረቁ ኤንፒዎች ቀደም ሲል እንደተገለጸው የበለጠ ሉላዊ መዋቅር ይሰጣሉ። ሆኖም፣ ማኒቶል አሁንም በሚረጭ-ማድረቂያ ሂደት ውስጥ እንደ መሙያ ሆኖ ሊያገለግል ይችላል፣ ይህም ኤንፒዎችን የበለጠ ክብ ቅርጽ እንዲኖረው ያደርጋል20 (ምስል 2መ)፣ ይህም እንደዚህ ያሉ የታሸጉ ኤንፒዎች ወጥ የሆነ የመልቀቂያ ባህሪ ለማግኘት ይረዳል። በተጨማሪም፣ አንዳንድ ትላልቅ ቅንጣቶች በማኒቶል የያዙ በደረቁ እና በሚረጭ-በደረቁ የኢንሱሊን ኤንፒዎች ውስጥ ሊገኙ እንደሚችሉ ግልፅ ነው (ምስል 2ለ፣መ)፣ ይህም በማኒቶል ውስጥ ካለው የቅንጣት እምብርት ጋር በማከማቸት ምክንያት ሊሆን ይችላል። ወደ. የቺቶሳን ንብርብር። በዚህ ጥናት ውስጥ፣ ከድርቀት በኋላ የሉላዊ አወቃቀሩ ሳይበላሽ እንዲቆይ፣ የማኒቶል እና የቺቶሳን ጥምርታ በ5፡1 እንደሚቆይ ልብ ሊባል የሚገባው ሲሆን፣ ከፍተኛ መጠን ያለው መሙያ የደረቁ የ NPs ቅንጣቶችን መጠን ሊያሳድግ ይችላል።
የፎሪየር ትራንስፎርም ኢንፍራሬድ የተዳከመ ጠቅላላ ነጸብራቅ (FTIR-ATR) ስፔክትሮስኮፒ የነጻ ኢንሱሊን፣ የቺቶሳን፣ የቺቶሳን፣ የቲፒፒ እና የኢንሱሊን አካላዊ ድብልቅን ለይቶ ያሳያል። ሁሉም የተሟጠጡ NPs በFTIR-ATR ስፔክትሮስኮፒ በመጠቀም ተለይተው ይታወቃሉ። በተለይም የ1641፣ 1543 እና 1412 ሴ.ሜ-1 የባንድ ጥንካሬዎች በማኒቶል በተቀዘቀዙ NPs እና በማኒቶል በተረጨ እና ያለማኒቶል በተረጨ NPs ውስጥ ታይተዋል (ምስል 3)። ቀደም ሲል እንደተዘገበው፣ እነዚህ የጥንካሬ ጭማሪዎች በቺቶሳን፣ በቲፒፒ እና በኢንሱሊን መካከል ካለው የመስቀለኛ ትስስር ጋር የተያያዙ ናቸው። በቺቶሳን እና በኢንሱሊን መካከል ያለው መስተጋብር ምርመራ እንደሚያሳየው በኢንሱሊን የተጫኑ የቺቶሳን ናኖፓርቲክሎች የFTIR ስፔክትራ ውስጥ የቺቶሳን ባንድ ከኢንሱሊን ጋር በመደራረብ የካርቦኒል ጥንካሬ (1641 ሴ.ሜ-1) እና የአሚን (1543 ሴ.ሜ-1) ቀበቶን ይጨምራል። የቲፒፒ ትሪፖሊፎስፌት ቡድኖች በቺቶሳን ውስጥ ከአሞኒየም ቡድኖች ጋር የተገናኙ ሲሆን በ 1412 ሴ.ሜ-1.
የነጻ ኢንሱሊን፣ የቺቶሳን፣ የቺቶሳን/ቲፒፒ/ኢንሱሊን አካላዊ ድብልቆች እና በተለያዩ ዘዴዎች የተሟጠጡ የኤንፒዎች FTIR-ATR ስፔክትራ።
በተጨማሪም፣ እነዚህ ውጤቶች በSEM ውስጥ ከተመለከቱት ጋር የሚጣጣሙ ናቸው፣ ይህም በማኒቶል ሲረጩ እና ሲቀዘቅዙ የተሸፈኑ NPs ሳይበላሹ እንደቀሩ ያሳያል፣ ነገር ግን ማኒቶል በሌለበት ጊዜ፣ የሚረጭ ማድረቅ ብቻ የተሸፈኑ ቅንጣቶችን ያመነጫል። በአንጻሩ፣ ማኒቶል ሳይኖር የቀዘቀዘ የNPs የFTIR-ATR ስፔክትራል ውጤቶች ከቺቶሳን፣ TPP እና ኢንሱሊን አካላዊ ድብልቅ ጋር በጣም ተመሳሳይ ነበሩ። ይህ ውጤት በቺቶሳን፣ TPP እና ኢንሱሊን መካከል ያለው መሻገሪያ ትስስር ማኒቶል ሳይኖር በቀዘቀዘ የNPs ውስጥ ከእንግዲህ እንደማይገኝ ያሳያል። የNPs መዋቅር ያለ ክሪዮፕሮቴክታንት በቀዘቀዘ የደረቀ ጊዜ ወድሟል፣ ይህም በSEM ውጤቶች ውስጥ ሊታይ ይችላል (ምስል 2a)። በደረቅ የኢንሱሊን NPs ሞርፎሎጂ እና FTIR ውጤቶች ላይ በመመስረት፣ በማኒቶል ነጻ NPs መበስበስ ምክንያት ሊዮፊሊላይዝድ፣ የሚረጭ እና ማኒቶል-ነጻ NPs ብቻ ጥቅም ላይ ውለዋል። ተወያዩ።
ድርቀት ለረጅም ጊዜ ማከማቻ እና ወደ ሌሎች ቀመሮች እንደገና ለማቀነባበር ጥቅም ላይ ይውላል። ደረቅ NPs ከማከማቻ በኋላ እንደገና የመዋሃድ ችሎታ እንደ ታብሌቶች እና ፊልሞች ባሉ የተለያዩ ቀመሮች ውስጥ ለመጠቀም ወሳኝ ነው። ማኒቶል በሌለበት የሚረጭ-የደረቀ የኢንሱሊን NPs አማካይ የቅንጣት መጠን እንደገና ከተገነባ በኋላ በትንሹ እንደጨመረ አስተውለናል። በሌላ በኩል፣ የሚረጭ-የደረቁ እና የቀዘቀዘ-የደረቁ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች ከማኒቶል ጋር ያለው የቅንጣት መጠን በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ሠንጠረዥ 1)። በዚህ ጥናት ውስጥ ሁሉም NPs እንደገና ከተዋሃዱ በኋላ PDI እና EE በከፍተኛ ሁኔታ አልተለወጡም (p > 0.05)። ይህ ውጤት እንደሚያሳየው አብዛኛዎቹ ቅንጣቶች እንደገና ከተፈቱ በኋላ ሳይበላሹ እንደቀሩ ነው። ሆኖም፣ ማኒቶል መጨመር የሊዮፊሊዝድ እና የሚረጭ-የደረቁ የማኒቶል ናኖፓርቲክሎች የኢንሱሊን ጭነት በእጅጉ ቀንሷል (ሠንጠረዥ 1)። በተቃራኒው፣ ማኒቶል ሳይኖር የሚረጭ-የደረቁ NPs የኢንሱሊን ጭነት ይዘት እንደበፊቱ ተመሳሳይ ሆኖ ቆይቷል (ሠንጠረዥ 1)።
ለመድኃኒት አቅርቦት ዓላማዎች ጥቅም ላይ ሲውሉ የናኖፓርቲክሎች ጭነት ወሳኝ መሆኑ የታወቀ ነው። ዝቅተኛ ጭነት ላላቸው NPዎች፣ የሕክምና ደረጃ ላይ ለመድረስ በጣም ብዙ መጠን ያለው ቁሳቁስ ያስፈልጋል። ሆኖም፣ እንደዚህ ያሉ ከፍተኛ የNP ክምችት ከፍተኛ viscosity በአፍ አስተዳደር እና በመርፌ ቀመሮች ውስጥ ምቾት ማጣት እና ችግር ያስከትላል፣ በቅደም ተከተል 22። በተጨማሪም፣ የኢንሱሊን NPs ታብሌቶችን እና ዝልግልግ ባዮፊልሞችን ለመሥራት ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ23፣ 24፣ ይህም በዝቅተኛ የመጫኛ ደረጃዎች ከፍተኛ መጠን ያለው NPs መጠቀምን ይጠይቃል፣ ይህም ለአፍ ውስጥ ለመጠቀም የማይመቹ ትላልቅ ታብሌቶች እና ወፍራም ባዮፊልሞችን ያስከትላል። ስለዚህ፣ ከፍተኛ የኢንሱሊን ጭነት ያላቸው ደረቅ NPs በጣም ተፈላጊ ናቸው። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት የማኒቶል-ነጻ የሚረጭ የደረቁ NPs ከፍተኛ የኢንሱሊን ጭነት ለእነዚህ አማራጭ የማድረሻ ዘዴዎች ብዙ ማራኪ ጥቅሞችን ሊሰጥ ይችላል።
ሁሉም የተሟሟ NPs በማቀዝቀዣ ውስጥ ለሦስት ወራት ተይዘዋል። የSEM ውጤቶች እንደሚያሳዩት ሁሉም የተሟሟ NPs ሞርፎሎጂ በሦስት ወር ማከማቻ ወቅት በከፍተኛ ሁኔታ አልተለወጠም (ምስል 4)። በውሃ ውስጥ እንደገና ከተዋሃዱ በኋላ፣ ሁሉም NPs በEE ውስጥ ትንሽ ቅናሽ አሳይተው በሦስት ወር የማከማቻ ጊዜ ውስጥ በግምት ትንሽ መጠን (~5%) ኢንሱሊን ተለቅቀዋል (ሠንጠረዥ 2)። ሆኖም፣ የሁሉም ናኖፓርቲክሎች አማካይ የቅንጣት መጠን ጨምሯል። ማኒቶል ሳይኖር የሚረጩት NPs የቅንጣት መጠን ወደ 525 nm ጨምሯል፣ በማኒቶል የሚረጩት እና የቀዘቀዘ የደረቁ NPs በቅደም ተከተል ወደ 872 እና 921 nm ጨምሯል (ሠንጠረዥ 2)።
ለሦስት ወራት የተከማቹ የተለያዩ የተሟሟ የኢንሱሊን NPs ሞርፎሎጂ፡ (ሀ) ከማኒቶል ጋር የሊዮፊሊዝድ የኢንሱሊን NPs የSEM ምስል፤ (ለ) ማኒቶል የሌላቸው የሚረጩ የደረቁ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች የSEM ምስል፤ (ሐ) የማኒቶል የሌላቸው የሚረጩ የደረቁ የኢንሱሊን NPs የSEM ምስሎች።
በተጨማሪም፣ በማኒቶል በደረቁ እና በቀዘቀዘ በደረቁ በተዋሃደው የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች ውስጥ የዝናብ መጠን ታይቷል (ምስል S2)። ይህ ሊሆን የሚችለው ትላልቅ ቅንጣቶች በውሃ ውስጥ በትክክል ሳይንጠለጠሉ በመቅረታቸው ሊሆን ይችላል። ከላይ የተጠቀሱት ውጤቶች በሙሉ የሚረጨው የማድረቂያ ዘዴ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎችን ከድርቀት ሊከላከል እንደሚችል እና ከፍተኛ መጠን ያለው የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች ያለ ምንም መሙያ ወይም ክሪዮፕሮቴክታንትስ ሊገኙ እንደሚችሉ ያሳያሉ።
የኢንሱሊን ማቆየት በፒኤች = 2.5 መካከለኛ በፔፕሲን፣ ትራይፕሲን እና α-ቺሞትሪፕሲን ተፈትኗል፤ ይህም ከድርቀት በኋላ የኢንሱሊን መፈጨትን የመከላከል አቅምን ያሳያል። የተሟጠጡ NPs የኢንሱሊን ማቆየት ከአዲስ ከተዘጋጁ NPs ጋር ተነጻጽሯል፣ እና ነፃ ኢንሱሊን እንደ አሉታዊ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል። በዚህ ጥናት፣ ነፃ ኢንሱሊን በሦስቱም የኢንሱሊን ሕክምናዎች ውስጥ በ4 ሰዓታት ውስጥ ፈጣን የኢንሱሊን መወገድን አሳይቷል (ምስል 5a-c)። በተቃራኒው፣ በማኒቶል የደረቁ NPs እና በማኒቶል ወይም ያለሱ የተረጩ NPs የኢንሱሊን ማስወገጃ ሙከራ እነዚህን NPs ከኢንዛይም መፈጨት በእጅጉ የላቀ ጥበቃ አሳይቷል፣ ይህም አዲስ ከተዘጋጁት የኢንሱሊን NPs ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 1).5a-c)። በፔፕሲን፣ ትራይፕሲን እና α-ቺሞትሪፕሲን ውስጥ ባሉ ናኖፓርቲክሎች እገዛ፣ ከ50%፣ 60% እና 75% በላይ የኢንሱሊን መጠን በቅደም ተከተል በ4 ሰዓታት ውስጥ ሊጠበቅ ይችላል (ምስል 5a-c)። ይህ የኢንሱሊን መከላከያ ችሎታ ከፍ ያለ የኢንሱሊን እድልን ሊጨምር ይችላል። ወደ ደም ውስጥ መምጠጥ25. እነዚህ ውጤቶች በማኒቶል ወይም ያለሱ የሚረጭ ማድረቅ እና በማኒቶል ማቀዝቀዝ-ማድረቅ ከድርቀት በኋላ የ NPs የኢንሱሊን መከላከያ ችሎታን ሊጠብቅ እንደሚችል ይጠቁማሉ።
የተሟጠጠ የኢንሱሊን NPs ጥበቃ እና የመልቀቂያ ባህሪ፡ (ሀ) በፔፕሲን መፍትሄ ውስጥ የኢንሱሊን ጥበቃ፤ (ለ) በትራይፕሲን መፍትሄ ውስጥ የኢንሱሊን ጥበቃ፤ (ሐ) በα-chymotrypsin መፍትሄ የኢንሱሊን ጥበቃ፤ (መ) በ pH ውስጥ የተሟጠጠ NPs የመልቀቂያ ባህሪ = 2.5 መፍትሄ፤ (ሠ) የተሟጠጠ NPs በ pH = 6.6 መፍትሄ ውስጥ የመልቀቂያ ባህሪ፤ (ረ) የተሟጠጠ NPs በ pH = 7.0 መፍትሄ ውስጥ የመልቀቂያ ባህሪ።
አዲስ የተዘጋጁ እና እንደገና የተገነቡ ደረቅ የኢንሱሊን NPs በ37°ሴ በተለያዩ ባፈሮች (pH = 2.5፣ 6.6፣ 7.0) ውስጥ እንዲተከሉ ተደርጓል፣ ይህም የኢንሱሊን በኢንሱሊን መቋቋም ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመመርመር የሆድ፣ የዱኦዴን እና የላይኛው ትንሹ አንጀት የፒኤች አካባቢን በማስመሰል ነው። በተለያዩ አካባቢዎች የመልቀቂያ ባህሪ። የጨጓራና ትራክት ክፍልፋዮች። በ pH = 2.5፣ በኢንሱሊን የተጫኑ NPs እና እንደገና የተሟሉ ደረቅ ኢንሱሊን NPs በመጀመሪያው አንድ ሰዓት ውስጥ የመጀመሪያ ፍንዳታ መለቀቅ አሳይተዋል፣ ከዚያም በሚቀጥሉት 5 ሰዓታት ውስጥ በዝግታ መለቀቅ (ምስል 5d)። ይህ ፈጣን ልቀት መጀመሪያ ላይ በቅንጣቱ ውስጣዊ መዋቅር ውስጥ ሙሉ በሙሉ ያልተንቀሳቀሱ የፕሮቲን ሞለኪውሎችን በፍጥነት ወደ ላይ በማውጣት ሊሆን ይችላል። በ pH = 6.5፣ በኢንሱሊን የተጫኑ NPs እና እንደገና የተገነቡ ደረቅ ኢንሱሊን NPs በ6 ሰዓታት ውስጥ ለስላሳ እና ቀርፋፋ ልቀት አሳይተዋል፣ ምክንያቱም የሙከራ መፍትሄው ፒኤች ከNPs የተዘጋጀው መፍትሄ ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 5e)። በ pH = 7፣ NPs ያልተረጋጉ እና በመጀመሪያዎቹ ሁለት ሰዓታት ውስጥ ሙሉ በሙሉ ከሞላ ጎደል ተበላሽተዋል (ምስል 5f)። ይህ የሆነበት ምክንያት የቺቶሳን ዲፕሮቶኔሽን በከፍተኛ ፒኤች ስለሚከሰት፣ ይህም አነስተኛ የታመቀ ፖሊመር አውታረ መረብ እና የተጫነ ኢንሱሊን መለቀቅን ያስከትላል።
በተጨማሪም፣ ማኒቶል ሳይኖረው የሚረጨው የኢንሱሊን NPs ከሌሎች የተሟሟ NPs በበለጠ ፍጥነት የመልቀቂያ መገለጫ አሳይቷል (ምስል 5d–f)። ቀደም ሲል እንደተገለጸው፣ ማኒቶል ሳይኖረው የደረቀው እንደገና የተዋሃደው የኢንሱሊን NPs ትንሹን የቅንጣት መጠን አሳይቷል። ትናንሽ ቅንጣቶች ሰፋ ያለ የገጽታ ስፋት ይሰጣሉ፣ ስለዚህ አብዛኛው ተዛማጅነት ያለው መድሃኒት በቅንጣቱ ወለል ላይ ወይም አቅራቢያ ይሆናል፣ ይህም በፍጥነት የመድኃኒት መለቀቅን ያስከትላል26።
የ NPs ሳይቶቶክሲክነት በኤምቲቲ ምርመራ ተመርምሯል። በምስል S4 ላይ እንደሚታየው፣ ሁሉም የተሟጠጡ NPs ከ50-500 μg/ml ባለው ክምችት ውስጥ በሴል ህያውነት ላይ ምንም አይነት ጉልህ ተጽእኖ እንደሌላቸው ተረጋግጧል፣ ይህም ሁሉም የተሟጠጡ NPs ወደ ሕክምናው መስኮት ለመድረስ ደህንነቱ በተጠበቀ ሁኔታ ጥቅም ላይ ሊውሉ እንደሚችሉ ይጠቁማል።
ጉበት ኢንሱሊን የፊዚዮሎጂ ተግባሮቹን የሚያከናውንበት ዋናው አካል ነው። የሄፕጂ2 ሴሎች በተለምዶ እንደ ኢንቪትሮ ሄፓቶሳይት የመምጠጥ ሞዴል ጥቅም ላይ የሚውል የሰው ሄፓቶማ ሴል መስመር ናቸው። እዚህ፣ የሄፕጂ2 ሴሎች በረዶ-ማድረቅ እና የሚረጭ-ማድረቂያ ዘዴዎችን በመጠቀም የተሟጠጡ የኤንፒዎች ሴሉላር ቅበላን ለመገምገም ጥቅም ላይ ውለዋል። በ25 μg/mL ክምችት ነፃ FITC ኢንሱሊን በመጠቀም ለብዙ ሰዓታት ከተቀቀለ በኋላ በፍሰት ሳይቶሜትሪ እና ራዕይ በመጠቀም በኮንፎካል ሌዘር ቅኝት የሴሉላር ቅበላ፣ አዲስ የተዘጋጁ FITC ኢንሱሊን የተጫነባቸው NPs እና በእኩል የኢንሱሊን ክምችት ላይ የተሟሉ FITC ኢንሱሊን የተጫነባቸው NPs በቁጥር ማይክሮስኮፒ (CLSM) ምልከታዎች ተካሂደዋል። ማኒቶል የሌላቸው ሊዮፊሊድድድ NPs በድርቅ ወቅት ወድመዋል እና በዚህ ሙከራ አልተገመገሙም። አዲስ የተዘጋጁ ኢንሱሊን የተጫነባቸው NPs፣ ሊዮፊሊድድድ NPs ከማኒቶል ጋር፣ እና በማኒቶል እና ያለሱ የሚረጩ የደረቁ NPs (ምስል 6a) ከነፃው 4.3፣ 2.6፣ 2.4 እና 4.1 እጥፍ ከፍ ያሉ ነበሩ። የFITC-ኢንሱሊን ቡድን፣ በቅደም ተከተል (ምስል 6ለ)። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት በሴሉላር ቅበላ ውስጥ የተዘጋ ኢንሱሊን ከነፃ ኢንሱሊን የበለጠ ኃይለኛ ነው፣ በዋናነት በጥናቱ ውስጥ የተመረቱት የኢንሱሊን-የተጫኑ ናኖፓርቲክሎች አነስተኛ መጠን በመኖሩ ነው።
አዲስ በተዘጋጁ NPs እና በተደረቁ NPs ከ4 ሰዓታት በኋላ የሄፕጂ2 ሴል መምጠጥ፡ (ሀ) በሄፕጂ2 ሴሎች የFITC-ኢንሱሊን መምጠጥ ስርጭት።(ለ) በፍሰት ሳይቶሜትሪ የተተነተነ የፍሎረሰንስ ጥንካሬ ጂኦሜትሪክ አማካኝ፣ *P < 0.05 ከነፃ ኢንሱሊን ጋር ሲነጻጸር።
በተመሳሳይ፣ የCLSM ምስሎች እንደሚያሳዩት አዲስ የተዘጋጁ የFITC-ኢንሱሊን-የተጫኑ NPs እና FITC-የተጫኑ የሚረጩ የደረቁ NPs (ማኒቶል የሌላቸው) የFITC የፍሎረሰንስ ጥንካሬዎች ከሌሎቹ ናሙናዎች በጣም ጠንካራ ነበሩ (ምስል 6a)። በተጨማሪም፣ ማኒቶል ሲጨመር፣ የመፍትሄው ከፍተኛ viscosity ለሴሉላር ቅበላ የመቋቋም አቅምን ጨምሯል፣ ይህም የኢንሱሊን መስፋፋትን ቀንሷል። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት ማኒቶል-ነጻ የሚረጩ የደረቁ NPs ከፍተኛውን የሴሉላር ቅበላ ውጤታማነት አሳይተዋል ምክንያቱም የቅንጣት መጠናቸው እንደገና ከተሟሟ በኋላ ከቀዘቀዘ የደረቁ NPs ያነሰ ነበር።
ቺቶሳን (አማካይ የሞለኪውላር ክብደት 100 KDa፣ 75–85% ዲአሲቴላይትድ) የተገዛው ከሲግማ-አልድሪች ነው። (ኦክቪል፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ)። ሶዲየም ትሪፖሊፎስፌት (TPP) የተገዛው ከVWR (ራድኖር፣ ፔንስልቬንያ፣ ዩኤስኤ) ነው። በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው እንደገና የተዋሃደ የሰው ኢንሱሊን ከፊሸር ሳይንቲፊክ (ዋልትሃም፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ) ነው። የፍሎረሰንሴይን ኢሶቲዮሲያኔት (FITC) መለያ የተደረገበት የሰው ኢንሱሊን እና 4′፣ 6-ዲያሚዲኖ-2-ፌኒሊንዶል ዳይሃይድሮክሎራይድ (DAPI) የተገዙት ከሲግማ-አልድሪች (ኦክቪል፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) ነው። የሄፕጂ2 ሴል መስመር የተገኘው ከATCC (ማናሳስ፣ ቨርጂኒያ፣ ዩኤስኤ) ነው። ሌሎች ሁሉም ሬጀንቶች የትንታኔ ወይም የክሮሞቶግራፊ ደረጃ ነበሩ።
0.1% አሴቲክ አሲድ የያዘ ድርብ የተፈጨ ውሃ (DD ውሃ) ውስጥ በማሟሟት 1 mg/ml የሲኤስ መፍትሄ ያዘጋጁ። 1 mg/ml የቲፒፒ እና የኢንሱሊን መፍትሄዎችን በዲዲ ውሃ እና 0.1% አሴቲክ አሲድ በቅደም ተከተል በማሟሟት ያዘጋጁ። የቅድመ-ኢሙልሽን በፖሊትሮን PCU-2-110 ከፍተኛ ፍጥነት ያለው ሆሞጀኒዘር (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) ተዘጋጅቷል። የዝግጅት ሂደቱ እንደሚከተለው ነው፡ በመጀመሪያ፣ 2 ሚሊ ሊትር የቲፒፒ መፍትሄ ወደ 4 ሚሊ ሊትር የኢንሱሊን መፍትሄ ተጨምሮ ድብልቁ ለ30 ደቂቃዎች ተቀላቅሎ ሙሉ በሙሉ ተቀላቅሏል። ከዚያም የተቀላቀለው መፍትሄ በከፍተኛ ፍጥነት በማነሳሳት (10,000 rpm) ስር በሲሪንጅ በኩል ወደ ሲኤስ መፍትሄ ተጨምሯል። ድብልቆቹ ለ30 ደቂቃዎች በበረዶ መታጠቢያ ውስጥ በከፍተኛ ፍጥነት በማነሳሳት (15,000 rpm) ስር ተጠብቀው ነበር፣ እና የተሻገረ የኢንሱሊን NPs ለማግኘት በተወሰነ ፒኤች ተስተካክለዋል። የኢንሱሊን NPs ቅንጣት መጠንን የበለጠ ለማዋሃድ እና ለመቀነስ፣ ለ ተጨማሪ 30 ደቂቃ በበረዶ መታጠቢያ ውስጥ የፕሮቤ-አይነት ሶኒኬተር (UP 200ST፣ Hielscher Ultrasonics፣ Teltow፣ Germany) በመጠቀም።
የኢንሱሊን NPS በ25°ሴ በዲዲ ውሃ ውስጥ በመቀነስ የZ-አማካይ ዲያሜትር፣ የፖሊዲስፐርሲቲ ኢንዴክስ (PDI) እና የዜታ እምቅ ኃይልን በመጠቀም በLitesizer 500 (አንቶን ፓር፣ ግራዝ፣ ኦስትሪያ) በመጠቀም ተለዋዋጭ የብርሃን መበታተን (DLS) መለኪያዎችን በመጠቀም ተፈትነዋል። ሞርፎሎጂ እና የመጠን ስርጭት በሂታቺ H7600 ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (TEM) (ሂታቺ፣ ቶኪዮ፣ ጃፓን) ተለይተው ይታወቃሉ፣ እና ምስሎቹ በመቀጠልም በሂታቺ ኢሜጂንግ ሶፍትዌር (ሂታቺ፣ ቶኪዮ፣ ጃፓን) ተተነተኑ። የኢንሱሊን NPs የመክተት ቅልጥፍናን (EE) እና የመጫን አቅም (LC) ለመገምገም፣ NPs ወደ 100 kDa የሞለኪውላር ክብደት የተቆረጠ እና በ500 xg ለ30 ደቂቃ በሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። በማጣሪያው ውስጥ ያልተሸፈነው ኢንሱሊን በAgilent 1100 Series HPLC ሲስተም (Agilent፣ ሳንታ ክላራ፣ ካሊፎርኒያ፣ አሜሪካ) በመጠቀም ኳተርናሪ ፓምፕን በመጠቀም ተለካ። አውቶሳምፕለር፣ የአምድ ማሞቂያ እና የDAD መመርመሪያ። ኢንሱሊን በC18 አምድ (ዞርባክ፣ 3.5 μm፣ 4.6 ሚሜ × 150 ሚሜ፣ አጊለንት፣ ዩኤስኤ) ተተነተነ እና በ214 nm ተገኝቷል። የሞባይል ደረጃው አሴቶኒትሪል እና ውሃ ሲሆን 0.1% TFA፣ ከ10/90 እስከ 100/0 የሚደርሱ የግራዲየንት ሬሾዎችን የያዘ ሲሆን ለ10 ደቂቃዎችም ይሰራል። የሞባይል ደረጃው በ1.0 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ የፍሰት መጠን የተገፋ ነበር። የአምድ ሙቀት ወደ 20 °ሴ ተቀናብሯል። እኩልታዎችን በመጠቀም የEE እና የLC መቶኛዎችን ያሰሉ።(1) እና እኩልታ(2)።
የኢንሱሊን NPን ለማመቻቸት ከ2.0 እስከ 4.0 የሚደርሱ የተለያዩ የሲኤስ/ኢንሱሊን ሬሾዎች ተፈትነዋል። በዝግጅቱ ወቅት የተለያዩ የሲኤስ መፍትሄ መጠኖች ተጨምረዋል፣ የኢንሱሊን/ቲፒፒ ድብልቅ ግን ቋሚ ሆኖ ቆይቷል። ሁሉንም መፍትሄዎች (ኢንሱሊን፣ ቲፒፒ እና ሲኤስ) ከተጨመሩ በኋላ የድብልቁን ፒኤች በጥንቃቄ በመቆጣጠር የኢንሱሊን NPs ከ4.0 እስከ 6.5 ባለው የፒኤች ክልል ውስጥ ተዘጋጅተዋል። የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች EE እና የቅንጣት መጠን የኢንሱሊን NPs ምስረታ ለማሻሻል በተለያዩ የፒኤች እሴቶች እና የሲኤስ/ኢንሱሊን የጅምላ ሬሾዎች ተገምግመዋል።
የተመቻቹ የኢንሱሊን NPዎች በአሉሚኒየም መያዣው ላይ ተቀምጠው በቲሹ በተጣበቀ ቴፕ ተሸፍነዋል። በመቀጠልም የተጣበቁት ኮንቴይነሮች ትሪ ማድረቂያ ባለው የላብኮንኮ ፍሪዞን ፍሪዝ ማድረቂያ (ላብኮንኮ፣ ካንሳስ ሲቲ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) ውስጥ ተቀምጠዋል። የሙቀት መጠኑ እና የቫክዩም ግፊቱ ለመጀመሪያዎቹ 2 ሰዓታት -10 °ሴ፣ 0.350 ቶር እና 0 °ሴ እና 0.120 ቶር በቀሪው 24 ሰዓታት ደረቅ የኢንሱሊን NPs ለማግኘት ተቀምጠዋል።
የቡቺ ሚኒ ስፕሬይ ማድረቂያ ቢ-290 (ቡቺ፣ ፍላዊል፣ ስዊዘርላንድ) የታሸገ ኢንሱሊን ለማመንጨት ጥቅም ላይ ውሏል። የተመረጡት የማድረቂያ መለኪያዎች፡ የሙቀት መጠን 100°ሴ፣ የምግብ ፍሰት 3 ሊትር/ደቂቃ እና የጋዝ ፍሰት 4 ሊትር/ደቂቃ ነበሩ።
ከድርቀት በፊት እና በኋላ የኢንሱሊን NPs ተለይተው የታወቁት በFTIR-ATR ስፔክትሮስኮፒ ነው። የተሟጠጡ ናኖፓርቲክሎች እንዲሁም ነፃ ኢንሱሊን እና ቺቶሳን ሁለንተናዊ የATR ናሙና መለዋወጫ (ፐርኪንኤልመር፣ ዋልተም፣ ማሳቹሴትስ፣ ዩኤስኤ) የተገጠመለት ስፔክትረም 100 FTIR ስፔክትሮፎቶሜትር (ፐርኪንኤልመር፣ ዋልተም፣ ማሳቹሴትስ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ተተነተኑ። የምልክት አማካዮች የተገኙት ከ4000-600 ሴ.ሜ 2 ድግግሞሽ ክልል ውስጥ በ4 ሴ.ሜ 2 ጥራት ላይ ከ16 ቅኝቶች ነው።
የደረቅ ኢንሱሊን NPs ሞርፎሎጂ የተገመገመው በሄሊዮስ ናኖላብ 650 ፎከስድ ዮን ቢም-ስካኒንግ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (FIB-SEM) (FEI፣ ሂልስቦሮ፣ ኦሪገን፣ ዩኤስኤ) በተቀረጹ የቀዘቀዘ እና የሚረጭ የደረቀ የኢንሱሊን NPs በSEM ምስሎች ነው። ጥቅም ላይ የዋለው ዋናው መለኪያ ቮልቴጅ 5 keV እና የአሁኑ 30 mA ነበር።
ሁሉም የተሟሟ የኢንሱሊን NPs በዲዲ ውሃ ውስጥ እንደገና ተቀልጠዋል። የፓርቲክል መጠን፣ PDI፣ EE እና LC ከድርቀት በኋላ ጥራታቸውን ለመገምገም ቀደም ሲል በተጠቀሰው ተመሳሳይ ዘዴ እንደገና ተፈትነዋል። የአንሃይድሮኢንሱሊን NPs መረጋጋትም የተለካው ለረጅም ጊዜ ከተከማቸ በኋላ የNPs ባህሪያትን በመፈተሽ ነው። በዚህ ጥናት፣ ከድርቀት በኋላ ሁሉም NPs በማቀዝቀዣ ውስጥ ለሦስት ወራት ተከማችተዋል። ከሶስት ወራት ማከማቻ በኋላ፣ NPs ለሞርፎሎጂካል ቅንጣት መጠን፣ PDI፣ EE እና LC ተፈትነዋል።
ከድርቀት በኋላ የኢንሱሊን NPsን በመከላከል ረገድ ያለውን ውጤታማነት ለመገምገም 5 ሚሊ ሊትር የተዋሃዱ NPs በ45 ሚሊ ሊትር ውስጥ የተመሰለ የጨጓራ ​​ፈሳሽ (pH 1.2፣ 1% ፔፕሲን የያዘ)፣ የአንጀት ፈሳሽ (pH 6.8፣ 1% ትራይፕሲን የያዘ) ወይም የቺሞትሪፕሲን መፍትሄ (100 ግ/mL፣ በፎስፌት ቋት፣ pH 7.8) ውስጥ ይቀልጡ። እነዚህ NPs በ100 rpm የመፍትሄው የመነቃቃት ፍጥነት 500 μL በተለያዩ የጊዜ ነጥቦች ተሰብስቦ የኢንሱሊን ክምችት በHPLC ተወስኗል።
አዲስ የተዘጋጁ እና የተሟጠጡ የኢንሱሊን NPs በብልቃጥ ውስጥ የመልቀቂያ ባህሪ በዲያሊሲስ ቦርሳ ዘዴ (ሞለኪውላር ክብደት 100 kDa፣ Spectra Por Inc.) ተፈትኗል። አዲስ የተዘጋጁ እና የተገነቡ ደረቅ NPs በቅደም ተከተል በ pH 2.5፣ pH 6.6 እና pH 7.0 (0.1 M ፎስፌት-ቡፌሬድ ሳላይን፣ PBS) በፈሳሾች ውስጥ ዳይላይዝድ ተደርገዋል። ሁሉም ናሙናዎች በ200 rpm ያለማቋረጥ በመንቀጥቀጥ በ37 °C ተቆፍረዋል። ፈሳሹን ከ5 mL ዳያሊሲስ ከረጢት ውጭ በሚከተሉት ጊዜያት አስገቡት፡ 0.5፣ 1፣ 2፣ 3፣ 4 እና 6 ሰዓታት፣ እና ወዲያውኑ መጠኑን በአዲስ ዳይላይሴት ይሙሉት። በፈሳሹ ውስጥ ያለው የኢንሱሊን ብክለት በHPLC ተተነተነ፣ እና ከናኖፓርቲክሎች የሚወጣው የኢንሱሊን መጠን በናኖፓርቲክሎች ውስጥ ከተሸፈነው ነፃ ኢንሱሊን እና ከጠቅላላ ኢንሱሊን ጥምርታ (እኩልታ 3) ተሰልቷል።
የሰው ሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ የሴል መስመር የሄፕጂ2 ሴሎች በ60 ሚሜ ዲያሜትር ባላቸው ምግቦች ውስጥ 10% የፅንስ የከብት ሴረም፣ 100 IU/mL ፔኒሲሊን እና 100 μg/mL ስትሬፕቶማይሲን29 የያዘውን የዱልቤኮ ሞድፋይድ ኢግልስ ሜድ (DMEM) በመጠቀም አድጓል። ባህሎች በ37°ሴ፣ 95% አንጻራዊ እርጥበት እና 5% CO2 ተጠብቀዋል። ለመወሰድ ምርመራዎች፣ የሄፕጂ2 ሴሎች በ1 × 105 ሴሎች/ml በ8-ዌል ኑንክ ላብ-ቴክ ቻምበር ስላይድ ሲስተም (ቴርሞ ፊሸር፣ ኒውዮርክ፣ ዩኤስኤ) ላይ ተዘርተዋል። ለሳይቶቶክሲካል ምርመራዎች፣ በ5 × 104 ሴሎች/ሚሊ ጥግግት በ96-ዌል ሳህኖች (ኮርኒንግ፣ ኒውዮርክ፣ ዩኤስኤ) ውስጥ ተዘርተዋል።
የኤምቲቲ ምርመራ አዲስ የተዘጋጀ እና የተሟጠጠ የኢንሱሊን NPs30 ሳይቶቶክሲክነትን ለመገምገም ጥቅም ላይ ውሏል። የሄፕጂ2 ሴሎች በ96-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ በ5 × 104 ሴሎች/mL ጥግግት ውስጥ ተዘርተው ከሙከራው በፊት ለ7 ቀናት ተክለዋል። የኢንሱሊን NPs በተለያዩ ክምችቶች (ከ50 እስከ 500 μg/mL) በባህል መካከለኛ ውስጥ ተቀላቅለው ከዚያም ለሴሎች ተሰጥተዋል። ከ24 ሰዓታት የመታቀፉን ጊዜ በኋላ፣ ሴሎች በፒቢኤስ 3 ጊዜ ታጥበው ለተጨማሪ 4 ሰዓታት 0.5 mg/mTT ባለው መካከለኛ ታጥበዋል። የሳይቶቶክሲክነት መጠን የተገመገመው በ570 nm ውስጥ የቢጫ ቴትራዞሊየም MTT ወደ ወይንጠጅ ፎርማዛን የኢንዛይም ቅነሳን በቴካን ኢንፊኒት M200 ፕሮ ስፔክትሮፎቶሜትር ሳህን አንባቢ (ቴካን፣ ማኔዶርፍ፣ ስዊዘርላንድ) በመለካት ነው።
የኤንፒዎች ሴሉላር ቅበላ ውጤታማነት በኮንፎካል ሌዘር ቅኝት ማይክሮስኮፕ እና በፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና ተፈትኗል። የኑንክ ላብ-ቴክ ቻምበር ስላይድ ሲስተም እያንዳንዱ ጉድጓድ በነጻ FITC-ኢንሱሊን፣ FITC-ኢንሱሊን-የተጫኑ NPs ታክሟል፣ እና 25 μg/mL የተሟሟ FITC-ኢንሱሊን NPs በተመሳሳይ ክምችት ታክሟል እና ለ4 ሰዓታት ታፍኗል። ሴሎች በPBS 3 ጊዜ ታጥበው በ4% ፓራፎርማዴይድ ተስተካክለዋል። ኒውክሊየሶች በ4′፣6-ዲያሚዲኖ-2-ፌኒሊንዶል (DAPI) ታሽገዋል። የኢንሱሊን አካባቢያዊነት በኦሊምፐስ FV1000 ሌዘር ቅኝት/ሁለት-ፎቶን ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ (ኦሊምፐስ፣ ሺንጁኩ ሲቲ፣ ቶኪዮ፣ ጃፓን) በመጠቀም ታይቷል። ለፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና፣ ተመሳሳይ የ10 μg/mL ነፃ FITC-ኢንሱሊን፣ FITC-ኢንሱሊን-የተጫኑ NPs እና እንደገና የተሟሉ የተሟሉ FITC-ኢንሱሊን NPs በሄፕጂ2 ሴሎች እና በ96-ጉድጓድ ሳህኖች ላይ ተጨምረዋል። ለ4 ሰዓታት ታጥቧል። ከ4 ሰዓታት በኋላ፣ ሴሎች ተወግደው በFBS 3 ጊዜ ታጥበዋል። በአንድ ናሙና 5 × 104 ሴሎች በBD LSR II ፍሰት ሳይቶሜትር (BD፣ Franklin Lakes፣ New Jersey፣ United States) ተተነተኑ።
ሁሉም እሴቶች እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ይገለፃሉ። በሁሉም ቡድኖች መካከል ያሉት ንፅፅሮች ለማክ (IBM፣ Endicott፣ New York፣ USA) በ IBM SPSS Statistics 26 በአንድ አቅጣጫ ANOVA ወይም t-test በመጠቀም ተገምግመዋል እና p < 0.05 በስታቲስቲክስ ጉልህ እንደሆነ ተቆጥሯል።
ይህ ጥናት ከመደበኛ የማቀዝቀዣ-ማድረቂያ ዘዴዎች ጋር ሲነጻጸር የሚረጭ ማድረቅ ተለዋዋጭነትን እና የጅምላ ወኪሎችን ወይም ክሪዮፕሮቴክታንቶችን አቅም እና ከፍተኛ የጭነት አቅምን በመጠቀም በተሻለ ሁኔታ እንደገና መገንባትን ያሳያል። የተመቻቹ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች አማካይ የቅንጣት መጠን 318 nm እና የ encapsulation ውጤታማነት 99.4% አስገኝተዋል። ከድርቀት በኋላ የSEM እና የFTIR ውጤቶች እንደሚያሳዩት ሉላዊ መዋቅሩ በማኒቶል እና ያለማኒቶል በተረጨ እና ያለማኒቶል በተረጨ NPs ውስጥ ብቻ እንደተጠበቀ ነው፣ ነገር ግን ማኒቶል የሌላቸው ሊዮፊል የተረጩ NPs በድርቅ ወቅት መበስበስ ችለዋል። በመልሶ ማቋቋም ችሎታ ሙከራ፣ ማኒቶል ሳይኖር የሚረጩ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች በመልሶ ግንባታው ወቅት ትንሹን አማካይ የቅንጣት መጠን እና ከፍተኛውን ጭነት አሳይተዋል። የእነዚህ ሁሉ የተረፉ NPs የመልቀቂያ ባህሪያት እንደሚያሳዩት በ pH = 2.5 እና pH = 7 መፍትሄዎች በፍጥነት እንደተለቀቁ እና በ pH = 6.5 መፍትሄ ውስጥ በጣም የተረጋጋ መሆኑን አሳይተዋል። ከሌሎች እንደገና ከተፈቱ የተረፉ NPs ጋር ሲነጻጸር፣ NPs ያለመርጨት ደርቀዋል ማኒቶል ፈጣኑን ልቀት አሳይቷል። ይህ ውጤት በሴሉላር ቅበላ ምርመራ ውስጥ ከታየው ጋር የሚስማማ ነው፣ ምክንያቱም ማኒቶል በሌለበት ጊዜ የሚረጩ የደረቁ ኤንፒዎች አዲስ የተዘጋጁ ኤንፒዎችን የሴሉላር ቅበላ ውጤታማነት ሙሉ በሙሉ እንደጠበቁ ነው። እነዚህ ውጤቶች በማኒቶል-ነጻ የሚረጭ ማድረቂያ የተዘጋጁ ደረቅ የኢንሱሊን ናኖፓርቲክሎች እንደ የአፍ ውስጥ ታብሌቶች ወይም ባዮአድሄሲቭ ፊልሞች ባሉ ሌሎች አንሃይድሮስ የመጠን ቅጾች ውስጥ ለተጨማሪ ሂደት በጣም ተስማሚ እንደሆኑ ይጠቁማሉ።
በአእምሯዊ ንብረት ጉዳዮች ምክንያት፣ በአሁኑ ጥናት ወቅት የተፈጠሩ እና/ወይም የተተነተኑ የውሂብ ስብስቦች በይፋ የሚገኙ አይደሉም፣ ነገር ግን ምክንያታዊ በሆነ ጥያቄ ከየደራሲዎቹ ይገኛሉ።
ካጋን፣ ኤ. ዓይነት 2 የስኳር በሽታ፡- ማህበራዊና ሳይንሳዊ አመጣጥ፣ የሕክምና ችግሮች እና ለታካሚዎችና ለሌሎች አንድምታዎች። (ማክፋርላን፣ 2009)።
ሲንግ፣ ኤፒ፣ ጉዎ፣ ዋይ.፣ ሲንግ፣ ኤ.፣ ዢ፣ ደብሊው. እና ጂያንግ፣ ፒ. የኢንሱሊን ኢንካፕሱሌሽን እድገት፡ አሁን በአፍ የሚሰጥ አስተዳደር ይቻላል? ጄ. ፋርማሲ.ባዮ-ፋርማሲ.ሪዘርቭ.1፣ 74–92 (2019)።
ዎንግ፣ ሲአይ፣ አል-ሳላሚ፣ ኤች. እና ዳስ፣ ሲአር ለስኳር ህመም ህክምና በአፍ የሚወሰድ ኢንሱሊን የተጫነ የሊፖሶም አቅርቦት ስርዓቶች ውስጥ የቅርብ ጊዜ እድገቶች።Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).