ጽሑፉ “የጥራጥሬዎችን ለበሽታ አምጪ ተህዋሲያን እና ተባዮች የመቋቋም አቅምን ማሻሻል” የምርምር ርዕስ አካል ነው፣ ሁሉንም 5 መጣጥፎች ይመልከቱ
የፈንገስ ተክል በሽታ መንስኤ የሆነው ኒክሮሲስ ስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም (ሊብ.) ደ ባሪ የተለያዩ አስተናጋጅ ተክሎችን ለመበከል ባለብዙ ደረጃ ስትራቴጂ ይጠቀማል። ይህ ጥናት ሌሎች አስፈላጊ አሚኖ አሲዶችን ውህደት የሚያነቃቃ ፕሮቲን ያልሆነውን ዳይሚን ኤል-ኦርኒቲንን መጠቀምን ይጠቁማል፣ ይህም የፋሴኦለስ ፉርጋሪስ ኤል. በፕሴዩሞናስ ስክሌሮቲዮረም ምክንያት ለሚመጣው ነጭ ሻጋታ ሞለኪውላዊ፣ ፊዚዮሎጂያዊ እና ባዮኬሚካላዊ ምላሾችን ለማሻሻል እንደ አማራጭ የአስተዳደር ስትራቴጂ ነው። በብልቃጥ ውስጥ የተደረጉ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት L-ኦርኒቲን የኤስ. ፒሬኖይዶሳ የማይሴሊያል እድገትን በከፍተኛ ሁኔታ አግዷል። ከዚህም በላይ፣ በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ የነጭ ሻጋታ ክብደትን በእጅጉ ሊቀንስ ይችላል። በተጨማሪም፣ L-ኦርኒቲን የታከሙ ተክሎችን እድገት አነቃቅቷል፣ ይህም የተፈተኑት የL-ኦርኒቲን ክምችት ለተታከሙ ተክሎች ፊቶቶክሲካል እንዳልሆነ ያሳያል። በተጨማሪም፣ L-ornithine የኢንዛይም ያልሆኑ አንቲኦክሲደንቶች (ሙሉ በሙሉ የሚሟሟ ፊኖሊክ እና ፍሌቮኖይድ) እና የኢንዛይም አንቲኦክሲደንቶች (ካታላሴ (CAT)፣ ፔሮክሳይዳሴ (POX) እና ፖሊፊኖል ኦክሲዳሴ (PPO)) አገላለጽን አሻሽሏል፣ እንዲሁም ሶስት አንቲኦክሲደንት-ተዛማጅ ጂኖች (PvCAT1፣ PvSOD እና PvGR) አገላለጽን ጨምሯል። በተጨማሪም፣ በሲሊኮ ትንተና፣ በኤስ. ስክሌሮቲዮረም ጂኖም ውስጥ የተቀመጠ ኦክሳሎአሴቴት አሲቲልሃይድሮላዝ (SsOAH) ፕሮቲን መኖሩን አሳይቷል፣ ይህም ከኦክሳሎአሴቴት አሲቲልሃይድሮላዝ (SsOAH) ፕሮቲኖች ጋር በጣም ተመሳሳይ የሆነ በተግባራዊ ትንተና፣ በተጠበቁ ጎራዎች እና በቶፖሎጂ ረገድ በጣም ተመሳሳይ ነበር። የሚገርመው፣ የL-ኦርኒቲን ወደ ድንች ዴክስትሮዝ መረቅ (PDB) መካከለኛ መጨመር በኤስ. ስክሌሮቲዮረም ማይሴሊያ ውስጥ የSsOAH ጂን አገላለጽን በእጅጉ ቀንሷል። በተመሳሳይ፣ የL-ornithine ውጫዊ አተገባበር ከታከሙ ተክሎች በተሰበሰበው የፈንገስ ማይሴሊያ ውስጥ የSsOAH ጂን አገላለጽን በእጅጉ ቀንሷል። በመጨረሻም፣ የL-ornithine አተገባበር በPDB መካከለኛ እና በተበከሉ ቅጠሎች ውስጥ የኦክሳሊክ አሲድ ፈሳሽን በእጅጉ ቀንሷል። ለማጠቃለል፣ L-ornithine የሬዶክስ ሁኔታን በመጠበቅ እንዲሁም የተበከሉ ተክሎችን የመከላከያ ምላሽ በማሳደግ ረገድ ቁልፍ ሚና ይጫወታል። የዚህ ጥናት ውጤቶች ነጭ ሻጋታን ለመቆጣጠር እና በባቄላ ምርት እና በሌሎች ሰብሎች ላይ የሚያሳድረውን ተጽዕኖ ለመቀነስ አዳዲስ እና ለአካባቢ ተስማሚ የሆኑ ዘዴዎችን በማዘጋጀት ረገድ ሊረዱ ይችላሉ።
ነጭ ሻጋታ፣ በኔክሮትሮፊክ ፈንገስ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ምክንያት የሚመጣ፣ ለአለም አቀፍ የባቄላ (Phaseolus vulgaris L.) ምርት ከባድ ስጋት የሚፈጥር አውዳሚ፣ ምርትን የሚቀንስ በሽታ ነው (Bolton et al., 2006)። Sclerotinia sclerotiorum ለመቆጣጠር በጣም አስቸጋሪ ከሆኑ የአፈር ወለድ የፈንገስ ተክሎች በሽታ አምጪ ተህዋሲያን አንዱ ሲሆን ከ600 በላይ የእፅዋት ዝርያዎች ሰፊ አስተናጋጅ እና የአስተናጋጅ ሕብረ ሕዋሳትን ባልተወሰነ መንገድ በፍጥነት የማቃጠል ችሎታ አለው (Liang and Rollins, 2018)። ባልተመቹ ሁኔታዎች ውስጥ፣ በአፈር ውስጥ 'ስክሌሮቲያ' ተብለው የሚጠሩ ጥቁር፣ ጠንካራ፣ ዘር መሰል መዋቅሮች ወይም እንደ ነጭ፣ ለስላሳ እድገቶች በማይሴሊየም ወይም በተበከሉ ተክሎች ግንድ ውስጥ (Schwartz et al., 2005) ውስጥ ለረጅም ጊዜ እንቅልፍ ሳይወስድ ይቆያል። ኤስ. ስክሌሮቲዮረም ስክሌሮቲያን የመፍጠር ችሎታ አለው፣ ይህም በተበከሉ እርሻዎች ውስጥ ለረጅም ጊዜ እንዲቆይ እና በበሽታ ወቅት እንዲቆይ ያስችለዋል (ሽዋርትዝ እና ሌሎች፣ 2005)። ስክሌሮቲያ በንጥረ ነገሮች የበለፀገ ነው፣ ለረጅም ጊዜ በአፈር ውስጥ ሊቆይ ይችላል፣ እና ለቀጣይ ኢንፌክሽኖች እንደ ዋና ኢንኦኩለም ሆኖ ያገለግላል (ሽዋርትዝ እና ሌሎች፣ 2005)። ምቹ በሆኑ ሁኔታዎች ውስጥ፣ ስክሌሮቲያ ይበቅላል እና በአየር ላይ ያሉ ስፖሮችን ያመርታል፣ ይህም አበባዎችን፣ ግንዶችን ወይም እንጨቶችን ጨምሮ ነገር ግን በእነዚህ ብቻ የተወሰነ አይደለም (ሽዋርትዝ እና ሌሎች፣ 2005)።
ስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም የእፅዋትን እፅዋት ለመበከል ባለብዙ ደረጃ ስትራቴጂ ይጠቀማል፣ ይህም ከስክሌሮቲያል ማብቀል እስከ ምልክት እድገት ድረስ ተከታታይ የተቀናጁ ክስተቶችን ያካትታል። መጀመሪያ ላይ ኤስ. ስክሌሮቲዮረም አፖቴሺያ ከሚባሉ የእንጉዳይ መሰል መዋቅሮች የተንጠለጠሉ ስፖሮችን (አስኮስፖሬስ ተብለው ይጠራሉ) ያመነጫል፣ እነዚህም በአየር ላይ የሚወጡ እና በተበከሉ የእፅዋት ፍርስራሾች ላይ ወደማይንቀሳቀስ ስክሌሮቲያ የሚያድጉ ይሆናሉ (ቦልተን እና ሌሎች፣ 2006)። ከዚያም ፈንገሱ የእፅዋት ሴል ግድግዳ ፒኤችን ለመቆጣጠር፣ የኢንዛይም መበላሸት እና የቲሹ ወረራዎችን ለማስተዋወቅ (ሄጌደስ እና ሪመር፣ 2005) እና የአስተናጋጁን ተክል ኦክሲዴቲቭ ፍንዳታ ለመግታት ኦክሳሊክ አሲድ የተባለውን የቫይረሰንት ፋክተር ያመነጫል። ይህ የአሲድነት ሂደት የእፅዋት ሴል ግድግዳን ያዳክማል፣ የፈንገስ ሴል ግድግዳ አዋራጅ ኢንዛይሞችን (CWDEs) መደበኛ እና ቀልጣፋ አሠራር ምቹ አካባቢን ይሰጣል፣ ይህም በሽታ አምጪ ተህዋሲያን አካላዊ እንቅፋትን እንዲያሸንፍ እና በአስተናጋጁ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ እንዲገባ ያስችለዋል (ማርሲያኖ እና ሌሎች፣ 1983)። ኤስ. ስክሌሮቲዮረም አንዴ ከገባ በኋላ እንደ ፖሊጋላክቱሮኔዝ እና ሴሉላሴ ያሉ በርካታ CWDEዎችን ያመነጫል፣ ይህም በተበከሉ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ስርጭቱን ያመቻቻል እና የቲሹ ኒክሮሲስ ያስከትላል። የቁስሎች እና የሃይፋል ምንጣፎች እድገት የነጭ ሻጋታ ባህሪያትን ያስከትላል (ሄጌደስ እና ሪመር፣ 2005)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ አስተናጋጅ ተክሎች በንድፍ ማወቂያ ተቀባዮች (PRRs) አማካኝነት በሽታ አምጪ ተህዋሲያንን የሚያገናኙ ሞለኪውላዊ ቅጦችን (PAMPs) ያውቃሉ፣ ይህም በመጨረሻ የመከላከያ ምላሾችን የሚያነቃቁ ተከታታይ የምልክት ክስተቶችን ያስነሳል።
ለብዙ አሥርተ ዓመታት የበሽታ መቆጣጠሪያ ጥረቶች ቢኖሩም፣ እንደሌሎች የንግድ ሰብሎች ሁሉ፣ እንደ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን መቋቋም፣ መትረፍ እና መላመድ ምክንያት በቂ የመቋቋም ጀርም ፕላዝማ እጥረት በባቄላ ውስጥ ይቀራል። ስለዚህ የበሽታ አያያዝ እጅግ በጣም ፈታኝ ነው እና የባህል ልምዶችን፣ የባዮሎጂካል ቁጥጥርን እና የኬሚካል ፈንገስ መድኃኒቶችን ጥምረት የሚያካትት የተቀናጀ፣ ባለብዙ ገጽታ ስትራቴጂ ይፈልጋል (ኦሱሊቫን እና ሌሎች፣ 2021)። የነጭ ሻጋታ ኬሚካል ቁጥጥር በጣም ውጤታማው ነው ምክንያቱም ፈንገስ መድኃኒቶች በትክክል እና በትክክለኛው ጊዜ ሲተገበሩ የበሽታውን ስርጭት በብቃት መቆጣጠር፣ የኢንፌክሽን ክብደትን መቀነስ እና የምርት ኪሳራዎችን መቀነስ ይችላሉ። ሆኖም፣ ከመጠን በላይ መጠቀም እና በፈንገስ መድኃኒቶች ላይ ከመጠን በላይ መታመን የኤስ. ስክሌሮቲዮረም መቋቋም የሚችሉ ዝርያዎች እንዲፈጠሩ እና ኢላማ ያልሆኑ ህዋሳትን፣ የአፈር ጤናን እና የውሃ ጥራትን አሉታዊ ተጽዕኖ ሊያሳድሩ ይችላሉ (ለ ኮይንቴ እና ሌሎች፣ 2016፤ ሴሬሲኒ እና ሌሎች፣ 2024)። ስለዚህ፣ ለአካባቢ ተስማሚ የሆኑ አማራጮችን ማግኘት ከፍተኛ ቅድሚያ የሚሰጠው ጉዳይ ሆኗል።
እንደ ፑትሬሲን፣ ስፐርሚዲን፣ ስፐርሚይን እና ካዳቬሪን ያሉ ፖሊአሚንስ (PAs) በአፈር ውስጥ ከሚተላለፉ የእፅዋት በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ጋር በተያያዘ ተስፋ ሰጪ አማራጮች ሆነው ሊያገለግሉ ይችላሉ፣ በዚህም ምክንያት አደገኛ የኬሚካል ፈንገስ ማጥፊያዎችን መጠቀምን ሙሉ በሙሉ ወይም በከፊል ይቀንሳሉ (ኔሄላ እና ሌሎች፣ 2024፤ ዪ እና ሌሎች፣ 2024)። በከፍተኛ እፅዋት ውስጥ፣ PAs በብዙ የፊዚዮሎጂ ሂደቶች ውስጥ ይሳተፋሉ፣ ከእነዚህም ውስጥ የሴል ክፍፍል፣ ልዩነት እና ለአቢዮቲክ እና ባዮቲክ ጭንቀቶች ምላሽ ይሰጣሉ (ኪሊኒ እና ኔሄላ፣ 2020)። እንደ አንቲኦክሲደንትስ ሆነው ሊያገለግሉ፣ ​​ምላሽ ሰጪ የኦክስጅን ዝርያዎችን (ROS) ለማስወገድ ሊረዱ፣ ሬዶክስ ሆሞስታሲስን (ኔሄላ እና ኪሊኒ፣ 2023) እንዲጠብቁ፣ ከመከላከያ ጋር የተያያዙ ጂኖችን (ሮሜሮ እና ሌሎች፣ 2018)፣ የተለያዩ የሜታቦሊክ መንገዶችን (ኔሄላ እና ኪሊኒ፣ 2023)፣ ኢንዶጅናል ፊቶሆርሞንስን (ኔሄላ እና ኪሊኒ፣ 2019) ማስተካከል፣ ስልታዊ የሆነ የመቋቋም አቅም (SAR) ማቋቋም እና የእፅዋት-በሽታ አምጪ ግንኙነቶችን መቆጣጠር ይችላሉ (ኔሄላ እና ኪሊኒ፣ 2020፤ አሲጃ እና ሌሎች፣ 2022፤ ቼርዎኒኢክ፣ 2022)። በእፅዋት መከላከያ ውስጥ የPAዎች ልዩ ስልቶች እና ሚናዎች እንደ የእፅዋት ዝርያዎች፣ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን እና የአካባቢ ሁኔታዎች እንደሚለያዩ ልብ ሊባል ይገባል። በእፅዋት ውስጥ በጣም በብዛት የሚገኘው PA ከአስፈላጊው ፖሊአሚን L-ornithine (ኪሊኒ እና ኔሄላ፣ 2020) ባዮሲንተሲስ የተሰራ ነው።
ኤል-ኦርኒቲን በእፅዋት እድገትና ልማት ውስጥ በርካታ ሚናዎችን ይጫወታል። ለምሳሌ፣ ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በሩዝ (ኦሪዛ ሳቲቫ) ውስጥ ኦርኒቲን ከናይትሮጂን መልሶ ጥቅም ላይ ማዋል ጋር ሊያያዝ ይችላል (ሊዩ እና ሌሎች፣ 2018)፣ የሩዝ ምርት፣ ጥራት እና መዓዛ (ሉ እና ሌሎች፣ 2020) እና የውሃ ጭንቀት ምላሽ (ያንግ እና ሌሎች፣ 2000)። በተጨማሪም፣ የኤል-ኦርኒቲን ውጫዊ አተገባበር በስኳር ቢት (ቤታ ቩልጋሪስ) (ሁሴን እና ሌሎች፣ 2019) ውስጥ የድርቅ መቻቻልን በእጅጉ ጨምሯል እና በሽንኩርት (አሊየም ሴፓ) (Çavuşoǧlu እና Çavuşoǧlu, 2021) እና በካሼው (አናካርዲየም ኦክሲደንታል) ተክሎች ውስጥ የጨው ውጥረትን ቀንሷል (ዳ ሮቻ እና ሌሎች፣ 2012)። የኤል-ኦርኒቲን በአባዮቲክ ውጥረት መከላከያ ውስጥ ያለው ሚና በታከሙ ተክሎች ውስጥ በፕሮላይን ክምችት ውስጥ ባለው ተሳትፎ ምክንያት ሊሆን ይችላል። ለምሳሌ፣ እንደ ኦርኒቲን ዴልታ አሚኖትራንስፈርሴ (ዴልታ-ኦኤቲ) እና ፕሮሊን ዴሃይድሮጂኔዝ (ፕሮዲኤች1 እና ፕሮዲኤች2) ጂኖች ያሉ ከፕሮሊን ሜታቦሊዝም ጋር የተያያዙ ጂኖች ቀደም ሲል ኒኮቲያና ቤንታሚያና እና አረብቢዶፕሲስ ታሊያናን ከአስተናጋጅነት ውጪ ከሆኑ የፕሴዩዶሞናስ ሲሪንጌ ዝርያዎች (ሴንቲል-ኩማር እና ማይሶር፣ 2012) በመከላከል ላይ እንደሚሳተፉ ተዘግቧል። በሌላ በኩል ደግሞ ለበሽታ አምጪ ተህዋሲያን እድገት የፈንገስ ኦርኒቲን ዴካርቦክሲላዝ (ኦዲሲ) ያስፈልጋል (ሲንግ እና ሌሎች፣ 2020)። በአስተናጋጅ-ኢንዱሴሽን ጂን ዝምታን (HIGS) በኩል የፉሳሪየም ኦክሲስፖረም ኤፍ. ስፒ. ሊኮፐርሲሲን ODC ኢላማ ማድረግ የቲማቲም ተክሎችን ለፉሳሪየም ዊልት የመቋቋም አቅማቸውን በእጅጉ ጨምሯል (ሲንግ እና ሌሎች፣ 2020)። ሆኖም፣ እንደ ፋይቶፓቶጅንስ ባሉ ባዮቲክ ጭንቀቶች ላይ የውጭ ኦርኒቲን አተገባበር ያለው እምቅ ሚና በደንብ አልተጠናም። ከሁሉም በላይ ደግሞ ኦርኒቲን በበሽታ መቋቋም እና ተያያዥ ባዮኬሚካላዊ እና ፊዚዮሎጂያዊ ክስተቶች ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ በአብዛኛው አልተመረመረም።
የጥራጥሬዎችን የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢንፌክሽን ውስብስብነት መረዳት ውጤታማ የቁጥጥር ስልቶችን ለማዘጋጀት አስፈላጊ ነው። በዚህ ጥናት ውስጥ፣ የጥራጥሬ ተክሎችን ለስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም ኢንፌክሽን የመከላከያ ዘዴዎችን እና የመቋቋም አቅምን ለማሳደግ ቁልፍ ሚና የሆነውን ዳይሚን ኤል-ኦርኒቲንን እምቅ ሚና ለመለየት አቅደናል። በበሽታው የተጠቁ ተክሎችን የመከላከያ ምላሾችን ከማሻሻል በተጨማሪ ኤል-ኦርኒቲን የሬዶክስ ሁኔታን በመጠበቅ ረገድ ቁልፍ ሚና እንደሚጫወት እንገምታለን። የኤል-ኦርኒቲን እምቅ ተፅእኖዎች ከኢንዛይማቲክ እና ኢንዛይማቲክ ያልሆኑ ፀረ-ኦክሲዳንት መከላከያ ዘዴዎች ቁጥጥር እና ከፈንገስ በሽታ አምጪነት/የቫይረስ መንስኤዎች እና ተያያዥ ፕሮቲኖች ጋር ጣልቃ መግባት ጋር የተያያዙ መሆናቸውን እንጠቁማለን። ይህ የኤል-ኦርኒቲን ድርብ ተግባር የነጭ ሻጋታን ተጽእኖ ለመቀነስ እና የተለመዱ የጥራጥሬ ሰብሎችን ለዚህ ኃይለኛ የፈንገስ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን የመቋቋም አቅምን ለማሳደግ ዘላቂ ስትራቴጂ ተስፋ ሰጪ እጩ ያደርገዋል። የአሁኑ ጥናት ውጤቶች ነጭ ሻጋታን ለመቆጣጠር እና በጥራጥሬ ምርት ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመቀነስ አዳዲስ፣ ለአካባቢ ተስማሚ የሆኑ ዘዴዎችን በማዘጋጀት ረገድ ሊረዱ ይችላሉ።
በዚህ ጥናት ውስጥ፣ ለሙከራ ያህል ተጋላጭ የሆነ የተለመደ የባቄላ ዝርያ የሆነው ጊዛ 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) እንደ የሙከራ ቁሳቁስ ጥቅም ላይ ውሏል። ጤናማ ዘሮች በሌጉም ምርምር ክፍል፣ በመስክ ሰብሎች ምርምር ተቋም (FCRI)፣ በግብርና ምርምር ማዕከል (ARC)፣ ግብፅ በደግነት ተሰጥተዋል። አምስት ዘሮች በፕላስቲክ ማሰሮዎች (ውስጣዊ ዲያሜትር 35 ሴ.ሜ፣ ጥልቀት 50 ሴ.ሜ) ውስጥ በአረንጓዴ ቤቶች (25 ± 2 °C፣ አንጻራዊ እርጥበት 75 ± 1%፣ 8 ሰዓት ብርሃን/16 ሰዓት ጨለማ) በተሞላ በኤስ. ስክሌሮቲዮረም በተበከለ አፈር ውስጥ ተዘርተዋል። ከተዘራ በኋላ ከ7-10 ቀናት ውስጥ (DPS)፣ ችግኞቹ በእያንዳንዱ ማሰሮ ውስጥ ወጥ የሆነ እድገት ያላቸው ሁለት ችግኞችን እና ሶስት ሙሉ በሙሉ የተስፋፉ ቅጠሎችን ብቻ እንዲተዉ ቀጭነዋል። ሁሉም በድስት ውስጥ የተተከሉ ተክሎች በየሁለት ሳምንቱ አንድ ጊዜ ውሃ ያጠጡ እና ለተጠቀሰው ዝርያ በሚመከረው መጠን በየወሩ ይዳብራሉ።
500 ሚ.ግ/ሊ የL-ornithinediamine (እንዲሁም (+)-(S)-2,5-ዲያሚኖፔንታኖይክ አሲድ፤ ሲግማ-አልድሪች፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን በመባልም የሚታወቀው) ለማዘጋጀት፣ 50 ሚ.ግ. በመጀመሪያ በ100 ሚሊ ሊትር ንፁህ የተቀዳ ውሃ ውስጥ ሟሟል። የክምችቱ መፍትሄ ከዚያም ተቀልጦ በቀጣዮቹ ሙከራዎች ጥቅም ላይ ውሏል። በአጭሩ፣ ስድስት ተከታታይ የL-ornithine ክምችት (12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100 እና 125 ሚ.ግ/ሊ) በብልቃጥ ውስጥ ተፈትነዋል። በተጨማሪም፣ ንፁህ የተቀዳ ውሃ እንደ አሉታዊ መቆጣጠሪያ (ሞክ) እና የንግድ ፈንገስ “ሪዞሌክስ-ቲ” 50% እርጥብ ታብሌት ዱቄት (ቶክሎፎስ-ሜቲል 20% + ቲራም 30%፤ KZ-ካፍር ኤል ዛያት ፀረ-ተባይ እና ኬሚካሎች ኩባንያ፣ ካፍር ኤል ዛያት፣ የጋርቢያ ግዛት፣ ግብፅ) እንደ አዎንታዊ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውሏል። የንግድ ፈንገስ መድኃኒት "ሪዞሌክስ-ቲ" በአምስት ክምችቶች (2፣ 4፣ 6፣ 8 እና 10 ሚ.ግ/ሊ) በብልቃጥ ውስጥ ተፈትኗል።
የነጭ ሻጋታ የተለመዱ ምልክቶችን የሚያሳዩ የተለመዱ የባቄላ ግንዶች እና የፖድ ናሙናዎች ከንግድ እርሻዎች የተሰበሰቡ ናቸው። ምንም እንኳን አብዛኛዎቹ የተበከሉ የእፅዋት ቁሳቁሶች በዝርያዎች/በተለያዩ ዝርያዎች (በቀላሉ ሊጋለጥ የሚችል የንግድ ዝርያ ጂዛ 3) ቢለዩም፣ ሌሎቹ፣ በተለይም ከአካባቢው ገበያዎች የተገኙት፣ የማይታወቁ ዝርያዎች ነበሩ። የተሰበሰቡት የተበከሉ ቁሳቁሶች በመጀመሪያ ለ3 ደቂቃዎች በ0.5% ሶዲየም ሃይፖክሎራይት መፍትሄ ተበክለዋል፣ ከዚያም ብዙ ጊዜ በንፁህ የተቀዳ ውሃ ታጥበው ከመጠን በላይ ውሃ ለማስወገድ በንፁህ ማጣሪያ ወረቀት ተጠርገዋል። ከዚያም የተበከሉት የአካል ክፍሎች ከመሃል ህብረ ህዋስ (በጤናማ እና በተበከሉ ሕብረ ሕዋሳት መካከል) ወደ ትናንሽ ቁርጥራጮች ተቆርጠዋል፣ በድንች ዴክስትሮዝ አጋር (PDA) መካከለኛ ላይ ተክለዋል እና በ25 ± 2 °C ለ5 ቀናት በ12 ሰዓት ብርሃን/12 ሰዓት ጨለማ ዑደት ተጠብቀው የስክሌሮቲያ መፈጠርን ለማነቃቃት ተችሏል። የማይሴሊያል ጫፍ ዘዴ ከተደባለቁ ወይም ከተበከሉ ባህሎች የፈንገስ ተለይቶችን ለማጽዳትም ጥቅም ላይ ውሏል። የተጣራው የፈንገስ ዝርያ ለመጀመሪያ ጊዜ በባህላዊ ሞርፎሎጂካል ባህሪያቱ ላይ ተመስርቶ የተገኘ ሲሆን ከዚያም በአጉሊ መነጽር ባህሪያት ላይ ተመስርቶ ኤስ. ስክሌሮቲዮረም መሆኑን አረጋግጧል። በመጨረሻም፣ ሁሉም የተነጹ ዝርያዎች በቀላሉ በሚታወቀው የጋራ የባቄላ ዝርያ ላይ የኮኮችን ቅድመ ሁኔታ ለማሟላት በሽታ አምጪ ተሕዋስያን ተፈትነዋል።
በተጨማሪም፣ በጣም ወራሪ የሆነው ኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት (ኢሶሌት #3) በዋይት እና ሌሎች፣ 1990፤ ባቱሮ-ሲየስኒቭስካ እና ሌሎች፣ 2017 እንደተገለጸው በውስጣዊ የተገለበጠ ስፔሰር (ITS) ቅደም ተከተል ላይ ተመስርቶ ተረጋግጧል። በአጭሩ፣ ኢሶሌት በድንች ዴክስትሮዝ መረቅ (PDB) ውስጥ ተቀርፀው ለ5-7 ቀናት በ25 ± 2 °ሴ እንዲታቀፉ ተደርጓል። ከዚያም የፈንገስ ማይሴሊየም ተሰብስቦ በቺዝ ጨርቅ ተጣርቶ ሁለት ጊዜ በጸዳ ውሃ ታጥቦ በጸዳ ማጣሪያ ወረቀት ደርቋል። ጂኖሚክ ዲኤንኤ በፈጣን-ዲኤንኤ™ ፈንገስ/ባክቴሪያል ሚኒፕሪፕ ኪት (ኩራማኢ-ኢዚዮካ፣ 1997፤ አታላህ እና ሌሎች፣ 2022፣ 2024) በመጠቀም ተለይቷል። የአይቲኤስ rDNA ክልል ከዚያም የተወሰነውን የፕራይመር ጥንድ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC፤ የሚጠበቀው መጠን፡ 540 bp) በመጠቀም ተሻሽሏል (ባቱሮ-ሲየስኒውስካ እና ሌሎችም፣ 2017)። የተጣሩት የPCR ምርቶች ለተከታታይነት ቀርበዋል (ቤጂንግ አኦኬ ዲንግሼንግ ባዮቴክኖሎጂ ኩባንያ፣ ሊሚትድ)። የአይቲኤስ rDNA ቅደም ተከተሎች በሳንገር ቅደም ተከተል ዘዴ በሁለት አቅጣጫ ቅደም ተከተሎች ተደርገዋል። ከዚያም የተገጣጠሙት የጥያቄ ቅደም ተከተሎች በBLASTn ሶፍትዌር በመጠቀም በGenBank እና በብሔራዊ የባዮቴክኖሎጂ መረጃ ማዕከል (NCBI፣ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ውስጥ ካሉት የቅርብ ጊዜ መረጃዎች ጋር ተነጻጽረዋል። የጥያቄው ቅደም ተከተል በሞለኪውላር ኢቮሉሽን ጄኔቲክስ ትንተና ፓኬጅ (MEGA-11፤ ስሪት 11) ውስጥ ClustalWን በመጠቀም በNCBI GenBank (ተጨማሪ ሰንጠረዥ S1) ውስጥ ከነበሩት የቅርብ ጊዜ መረጃዎች የተገኙ 20 ሌሎች የS. sclerotiorum ዝርያዎች/isolates ጋር ተነጻጽሯል (Kumar et al., 2024)። የዝግመተ ለውጥ ትንተና የተከናወነው ከፍተኛውን የዕድል ዘዴ እና አጠቃላይ የጊዜ-ተገላቢጦሽ ኑክሊዮታይድ ምትክ ሞዴልን በመጠቀም ነው (Nei and Kumar, 2000)። ከፍተኛውን የሎግ-ዕድል ያለው ዛፍ ይታያል። ለሂዩሪስቲክ ፍለጋ የመጀመሪያው ዛፍ የሚመረጠው በጎረቤት-ተያያዥ (NJ) ዛፍ (Kumar et al., 2024) እና ከፍተኛው የፓርሲሞኒ (MP) ዛፍ መካከል ከፍተኛ የሎግ-ዕድል ያለው ዛፍ በመምረጥ ነው። የNJ ዛፍ የተገነባው በአጠቃላይ የጊዜ-ተገላቢጦሽ ሞዴል (Nei and Kumar, 2000) በመጠቀም በተሰላ ጥንድ ርቀት ማትሪክስ በመጠቀም ነው።
የL-ኦርኒቲን እና የባክቴሪያ ገዳይ የሆነው "ሪዞሌክስ-ቲ" ፀረ-ባክቴሪያ እንቅስቃሴ በአጋር ስርጭት ዘዴ በብልቃጥ ተወስኗል። ዘዴ፡- ተገቢውን የL-ኦርኒቲን ክምችት (500 ሚ.ግ./ሊ) መፍትሄ ወስደው ከ10 ሚሊ ሊትር የPDA ንጥረ ነገር መካከለኛ ጋር በደንብ ይቀላቅሉት፤ በዚህም 12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100 እና 125 ሚ.ግ./ሊ የመጨረሻ ክምችቶች ያላቸውን መፍትሄዎች ያዘጋጁ። አምስት የፈንገስ “ሪዞሌክስ-ቲ” (2፣ 4፣ 6፣ 8 እና 10 ሚ.ግ./ሊ) ክምችቶች እና ንፁህ የተቀዳ ውሃ እንደ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውለዋል። መካከለኛው ከጠነከረ በኋላ፣ አዲስ የተዘጋጀ የስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም ባህል 4 ሚሜ ዲያሜትር ያለው ማይሴሊያል ፕላግ ወደ ፔትሪ ዲሽ መሃል ተላልፎ ማይሴሊየም ሙሉውን የቁጥጥር ፔትሪ ዲሽ እስኪሸፍን ድረስ በ25±2°ሴ እንዲለማ ተደርጓል፣ ከዚያ በኋላ የፈንገስ እድገቱ ተመዝግቧል። እኩልታ 1ን በመጠቀም የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ራዲያል እድገትን የመቀነስ መቶኛ ያሰሉ፡
ሙከራው ሁለት ጊዜ ተደግሟል፣ ለእያንዳንዱ የቁጥጥር/የሙከራ ቡድን ስድስት ባዮሎጂያዊ ቅጂዎች እና ለእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ አምስት ማሰሮዎች (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎች) ተደግመዋል። የሙከራ ውጤቶቹ ትክክለኛነት፣ አስተማማኝነት እና እንደገና መባዛት ለማረጋገጥ እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ ሁለት ጊዜ ተተነተነ (ሁለት ቴክኒካዊ ቅጂዎች)። በተጨማሪም፣ የግማሽ ከፍተኛውን የመከልከል ክምችት (IC50) እና IC99 ለማስላት የፕሮቢት ሪግሬሽን ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል (Prentice፣ 1976)።
በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ የL-ornithineን አቅም ለመገምገም፣ ሁለት ተከታታይ የድስት ሙከራዎች ተካሂደዋል። ባጭሩ፣ ማሰሮዎቹ በጸዳ የሸክላ አሸዋ አፈር (3:1) ተሞልተው አዲስ በተዘጋጀ የS. sclerotiorum ባህል ተከተቡ። በመጀመሪያ፣ በጣም ወራሪ የሆነው የS. sclerotiorum (isolate #3) አንድ ስክሌሮቲየም በግማሽ በመቁረጥ፣ በPDA ላይ ፊቱን ወደታች በማድረግ እና የማይሴሊያል እድገትን ለማነቃቃት በ25°ሴ በቋሚ ጨለማ (24 ሰዓታት) ለ4 ቀናት በማቆየት ተክሏል። ከዚያም አራት 5 ሚሜ ዲያሜትር ያላቸው የአጋር መሰኪያዎች ከመሪው ጠርዝ ተወስደው 100 ግራም የስንዴ እና የሩዝ ብራን ድብልቅ (1:1፣ v/v) ተከተቡ እና ሁሉም ማሰሮዎች በ25 ± 2°ሴ በ12 ሰዓት ብርሃን/12 ሰዓት ጨለማ ዑደት ለ5 ቀናት ተክለዋል የስክሌሮቲያ መፈጠርን ለማነቃቃት። አፈር ከመጨመራቸው በፊት የሁሉም ማሰሮዎች ይዘት ተመሳሳይነት ለማረጋገጥ በደንብ ተቀላቅሏል። ከዚያም፣ 100 ግራም የቅኝ ግዛት ብራን ድብልቅ በእያንዳንዱ ማሰሮ ውስጥ ተጨምሮ የበሽታ ተህዋሲያን የማያቋርጥ ክምችት እንዲኖር ተደርጓል። የተከተቡት ማሰሮዎች የፈንገስ እድገትን ለማነቃቃት ውሃ ያጠጡና ለ7 ቀናት በግሪን ሃውስ ውስጥ ይቀመጣሉ።
ከዚያም አምስት የጊዛ 3 ዝርያ ዘሮች በእያንዳንዱ ማሰሮ ውስጥ ተዘርተዋል። በL-ornithine እና በRizolex-T ፈንገስ ለተያዙ ማሰሮዎች፣ የተጸዳዱት ዘሮች በመጀመሪያ ለሁለት ሰዓታት በሁለቱ ውህዶች የውሃ መፍትሄ ውስጥ ተጨምረው 250 ሚ.ግ./ሊ እና 50 ሚ.ግ./ሊ ውስጥ የመጨረሻው IC99 ክምችት በቅደም ተከተል ተጨምረው ከዚያም ከመዝራትዎ በፊት ለአንድ ሰዓት በአየር እንዲደርቁ ተደርገዋል። በሌላ በኩል ዘሮቹ እንደ አሉታዊ ቁጥጥር በጸዳ ውሃ ውስጥ ተጥለዋል። ከ10 ቀናት በኋላ፣ ከመጀመሪያው ውሃ በፊት፣ ችግኞቹ ቀጭነዋል፣ በእያንዳንዱ ማሰሮ ውስጥ ሁለት ንጹህ ችግኞች ብቻ ይተዋሉ። በተጨማሪም፣ በS. sclerotiorum ኢንፌክሽን መኖሩን ለማረጋገጥ፣ በተመሳሳይ የእድገት ደረጃ (10 ቀናት) ላይ ያሉ የባቄላ ተክል ግንዶች በሁለት የተለያዩ ቦታዎች በጸዳ ስካሌል በመጠቀም ተቆርጠዋል እና በግምት 0.5 ግራም የቅኝ ግዛት ብራን ድብልቅ በእያንዳንዱ ቁስል ውስጥ ተተክሏል፣ ከዚያም በሁሉም የተከተቡ ተክሎች ውስጥ የኢንፌክሽን እና የበሽታ እድገትን ለማነቃቃት ከፍተኛ እርጥበት ይከተላል። የቁጥጥር ተክሎች በተመሳሳይ ሁኔታ ቆስለዋል እና እኩል መጠን (0.5 ግራም) የጸዳ፣ በቅኝ ያልተያዘ የብራን ድብልቅ ወደ ቁስሉ ውስጥ ተተክሎ በከፍተኛ እርጥበት ስር እንዲቆይ ተደርጓል፣ ይህም ለበሽታ እድገት አካባቢን ለማስመሰል እና በሕክምና ቡድኖች መካከል ያለውን ወጥነት ለማረጋገጥ ነው።
የሕክምና ዘዴ፡ የባቄላ ችግኞች አፈሩን በመስኖ በ500 ሚሊ ሊትር የL-ornithine (250 ሚ.ግ./ሊ) ወይም ፈንገስ አዘል ሪዞሌክስ-ቲ (50 ሚ.ግ./ሊ) ውሃ መፍትሄ ያጠጡ፣ ከዚያም ሕክምናው በ10 ቀናት ልዩነት ሶስት ጊዜ ተደግሟል። በፕላሴቦ የታከሙት መቆጣጠሪያዎች በ500 ሚሊ ሊትር ንፁህ የተቀዳ ውሃ ያጠጡ ነበር። ሁሉም ሕክምናዎች በግሪንሀውስ ሁኔታዎች (25 ± 2°ሴ፣ 75 ± 1% አንጻራዊ እርጥበት እና 8 ሰዓት ብርሃን/16 ሰዓት ጨለማ) የፎቶ ጊዜ ይከናወናሉ። ሁሉም ማሰሮዎች በየሁለት ሳምንቱ ውሃ ያጠጡ እና በየወሩ በተመጣጣኝ የNPK ማዳበሪያ (20-20-20፣ 3.6% ሰልፈር እና የTE ማይክሮኤለመንቶች፤ የዛይን ዘሮች፣ ግብፅ) በ3-4 ግ/ሊ በፎሊያር መርጨት ይታከማሉ። በሌላ መልኩ ካልተገለጸ በስተቀር፣ ሙሉ በሙሉ የተስፋፉ የበሰለ ቅጠሎች (ከላይኛው 2ኛ እና 3ኛ ቅጠሎች) ከእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ በ72 ሰዓት ከህክምና በኋላ (hpt) ተሰብስበው፣ ተመሳሳይነት ባለው መልኩ ተቀላቅለው፣ ተከማችተው እና በ-80°ሴ ተከማችተው ለተጨማሪ ትንታኔዎች የኦክሲዴቲቭ ውጥረት አመልካቾችን በቦታ ሂስቶኬሚካል አካባቢያዊነት፣ የሊፒድ ፐርኦክሳይድ፣ የኢንዛይማቲክ እና የኢንዛይማቲክ አንቲኦክሲደንትስ እና የጂን አገላለጽን ያካትታሉ።
የነጭ ሻጋታ ኢንፌክሽን ጥንካሬ በየሳምንቱ ከክትባት በኋላ በ21 ቀናት ውስጥ በፔትዞልድት እና ዲክሰን ሚዛን (1996) በቴራን እና ሌሎች (2006) በተሻሻለው የፔትዞልድት እና የዲክሰን ሚዛን (1996) ላይ በመመርኮዝ ከ1-9 (ተጨማሪ ሰንጠረዥ S2) መለኪያ በመጠቀም ተገምግሟል። በአጭሩ፣ የባቄላ ተክሎች ግንዶች እና ቅርንጫፎች በውስጠኛው ክፍል እና በኖዶች ላይ የሚከሰቱ ቁስሎችን እድገት ለመከታተል ከክትባት ቦታ ጀምሮ ተመርምረዋል። ​​ቁስሉ ከክትባት ቦታ እስከ ግንዱ ወይም ቅርንጫፍ ድረስ ያለው ርቀት ከዚያም ተለክቷል እና ቁስሉ ባለበት ቦታ ላይ በመመስረት የ1-9 ነጥብ ተመድቧል፣ እዚያም (1) በክትባት ቦታ አቅራቢያ ምንም የሚታይ ኢንፌክሽን አለመኖሩን እና (2-9) በኖዶች/በውስጠኛው ክፍል ላይ የቁስሉ መጠን እና እድገት ቀስ በቀስ መጨመርን ያሳያል (ተጨማሪ ሰንጠረዥ S2)። ከዚያም የነጭ ሻጋታ ኢንፌክሽን ጥንካሬ ቀመር 2ን በመጠቀም ወደ መቶኛ ተቀይሯል፡
በተጨማሪም፣ በበሽታው እድገት ኩርባ (AUDPC) ስር ያለው ቦታ የተሰላው ቀመርን በመጠቀም ነው (ሻነር እና ፊኒ፣ 1977)፣ ይህም በቅርቡ ለነጭ የበሰበሰ ባቄላ (ቻውሃን እና ሌሎች፣ 2020) እኩልታ 3ን በመጠቀም የተስተካከለ ነው፡
ዪ = በጊዜ ቲ የበሽታ ክብደት፣ ዪ+1 = በሚቀጥለው ጊዜ ቲ+1 የበሽታ ክብደት፣ ቲ = የመጀመሪያው የመለኪያ ጊዜ (በቀናት)፣ ቲ+1 = የሚቀጥለው የመለኪያ ጊዜ (በቀናት)፣ n = ጠቅላላ የጊዜ ነጥቦች ወይም የምልከታ ነጥቦች ብዛት። የቡና ተክል እድገት መለኪያዎች የእፅዋት ቁመት (ሴሜ)፣ የአንድ ተክል ቅርንጫፎች ብዛት እና በአንድ ተክል የቅጠሎች ብዛትን ጨምሮ በየሳምንቱ ለ21 ቀናት በሁሉም ባዮሎጂካል ቅጂዎች ተመዝግበዋል።
በእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ፣ የቅጠል ናሙናዎች (ከላይኛው በኩል ሙሉ በሙሉ የዳበሩ ሁለተኛ እና ሶስተኛ ቅጠሎች) ከህክምናው በኋላ በ45ኛው ቀን (ከመጨረሻው ህክምና በኋላ በ15 ቀናት ውስጥ) ተሰብስበው ነበር። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ አምስት ማሰሮዎችን (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎችን) ያቀፈ ነበር። 500 ሚ.ግ የተፈጨው ቲሹ በ4°ሴ ውስጥ 80% አሴቶን በመጠቀም የፎቶሲንተቲክ ቀለሞችን (ክሎሮፊል ኤ፣ ክሎሮፊል ቢ እና ካሮቲኖይድ) ለማውጣት ጥቅም ላይ ውሏል። ከ24 ሰዓታት በኋላ፣ ናሙናዎቹ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል እና የላይኛው ክፍል ክሎሮፊል ኤ፣ ክሎሮፊል ቢ እና የካሮቲኖይድ ይዘቶችን በቀለማት በ UV-160A ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) በመጠቀም በሦስት የተለያዩ የሞገድ ርዝመቶች (A470፣ A646 እና A663 nm) በመጠቀም ለመለየት ተሰብስቧል። በመጨረሻም፣ የፎቶሲንተቲክ ቀለሞች ይዘት በሊችተንታለር (1987) የተገለጸውን የሚከተሉትን ቀመሮች 4–6 በመጠቀም ተሰላ።
ከህክምና በኋላ በ72 ሰዓታት ውስጥ (hpt)፣ ቅጠሎች (ከላይኛው በኩል ሙሉ በሙሉ የተገነቡ ሁለተኛ እና ሶስተኛው ሙሉ በሙሉ የተገነቡ ቅጠሎች) ከእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ የሃይድሮጂን ፐርኦክሳይድ (H2O2) እና የሱፐርኦክሳይድ አኒዮን (O2•−) አካባቢያዊነት ለማግኘት ከእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ ተሰብስበዋል። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ አምስት ማሰሮዎችን (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎችን) ያቀፈ ነበር። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ ዘዴውን ትክክለኛነት፣ አስተማማኝነት እና እንደገና ማባዛትን ለማረጋገጥ በተባዛ (ሁለት ቴክኒካዊ ቅጂዎች) ተተነተነ። H2O2 እና O2•− በሮሜሮ-ፑዌርታስ እና ሌሎች (2004) እና አዳም እና ሌሎች (1989) የተገለጹትን ዘዴዎች በመከተል በቅደም ተከተል 0.1% 3,3′-ዲያሚኖቤንዚዲን (DAB፤ ሲግማ-አልድሪች፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) ወይም ናይትሮብሉ ቴትራዞሊየም (NBT፤ ሲግማ-አልድሪች፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) ተለይተዋል። በቦታ ውስጥ የH2O2 ሂስቶኬሚካላዊ አካባቢያዊነት እንዲኖር፣ በራሪ ወረቀቶች በ10 mM ትሪስ ቋት (pH 7.8) ውስጥ በ0.1% DAB በቫክዩም ውስጥ ተሰርገው ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ60 ደቂቃዎች በብርሃን ውስጥ ተጠብቀዋል። በራሪ ወረቀቶች በ4:1 (v/v) ኤታኖል፡ክሎሮፎርም (አል-ጎምሆሪያ ፋርማሲዩቲካልስ ኤንድ ሜዲካል አቅርቦቶች፣ ካይሮ፣ ግብፅ) ውስጥ በ0.15% (v/v) TCA ውስጥ ተጠርገው ከዚያም እስኪጨልሙ ድረስ ለብርሃን ተጋልጠዋል። በተመሳሳይ፣ ቫልቮች በ10 mM ፖታሲየም ፎስፌት ቋት (pH 7.8) በቫክዩም ውስጥ ተሰርገው ለኦ2•− በቦታ ውስጥ ሂስቶኬሚካላዊ አካባቢያዊነት 0.1 w/v % HBT የያዘ 0.8% HBT በቫክዩም ውስጥ ተሰርገዋል። በራሪ ወረቀቶቹ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ20 ደቂቃዎች በብርሃን ውስጥ ተሰርገው ከዚያም ከላይ እንደተጠቀሰው ተገርፈዋል፣ ከዚያም ጥቁር ሰማያዊ/ቫዮሌት ነጠብጣቦች እስኪታዩ ድረስ ብርሃን ሰጥተዋል። የተገኘው ቡናማ (እንደ H2O2 አመልካች) ወይም ሰማያዊ-ቫዮሌት (እንደ O2•− አመልካች) ቀለም ጥንካሬ የተገመገመው የምስል ማቀነባበሪያ ፓኬጅ ImageJ (http://fiji.sc; መጋቢት 7 ቀን 2024 ዓ.ም. ላይ ተገኝቷል) የፊጂ ስሪትን በመጠቀም ነው።
ማሎንዲያልዴይድ (MDA፤ እንደ የሊፒድ ፐርኦክሳይድ ምልክት) በዱ እና ብራምሌጅ (1992) ዘዴ መሰረት በትንሽ ማሻሻያዎች ተወስኗል። ከእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ (ከላይኛው ሁለተኛ እና ሶስተኛ ሙሉ በሙሉ የዳበሩ ቅጠሎች) ቅጠሎች ከህክምና በኋላ ለ72 ሰዓታት (hpt) ተሰብስበዋል። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ አምስት ማሰሮዎችን (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎችን) ያካትታል። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ ዘዴውን ትክክለኛነት፣ አስተማማኝነት እና እንደገና መባዛት ለማረጋገጥ በተባዛ (ሁለት ቴክኒካዊ ቅጂዎች) ተተነተነ። በአጭሩ፣ 0.5 ግራም የተፈጨ ቅጠል ቲሹ ለMDA ለማውጣት ጥቅም ላይ ውሏል 20% ትሪክሎሮአሴቲክ አሲድ (TCA፤ MilliporeSigma፣ Burlington፣ MA፣ USA) 0.01% ቡቲሌትድ ሃይድሮክሲቶሉይን (BHT፤ Sigma-Aldrich፣ ሴንት ሉዊስ፣ MO፣ USA) የያዘ። ከዚያም በላይኛው ክፍል ውስጥ ያለው የMDA ይዘት በ532 እና 600 nm ላይ ያለውን የመምጠጥ አቅም በUV-160A ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) በመለካት በቀለም መለኪያ ተወስኗል ከዚያም እንደ nmol g−1 FW ተገልጿል።
የኢንዛይም ያልሆኑ እና የኢንዛይም አንቲኦክሲደንቶችን ለመገምገም፣ ቅጠሎች (ከላይኛው ሙሉ በሙሉ የተገነቡ ሁለተኛ እና ሶስተኛ ቅጠሎች) ከእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ ከህክምና በኋላ በ72 ሰዓታት (hpt) ተሰብስበዋል። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ አምስት ማሰሮዎችን (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎችን) ያቀፈ ነበር። እያንዳንዱ ባዮሎጂካል ናሙና በተባዛ (ሁለት ቴክኒካዊ ናሙናዎች) ተተነተነ። ሁለት ቅጠሎች በፈሳሽ ናይትሮጅን የተፈጩ ሲሆን በቀጥታ የኢንዛይም እና የኢንዛይም ያልሆኑ አንቲኦክሲደንቶችን፣ አጠቃላይ አሚኖ አሲዶችን፣ የፕሮሊን ይዘትን፣ የጂን አገላለጽን እና የኦክሳሌት መጠንን ለመወሰን ጥቅም ላይ ውለዋል።
ጠቅላላ የሚሟሟ ፊኖሊኮች በፎሊን-ሲዮካልቴው ሪጀንተር (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም በካህኮነን እና ሌሎች (1999) በተገለጸው ዘዴ ላይ ትንሽ ማሻሻያዎችን በማድረግ ተወስነዋል። በአጭሩ፣ በግምት 0.1 ግራም ተመሳሳይነት ያለው የቅጠል ቲሹ ከ20 ሚሊ ሊትር 80% ሜታኖል ጋር በጨለማ ውስጥ ለ24 ሰዓታት ተወግዶ ከሴንትሪፉጌሽን በኋላ የላይኛው ክፍል ተሰብስቧል። 0.1 ሚሊ ሊትር የናሙና ማውጣት ከ0.5 ሚሊ ሊትር ፎሊን-ሲዮካልቴው ሪጀንተር (10%) ጋር ተቀላቅሎ ለ30 ሰከንድ ተናወጠ እና ለ5 ደቂቃ በጨለማ ውስጥ ተትቷል። ከዚያም 0.5 ሚሊ ሊትር 20% ሶዲየም ካርቦኔት መፍትሄ (Na2CO3፤ አል-ጎምሆሪያ ፋርማሲዩቲካልስ እና የህክምና አቅርቦቶች ኩባንያ፣ ካይሮ፣ ግብፅ) በእያንዳንዱ ቱቦ ውስጥ ተጨምሮ በደንብ ተቀላቅሎ በጨለማ ውስጥ ለ1 ሰዓት በክፍል ሙቀት ውስጥ እንዲቆይ ተደርጓል። ከተቀላቀለ በኋላ የምላሽ ድብልቁን የመምጠጥ አቅም በ765 nm በ UV-160A ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) ተለክቷል። በናሙናው ማውጫዎች ውስጥ ያሉት አጠቃላይ የሚሟሟ ፊኖሎች ክምችት በጋሊክ አሲድ የካሊብሬሽን ኩርባ (ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ሃምፕተን፣ ኤን ኤች፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ተወስኖ በአንድ ግራም ትኩስ ክብደት (ሚሊ ግራም GAE g-1 ትኩስ ክብደት) በሚሊ ግራም ጋሊክ አሲድ ተመጣጣኝ ሆኖ ተገልጿል።
አጠቃላይ የሚሟሟ የፍላቮኖይድ ይዘት በጄሪዳኔ እና ሌሎች (2006) ዘዴ መሰረት በትንሽ ማሻሻያዎች ተወስኗል። በአጭሩ፣ ከላይ የተጠቀሰው የሜታኖል ጭማቂ 0.3 ሚሊ ሊትር ከ5% የአሉሚኒየም ክሎራይድ መፍትሄ (AlCl3፤ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ሃምፕተን፣ ኤን ኤች፣ ዩኤስኤ) ጋር ተቀላቅሎ በብርቱ ተቀላቅሎ ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ5 ደቂቃ እንዲቆይ ተደርጓል፣ ከዚያም 0.3 ሚሊ ሊትር የ10% የፖታስየም አሲቴት መፍትሄ (አል-ጎምሆሪያ ፋርማሲዩቲካልስ እና የህክምና አቅርቦቶች፣ ካይሮ፣ ግብፅ) ተጨምሮ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ30 ደቂቃ በጨለማ ውስጥ እንዲቆይ ተደርጓል። ከተቀላቀለ በኋላ የምላሽ ድብልቁን የመምጠጥ ችሎታ በ430 nm በ UV-160A spectrophotometer (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) ተለክቷል። በናሙና ማውጫዎች ውስጥ ያለው አጠቃላይ የሚሟሟ ፍላቮኖይድ ክምችት የሚወሰነው በሩቲን የካሊብሬሽን ኩርባ (TCI አሜሪካ፣ ፖርትላንድ፣ ኦሪገን፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ሲሆን ከዚያም በአንድ ግራም ትኩስ ክብደት (mg RE g-1 ትኩስ ክብደት) በሚሊ ግራም የሩቲን ተመጣጣኝ ሆኖ ተገልጿል።
የባቄላ ቅጠሎች አጠቃላይ ነፃ የአሚኖ አሲድ ይዘት በዮኮያማ እና ሂራማትሱ (2003) ባቀረቡት እና በሰን እና ሌሎች (2006) በተሻሻለው ዘዴ ላይ በመመስረት በተሻሻለው የኒንሃይድሪን ሪጀንተር (Thermo Scientific Chemicals፣ Waltham፣ MA፣ USA) በመጠቀም ተወስኗል። በአጭሩ፣ 0.1 ግራም የተፈጨ ሕብረ ሕዋስ በፒኤች 5.4 ቋት ተወግዷል፣ እና 200 μL የሱፐርናታንት ከ200 μL የኒንሃይድሪን (2%) እና 200 μL የፒሪዲን (10%፤ ስፔክትረም ኬሚካል፣ ኒው ብሩንስዊክ፣ ኒው ብሩንስዊክ፣ አሜሪካ) ጋር ምላሽ ተሰጥቶታል፣ ለ30 ደቂቃዎች በሚፈላ ውሃ መታጠቢያ ውስጥ ተጨምሮ፣ ከዚያም ቀዝቅዞ በ580 nm በ UV-160A ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማድዙ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) ተለክቷል። በሌላ በኩል፣ ፕሮላይን በባተስ ዘዴ ተወስኗል (ባቴስ እና ሌሎች፣ 1973)። ፕሮሊን ከ3% ሰልፎሳሊሲሊክ አሲድ (ቴርሞ ሳይንቲፊክ ኬሚካሎች፣ ዋልተም፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ) ጋር ተወጣና ሴንትሪፉጌሽን ከተደረገ በኋላ፣ 0.5 ሚሊ ሊትር የሱፐርናታንት ከ1 ሚሊ ሊትር ግላሲያል አሴቲክ አሲድ (ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ሃምፕተን፣ ኤንኤች፣ ዩኤስኤ) እና ኒንሃይድሪን ሪአጀንት ጋር ተቀላቅሎ፣ በ90°ሴ ለ45 ደቂቃ እንዲቆይ ተደርጓል፣ ቀዝቅዞ በ520 nm ከላይ እንደተጠቀሰው ተመሳሳይ ስፔክትሮፎቶሜትር በመጠቀም ተለካ። በቅጠል ማውጫዎች ውስጥ ያሉት ጠቅላላ ነፃ አሚኖ አሲዶች እና ፕሮሊን በቅደም ተከተል ግሊሲን እና ፕሮላይን የካሊብሬሽን ኩርባዎችን (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ተለይተዋል፣ እና እንደ ሚ.ግ/ግ ትኩስ ክብደት ተገልጸዋል።
የኦክሲዳንት ኢንዛይሞችን የኢንዛይም እንቅስቃሴ ለመወሰን፣ በግምት 500 ሚ.ግ. ሆሞጂኔዝድ ቲሹ ከ3 ሚሊ ሊትር 50 mM ትሪስ ቋፈር (pH 7.8) ጋር 1 mM EDTA-Na2 (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) እና 7.5% ፖሊቪኒልፒሮሊዶን (PVP፤ ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) የያዘ ሲሆን፣ ለ20 ደቂቃ በማቀዝቀዣ ውስጥ (4°ሴ) ውስጥ በ10,000 × g ሴንትሪፉጅ የተደረገ ሲሆን ሱፐርናታንት (ጥሬ ኢንዛይም ማውጣት) ተሰብስቧል (ኤል-ናጋር እና ሌሎች፣ 2023፤ ኦስማን እና ሌሎች፣ 2023)። ከዚያም ካታላሴ (CAT) በኤቢ (1984) ዘዴ መሰረት የኢንዛይም እንቅስቃሴውን ለመወሰን በ2 ሚሊ ሊትር 0.1 ሜ ሶዲየም ፎስፌት ቋት (pH 6.5፤ ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሉዊስ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) እና በ100 μl 269 mM H2O2 መፍትሄ ምላሽ ተሰጥቶታል (ኤል-ናጋር እና ሌሎች፣ 2023፤ ኦስማን እና ሌሎች፣ 2023)። የጓያኮል ጥገኛ ፔሮክሳይዳዝ (POX) ኢንዛይም እንቅስቃሴ የሚወሰነው በሃራች እና ሌሎች (2009) ዘዴ በመጠቀም ነው። (2008) ጥቃቅን ማሻሻያዎችን በማድረግ (ኤል-ናጋር እና ሌሎች፣ 2023፤ ኦስማን እና ሌሎች፣ 2023) እና የፖሊፊኖል ኦክሲዳዝ (PPO) ኢንዛይማቲክ እንቅስቃሴ ከ2.2 ሚሊ ሊትር 100 mM ሶዲየም ፎስፌት ቋት (pH 6.0)፣ 100 μl ጓያኮል (TCI ኬሚካሎች፣ ፖርትላንድ፣ ኦሪገን፣ ዩኤስኤ) እና 100 μl 12 mM H2O2 ጋር ከተፈጠረው ምላሽ በኋላ ተወስኗል። ዘዴው ከ (ኤል-ናጋር እና ሌሎች፣ 2023፤ ኦስማን እና ሌሎች፣ 2023) በትንሹ ተሻሽሏል። ምርመራው የተካሄደው በ0.1 M ፎስፌት ቋት (pH 6.0) ውስጥ አዲስ በተዘጋጀ 3 ሚሊ ሊትር የካቴኮል መፍትሄ (Thermo Scientific Chemicals፣ Waltham፣ MA፣ USA) (0.01 M) ከተደረገ በኋላ ነው። የCAT እንቅስቃሴ የሚለካው በ240 nm (A240) የH2O2 መበስበስን በመከታተል ሲሆን የPOX እንቅስቃሴ የሚለካው በ436 nm (A436) የመምጠጥ መጨመርን በመከታተል ሲሆን የPPO እንቅስቃሴ የሚለካው በየ30 ሰከንድ በ495 nm (A495) የመምጠጥ መለዋወጥን በUV-160A ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማድዙ፣ ጃፓን) በመጠቀም ነው።
ሪል-ታይም RT-PCR ጥቅም ላይ የዋለው ከፔሮክሲሶማል ካታላሴ (PvCAT1፤ GenBank Accession No. KF033307.1)፣ ሱፐርኦክሳይድ dismutase (PvSOD፤ GenBank Accession No. XM_068639556.1) እና ግሉታቲዮን ሪዳክቴዝ (PvGR፤ GenBank Accession No. KY195009.1)፣ ከመጨረሻው ህክምና በኋላ ከ72 ሰዓታት በኋላ በባቄላ ቅጠሎች (ከላይኛው ሙሉ በሙሉ የዳበሩ ሁለተኛ እና ሶስተኛ ቅጠሎች) ውስጥ ነው። በአጭሩ፣ አር ኤን ኤ በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት በ Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1፤ BioFlux፣ Biori Technology፣ ቻይና) በመጠቀም ተለይቷል። ከዚያም cDNA በአምራቹ መመሪያ መሠረት በTOP script™ cDNA Synthesis Kit በመጠቀም ተዋህዷል። ከላይ የተጠቀሱት ሶስት ጂኖች የመጀመሪያ ቅደም ተከተሎች በተጨማሪ ሰንጠረዥ S3 ውስጥ ተዘርዝረዋል። PvActin-3 (የGenBank accession ቁጥር፡ XM_068616709.1) እንደ የቤት አያያዝ ጂን ጥቅም ላይ ውሏል እና አንጻራዊው የጂን አገላለጽ የተሰላው በ2-ΔΔCT ዘዴ (ሊቫክ እና ሽሚትገን፣ 2001) ነው። በባዮቲክ ውጥረት (በተለመዱት ጥራጥሬዎች እና በአንትራኖዝ ፈንገስ ኮሌቶትሪችም ሊንዴሙቲያነም መካከል የማይጣጣም መስተጋብር) እና አባዮቲክ ውጥረት (ድርቅ፣ ጨዋማነት፣ ዝቅተኛ የሙቀት መጠን) ታይቷል (ቦርጅስ እና ሌሎች፣ 2012)።
በመጀመሪያ በኤስ. ስክሌሮቲዮረም ውስጥ የሚገኙትን የኦክሳሎአሴቴት አሲቲልሃይድሮላዝ (OAH) ፕሮቲኖችን በጂኖም-አቀፍ የሲሊኮ ትንተና አድርገናል፤ የፕሮቲን-ፕሮቲን BLAST መሳሪያ (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) በመጠቀም። በአጭሩ፣ ከኤስ. ስክሌሮቲዮረም (taxide: 5180) የተገኘውን OAH ከአስፐርጊለስ ፊጂኤንሲስ CBS 313.89 (AfOAH፤ taxide: 1191702፤ የGenBank accession ቁጥር XP_040799428.1፤ 342 አሚኖ አሲዶች) እና ፔኒሲሊየም ላጌና (PlOAH፤ taxide: 94218፤ የGenBank accession ቁጥር XP_056833920.1፤ 316 አሚኖ አሲዶች) በመጠቀም በS. sclerotiorum ውስጥ ተመሳሳይ ፕሮቲንን ለማሳመር እንደ የጥያቄ ቅደም ተከተሎች ተጠቅመናል። BLASTp የተከናወነው በብሔራዊ የባዮቴክኖሎጂ መረጃ ማዕከል (NCBI) ድህረ ገጽ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ላይ በGenBank ውስጥ በቅርብ ጊዜ በተገኘ የS. sclerotiorum ጂኖም መረጃ ላይ ነው።
በተጨማሪም፣ ከኤስ. ስክሌሮቲዮረም (SsOAH) የተተነበየው የOAH ጂን እና ከኤ. ፊጂየንሲስ CBS 313.89 እና ከፒ. ላጌና የተገኘው የAfOAH የዝግመተ ለውጥ ትንተና እና የፊሎጄኔቲክ ዛፍ በMEGA11 (ታሙራ እና ሌሎች፣ 2021) እና በJTT ማትሪክስ ላይ የተመሠረተ ሞዴል (ጆንስ እና ሌሎች፣ 1992) ውስጥ ከፍተኛውን የዕድል ዘዴ በመጠቀም ተገምግመዋል። የፊሎጄኔቲክ ዛፉ ከኤስ. ስክሌሮቲዮረም የተተነበዩትን ሁሉንም የOAH ጂኖች (SsOAH) የፕሮቲን ቅደም ተከተሎችን ከብዙ አሰላለፍ ትንተና እና የጥያቄ ቅደም ተከተል በገደብ ላይ የተመሠረተ አሰላለፍ መሳሪያ (COBALT፤ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) በመጠቀም ተጣምሯል (ፓፓዶፖሎስ እና አጋርዋላ፣ 2007)። በተጨማሪም፣ ከኤስ. ስክሌሮቲዮረም የተገኙት የSsOAH ምርጥ ተዛማጅ አሚኖ አሲድ ቅደም ተከተሎች ከጥያቄ ቅደም ተከተሎች (AfOAH እና PlOAH) (Larkin et al., 2007) ጋር ተስተካክለዋል፣ እና በአሰላለፉ ውስጥ የተጠበቁ ክልሎች በESPript መሳሪያ (ስሪት 3.0፤ https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) በመጠቀም ይታያሉ።
በተጨማሪም፣ የተተነበዩት ተግባራዊ ተወካይ ጎራዎች እና የተጠበቁ የኤስ. ስክሌሮቲዮረም SsOAH ቦታዎች በInterPro መሳሪያ (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) በመጠቀም በተለያዩ ቤተሰቦች በይነተገናኝ ሁኔታ ተመድበዋል (Blum et al., 2021)። በመጨረሻም፣ የተተነበየው የኤስ. ስክሌሮቲዮረም SsOAH ባለ ሶስት አቅጣጫዊ (3D) መዋቅር ሞዴሊንግ የፕሮቲን ሆሞሎጂ/አናሎግ ሪኮግኒሽን ሞተር (Phyre2 server version 2.0፤ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) በመጠቀም ተረጋግጧል እና በSWISS-MODEL አገልጋይ (https://swissmodel.expasy.org/) በመጠቀም ተረጋግጧል (Biasini et al., 2014)። የተተነበዩት ባለ ሶስት አቅጣጫዊ አወቃቀሮች (PDB ቅርጸት) በUCSF-Chimera ጥቅል (ስሪት 1.15፤ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) በመጠቀም በይነተገናኝ እይታ ታይቷል (Pettersen et al., 2004)።
በSclerotinia sclerotiorum ማይሴሊያ ውስጥ የኦክሳሎአሴቴት አሲቲልሃይድሮላዝ (SsOAH፤ የGenBank accession ቁጥር፡ XM_001590428.1) የትራንስክሪፕሽን ደረጃን ለመወሰን በቁጥር የእውነተኛ ጊዜ ፍሎረሰንስ PCR ጥቅም ላይ ውሏል። በአጭሩ፣ ኤስ. ስክሌሮቲዮረም PDB በያዘ ጠርሙስ ውስጥ ተከተበ እና በማይሴሊያ እድገት ለማነቃቃት በ25 ± 2 °ሴ ለ24 ሰዓታት በ150 rpm እና በቋሚ ጨለማ (24 ሰዓታት) ውስጥ በሚንቀጠቀጥ ኢንኩቤተር (ሞዴል፡ I2400፣ ኒው ብሩንስዊክ ሳይንቲፊክ ኩባንያ፣ ኤዲሰን፣ ኒው ጀርሲ፣ ዩኤስኤ) ውስጥ ተተክሏል። ከዚያ በኋላ፣ ሴሎቹ በመጨረሻው IC50 ክምችት (በግምት 40 እና 3.2 mg/L በቅደም ተከተል) በL-ornithine እና በፈንገስ መከላከያ ሪዞሌክስ-T ታክመዋል ከዚያም በተመሳሳይ ሁኔታ ለሌላ 24 ሰዓታት ተክለዋል። ከተቆፈረ በኋላ፣ ባህሎቹ በ2500 rpm ለ5 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጅ ተደርገዋል እና የጂን አገላለጽ ትንተና ለማድረግ የላይኛው ክፍል (የፈንገስ ማይሴሊየም) ተሰብስቧል። በተመሳሳይ፣ የፈንገስ ማይሴሊየም ከተበከሉ ተክሎች በ0፣ 24፣ 48፣ 72፣ 96 እና 120 ሰዓታት ውስጥ ከተበከሉት በተበከሉት ሕብረ ሕዋሳት ላይ ነጭ ሻጋታ እና የጥጥ ማይሴሊየም ከፈጠሩ በኋላ ተሰብስቧል። አር ኤን ኤ ከፈንገስ ማይሴሊየም ተወግዶ ከዚያ cDNA ከላይ እንደተገለፀው ተዋህዷል። የ SsOAH የመጀመሪያ ቅደም ተከተሎች በተጨማሪ ሰንጠረዥ S3 ውስጥ ተዘርዝረዋል። SsActin (የGenBank accession ቁጥር፡ XM_001589919.1) እንደ የቤት አያያዝ ጂን ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና አንጻራዊ የጂን አገላለጽ የተሰላው በ2-ΔΔCT ዘዴ (Livak and Schmittgen, 2001) ነው።
ኦክሳሊክ አሲድ በሹ እና ዣንግ (2000) ዘዴ መሰረት የፈንገስ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን Sclerotiorum በያዙ የድንች ዴክስትሮዝ መረቅ (PDB) እና የእፅዋት ናሙናዎች ውስጥ በትንሽ ማሻሻያዎች Sclerotinia sclerotiorum ን በያዙ የእፅዋት ናሙናዎች ውስጥ ተወስኗል። በአጭሩ፣ የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶላቶች PDB በያዙ ጠርሙሶች ውስጥ ተከተቡ እና ከዚያም በማይሴሊያል እድገትን ለማነቃቃት በ25 ± 2 °ሴ በ150 rpm በ25 ± 2 °C ለ3-5 ቀናት በቋሚ ጨለማ (24 ሰዓታት) ውስጥ በሚንቀጠቀጥ ኢንኩቤተር (ሞዴል I2400፣ ኒው ብሩንስዊክ ሳይንቲፊክ ኩባንያ፣ ኤዲሰን፣ ኒው ጀርሲ፣ ዩኤስኤ) ውስጥ ተክለዋል። ከተቆፈረ በኋላ የፈንገስ ባህል በመጀመሪያ በ Whatman #1 ማጣሪያ ወረቀት ተጣርቶ ከዚያም የቀረውን ማይሴሊየም ለማስወገድ በ2500 rpm ለ5 ደቂቃዎች ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። የሱፐርናታንቱ ተሰብስቦ ተጨማሪ የኦክሳይድ መጠን ለመወሰን በ4°ሴ ተከማችቷል። የእፅዋት ናሙናዎችን ለማዘጋጀት፣ በግምት 0.1 ግራም የእፅዋት ቲሹ ቁርጥራጮች በተጣራ ውሃ (በእያንዳንዱ ጊዜ 2 ሚሊ ሊትር) ሦስት ጊዜ ተወስደዋል። ከዚያም ናሙናዎቹ በ2500 rpm ለ5 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጅ ተደርገዋል፣ የሱፐርናታንቱ በዋትማን ቁጥር 1 የማጣሪያ ወረቀት በኩል ደረቅ ሆኖ ተጣርቶ ለተጨማሪ ትንተና ተሰብስቧል።
የኦክሳሊክ አሲድን በቁጥር ለመተንተን፣ የምላሽ ድብልቁ በመስታወት በተዘጋ ቱቦ ውስጥ በሚከተለው ቅደም ተከተል ተዘጋጅቷል፡ 0.2 ሚሊ ሊትር ናሙና (ወይም የPDB ባህል ማጣሪያ ወይም የኦክሳሊክ አሲድ መደበኛ መፍትሄ)፣ 0.11 ሚሊ ሊትር የብሮሞፌኖል ሰማያዊ (BPB፣ 1 mM፤ ፊሸር ኬሚካል፣ ፒትስበርግ፣ ፒኤ፣ ዩኤስኤ)፣ 0.198 ሚሊ ሊትር የ1 M ሰልፈሪክ አሲድ (H2SO4፤ አል-ጎምሆሪያ ፋርማሲዩቲካልስ እና የህክምና አቅርቦቶች፣ ካይሮ፣ ግብፅ) እና 0.176 ሚሊ ሊትር የ100 mM ፖታሲየም ዲክሮሜት (K2Cr2O7፤ TCI ኬሚካሎች፣ ፖርትላንድ፣ ኦሪገን፣ ዩኤስኤ)፣ ከዚያም መፍትሄው ወደ 4.8 ሚሊ ሊትር በተጣራ ውሃ ተቀልጦ በብርቱ ተቀላቅሎ ወዲያውኑ በ60 °ሴ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ እንዲገባ ተደርጓል። ከ10 ደቂቃ በኋላ፣ ምላሹ 0.5 ሚሊ ሊትር የሶዲየም ሃይድሮክሳይድ መፍትሄ (NaOH፤ 0.75 M) በመጨመር እንዲቆም ተደርጓል። የምላሽ ድብልቅ መምጠጥ (A600) በ600 nm በ UV-160 ስፔክትሮፎቶሜትር (ሺማዱ ኮርፖሬሽን፣ ጃፓን) ተለክቷል። PDB እና የተጣራ ውሃ የባህል ማጣሪያዎችን እና የእፅዋት ናሙናዎችን በቅደም ተከተል ለመለካት እንደ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ውለዋል። በባህል ማጣሪያዎች ውስጥ ያሉት የኦክሳሊክ አሲድ ክምችቶች፣ በአንድ ሚሊሊተር የ PDB መካከለኛ (μg.mL−1) እንደ ኦክሳሊክ አሲድ ማይክሮግራም እና በቅጠል ማውጫዎች ውስጥ፣ በአንድ ግራም ትኩስ ክብደት (μg.g−1 FW) እንደ ኦክሳሊክ አሲድ ማይክሮግራም፣ ተወስነዋል፣ የኦክሳሊክ አሲድ የካሊብሬሽን ኩርባ (Thermo Fisher Scientific Chemicals፣ Waltham፣ MA፣ USA) በመጠቀም ተወስነዋል።
በጥናቱ በሙሉ፣ ሁሉም ሙከራዎች የተነደፉት ሙሉ በሙሉ በዘፈቀደ ዲዛይን (CRD) ሲሆን በአንድ ህክምና ስድስት ባዮሎጂካል ቅጂዎች እና በሌላ መልኩ ካልተገለጸ በስተቀር አምስት ማሰሮዎች በአንድ ባዮሎጂካል ቅጂ (በአንድ ማሰሮ ሁለት ተክሎች) ተንትነዋል። ባዮሎጂካል ቅጂዎች በተባዙ (በሁለት ቴክኒካል ቅጂዎች) ተንትነዋል። ቴክኒካዊ ቅጂዎች ተመሳሳይ ሙከራ የመራባት አቅምን ለማረጋገጥ ጥቅም ላይ ውለዋል ነገር ግን የተሳሳቱ ቅጂዎችን ለማስወገድ በስታቲስቲክስ ትንተና ውስጥ ጥቅም ላይ አልዋሉም። መረጃው በስታቲስቲክስ የተተነተነው የልዩነት ትንተና (ANOVA) በመጠቀም ሲሆን በመቀጠልም የቱኪ-ክራመር በሐቀኝነት ጉልህ የሆነ ልዩነት (HSD) ፈተና (p ≤ 0.05) ነው። ለብልቃጥ ሙከራዎች፣ IC50 እና IC99 እሴቶች በፕሮቢት ሞዴል ተሰልተው 95% የመተማመን ክፍተቶች ተሰልተዋል።
በግብፅ ኤል ጋቢያ ግዛት ውስጥ ከተለያዩ የአኩሪ አተር እርሻዎች በአጠቃላይ አራት ተለይተዋል (isolates)። በPDA መካከለኛ ላይ፣ ሁሉም ተለይተዋል (isolates) ክሬም ያለው ነጭ ማይሴሊየም በፍጥነት ወደ ጥጥ ነጭነት የሚለወጥ እና ከዚያም በስክሌሮቲየም ደረጃ ላይ ቢዥ ወይም ቡናማ ቀለም ያለው ነጭ ማይሴሊየም ያመርቱ ነበር። ስክሌሮቲያ ብዙውን ጊዜ ጥቅጥቅ ያሉ፣ ጥቁር፣ ክብ ቅርጽ ያላቸው ወይም መደበኛ ያልሆኑ ቅርጾች፣ ከ5.2 እስከ 7.7 ሚሜ ርዝመት እና ከ3.4 እስከ 5.3 ሚሜ ዲያሜትር ያላቸው ናቸው (ምስል 1ለ)። ምንም እንኳን አራት ተለይተዋል (isolates) በ25 ± 2 °ሴ ከ10-12 ቀናት ከተቀቡ በኋላ በባህል መካከለኛው ጠርዝ ላይ የስክሌሮቲያ ጠርዝ ቢኖራቸውም (ምስል 1A)፣ በአንድ ሳህን ውስጥ ያለው የስክሌሮቲያ ብዛት በመካከላቸው በእጅጉ የተለየ ነበር (P < 0.001)፣ ኢሶሌት 3 ከፍተኛውን የስክሌሮቲያ ብዛት ያለው ሲሆን (32.33 ± 1.53 ስክሌሮቲያ በአንድ ሳህን፤ ምስል 1C)። በተመሳሳይ፣ ኢሶሌት #3 ከሌሎች ኢሶሌት ይልቅ በPDB ውስጥ የበለጠ ኦክሳሊክ አሲድ አመርቷል (3.33 ± 0.49 μg.mL−1፤ ምስል 1D)። ኢሶሌት #3 የፊቶፓቶጂኒክ ፈንገስ ስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም የተለመዱ ሞርፎሎጂያዊ እና ጥቃቅን ባህሪያትን አሳይቷል። ለምሳሌ፣ በPDA ላይ፣ የኢሶሌት #3 ቅኝ ግዛቶች በፍጥነት ያደጉ፣ ክሬም ያላቸው ነጭ ነበሩ (ምስል 1A)፣ ተገላቢጦሽ ቢዥ ወይም ቀላል ሳልሞን ቢጫ-ቡናማ ነበሩ፣ እና የ9 ሴ.ሜ ዲያሜትር ያለው ሳህን ወለል ሙሉ በሙሉ ለመሸፈን በ25 ± 2°ሴ ከ6-7 ቀናት ያስፈልጉ ነበር። ከላይ በተጠቀሱት ሞርፎሎጂያዊ እና ጥቃቅን ባህሪያት ላይ በመመስረት፣ ኢሶሌት #3 እንደ ስክሌሮቲኒያ ስክሌሮቲዮረም ተለይቷል።
ምስል 1. ከተለመዱት የጥራጥሬ ሰብሎች የተገኙ የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ተለይቶች ባህሪያት እና በሽታ አምጪነት። (ሀ) በPDA መካከለኛ ላይ አራት የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ተለይቶች የማይሴሊያ እድገት፣ (ለ) አራት የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ተለይቶች ስክሌሮቲያ፣ (ሐ) የስክሌሮቲያ ብዛት (በአንድ ሳህን)፣ (መ) በPDB መካከለኛ ላይ የኦክሳሊክ አሲድ ፈሳሽ (μg.mL−1) እና (ሠ) በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ ተጋላጭ በሆኑ የንግድ የጥራጥሬ ዝርያዎች ላይ አራት የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ተለይቶች የበሽታ ክብደት (%)። እሴቶች የአምስት ባዮሎጂካል ተደጋግሞዎች አማካይ ± SD ይወክላሉ (n = 5)። የተለያዩ ፊደላት በሕክምናዎች መካከል በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (p < 0.05)። (F–H) ከኢሶሌት #3 (dpi) ከተከተቡ በኋላ ባሉት 10 ቀናት ውስጥ ከመሬት በላይ ባሉት ግንዶች እና በሲሊኮች ላይ የተለመዱ የነጭ ሻጋታ ምልክቶች ታይተዋል። (I) የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት #3 ውስጣዊ የተቀረጸ ስፔሰር (ITS) ክልል የዝግመተ ለውጥ ትንተና ከፍተኛውን የዕድል ዘዴ በመጠቀም እና ከብሔራዊ የባዮቴክኖሎጂ መረጃ ማዕከል (NCBI) የውሂብ ጎታ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ከተገኙ 20 የማጣቀሻ ኢሶሌት/ዝርያዎች ጋር በማነፃፀር ተካሂዷል። ከክላስተር መስመሮቹ በላይ ያሉት ቁጥሮች የክልሉን ሽፋን (%) ያመለክታሉ፣ እና ከክላስተር መስመሮቹ በታች ያሉት ቁጥሮች የቅርንጫፉን ርዝመት ያመለክታሉ።
በተጨማሪም፣ በሽታ አምጪነቱን ለማረጋገጥ፣ አራት የተገኙት የኤስ. ስክሌሮቲዮረም አይሶላቶች በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ ተጋላጭ የሆነውን የንግድ ባቄላ ዝርያ ጂዛ 3ን ለመከተብ ጥቅም ላይ ውለዋል፣ ይህም ከኮች ቅድመ ሁኔታዎች ጋር የሚጣጣም ነው (ምስል 1E)። ​​የተገኙት ሁሉም የፈንገስ አይሶላቶች በሽታ አምጪ ቢሆኑም አረንጓዴውን ባቄላ (ሲቪ. ጊዛ 3) ሊበክሉ ቢችሉም፣ ከመሬት በላይ ባሉት ክፍሎች ላይ የተለመዱ ነጭ የሻጋታ ምልክቶችን ሊያስከትሉ ይችላሉ (ምስል 1F)፣ በተለይም በግንዶች (ምስል 1ጂ) እና ፖዶች (ምስል 1H) ላይ፣ ኢሶላ 3 በሁለት ገለልተኛ ሙከራዎች ውስጥ በጣም ኃይለኛ አይሶላ ነበር። ኢሶላ 3 በባቄላ ተክሎች ላይ ከፍተኛውን የበሽታ ክብደት (%) ነበረው (24.0 ± 4.0፣ 58.0 ± 2.0፣ እና 76.7 ± 3.1 በ7፣ 14 እና 21 ቀናት ውስጥ በበሽታው ከተያዘ በኋላ፤ ምስል 1F)።
በጣም ወራሪ የሆነው የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት #3 መለየት በውስጣዊ የተቀረጸ ስፔሰር (ITS) ቅደም ተከተል ላይ ተመስርቶ ተረጋግጧል (ምስል 1I)። በሶሌት #3 እና 20 የማጣቀሻ ኢሶሌት/ዝርያዎች መካከል ያለው የፊሎጄኔቲክ ትንተና በመካከላቸው ከፍተኛ ተመሳሳይነት (>99%) አሳይቷል። የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት #3 (533 bp) ከደረቅ የአተር ዘሮች (የጄንባንክ አክሲዮን ቁጥር MK896659.1፤ 540 bp) እና ከቻይናው ኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት YKY211 (የጄንባንክ አክሲዮን ቁጥር OR206374.1፤ 548 bp) ጋር ከፍተኛ ተመሳሳይነት እንዳለው ልብ ሊባል የሚገባው ሲሆን ይህም የቫዮሌት (ማቲዮላ ኢንካና) ግንድ መበስበስን ያስከትላል፣ ሁሉም በዴንድሮግራም አናት ላይ ለብቻቸው የተደረደሩ ናቸው (ምስል 1I)። አዲሱ ቅደም ተከተል በNCBI የውሂብ ጎታ ውስጥ ተቀምጦ “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accesion number PV202792) ተብሎ ተሰይሟል። isolate 3 በጣም ወራሪ isolate መሆኑን ማየት ይቻላል፤ ስለዚህ፣ ይህ isolate በሁሉም ቀጣይ ሙከራዎች ውስጥ ለጥናት ተመርጧል።
የዲያሚን ኤል-ኦርኒቲን (ሲግማ-አልድሪች፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) በተለያዩ ክምችቶች (12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100 እና 125 ሚ.ግ/ሊ) በኤስ. ስክሌሮቲዮረም ኢሶሌት 3 ላይ ያለው ፀረ-ባክቴሪያ እንቅስቃሴ በብልቃጥ ውስጥ ተመርምሯል። ኤል-ኦርኒቲን ፀረ-ባክቴሪያ ውጤት እንዳሳየ እና ቀስ በቀስ የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ሃይፋን ራዲያል እድገትን በመጠን ጥገኛ በሆነ መንገድ እንዳገደ ልብ ሊባል የሚገባው ነው (ምስል 2A፣ B)። ከፍተኛውን ክምችት (125 ሚ.ግ/ሊ) በፈተነው ከፍተኛ ክምችት (125 ሚ.ግ/ሊ)፣ ኤል-ኦርኒቲን ከፍተኛውን የማይሴሊያል እድገት መከልከል መጠን (99.62 ± 0.27%፤ ምስል 2B) አሳይቷል፣ ይህም ከንግድ ፈንገስ ሪዞሌክስ-ቲ (የመከልከል መጠን 99.45 ± 0.39%፤ ምስል 2C) ጋር እኩል የሆነ ሲሆን ይህም ተመሳሳይ ውጤታማነትን ያሳያል።
ምስል 2. የL-ornithine በ Sclerotinia sclerotiorum ላይ በብልቃጥ ውስጥ ፀረ-ባክቴሪያ እንቅስቃሴ። (ሀ) የተለያዩ የL-ornithine ክምችቶች በ S. sclerotiorum ላይ ከንግድ ፈንገስ Rizolex-T (10 ሚ.ግ./ሊ) ጋር ያለውን ፀረ-ባክቴሪያ እንቅስቃሴ ማወዳደር። (ለ፣ ሐ) የተለያዩ የL-ornithine ክምችቶችን (12.5፣ 25፣ 50፣ 75፣ 100 እና 125 ሚ.ግ./ሊ) ወይም Rizolex-T (2፣ 4፣ 6፣ 8 እና 10 ሚ.ግ./ሊ) ከታከመ በኋላ የS. sclerotiorum mycelium እድገት የመከልከል መጠን (%)። እሴቶች የአምስት ባዮሎጂካል ቅጂዎችን አማካይ ± SD ይወክላሉ (n = 5)። የተለያዩ ፊደላት በሕክምናዎች መካከል ያለውን የስታቲስቲክስ ልዩነት ያመለክታሉ (p < 0.05)። (D፣ E) የL-ornithine እና የንግድ ፈንገስ Rizolex-T ፕሮቢት ሞዴል ሪግሬሽን ትንተና፣ በቅደም ተከተል። የፕሮቢት ሞዴል ሪግሬሽን መስመር እንደ ጠንካራ ሰማያዊ መስመር ይታያል፣ እና የመተማመን ክፍተት (95%) እንደ ሰረዝ የተደረገ ቀይ መስመር ይታያል።
በተጨማሪም፣ የፕሮቢት ሪግሬሽን ትንተና ተካሂዷል እና ተጓዳኝ ንድፎች በሰንጠረዥ 1 እና በስዕሎች 2D,E ውስጥ ይታያሉ። በአጭሩ፣ ተቀባይነት ያለው የቁልቁለት እሴት (y = 2.92x − 4.67) እና ተያያዥ ጉልህ ስታቲስቲክስ (Cox & Snell R2 = 0.3709፣ Nagelkerke R2 = 0.4998 እና p < 0.0001፤ ስዕላዊ መግለጫ 2D) የL-ornithine ከንግድ ፈንገስ Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99፣ Cox & Snell R2 = 0.1242፣ Nagelkerke R2 = 0.1708 እና p < 0.0001) ጋር ሲነጻጸር በS. sclerotiorum ላይ የተሻሻለ የፀረ-ፈንገስ እንቅስቃሴ አሳይቷል (ሠንጠረዥ 1)።
ሠንጠረዥ 1. የ L-ornithine እና የንግድ ፈንገስ “Rizolex-T” በኤስ. ስክሌሮቲዮረም ላይ የግማሽ ከፍተኛ የመከላከያ ክምችት (IC50) እና IC99 (mg/l) እሴቶች።
በአጠቃላይ፣ L-ornithine (250 ሚ.ግ/ሊ) ከህክምና ውጪ ከሆኑ የኤስ. ስክሌሮቲዮረም ከተያዙ ተክሎች ጋር ሲነጻጸር በተታከሙ የተለመዱ የባቄላ ተክሎች ላይ የነጭ ሻጋታ እድገትንና ክብደትን በእጅጉ ቀንሶታል (ቁጥጥር፤ ምስል 3A)። ባጭሩ፣ ምንም እንኳን ያልተታከሙ የተበከሉ የቁጥጥር ተክሎች የበሽታው ክብደት ቀስ በቀስ ቢጨምርም (52.67 ± 1.53፣ 83.21 ± 2.61 እና 92.33 ± 3.06%)፣ L-ornithine በሙከራው ወቅት (8.97 ± 0.15፣ 18.00 ± 1.00 እና 26.36 ± 3.07) የበሽታውን ክብደት በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሶታል (ምስል 3A) ከህክምና በኋላ በ7፣ 14 እና 21 ቀናት (dpt) በቅደም ተከተል (ምስል 3A)። በተመሳሳይ፣ በኤስ. ስክሌሮቲዮረም የተበከሉ የባቄላ ተክሎች በ250 ሚ.ግ/ሊ ሊትር ኤል-ኦርኒቲን ሲታከሙ፣ በበሽታው የመሻሻል ኩርባ (AUDPC) ስር ያለው ቦታ ባልታከመው ቁጥጥር ውስጥ ከ1274.33 ± 33.13 ወደ 281.03 ± 7.95 ቀንሷል፣ ይህም ከአዎንታዊ ቁጥጥር 50 ሚ.ግ/ሊ ሪዞሌክስ-ቲ ፈንገስ (183.61 ± 7.71፤ ምስል 3ለ) ትንሽ ያነሰ ነበር። በሁለተኛው ሙከራ ተመሳሳይ አዝማሚያ ታይቷል።
ምስል 3. የL-ኦርኒቲን ውጫዊ አተገባበር በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ በ Sclerotinia sclerotiorum ምክንያት በተራ ባቄላ ነጭ መበስበስ እድገት ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ። (ሀ) በ250 ሚ.ግ./ሊ. L-ኦርኒቲን ከታከመ በኋላ የተራ ባቄላ ነጭ ሻጋታ የበሽታ እድገት ኩርባ። (ለ) በL-ኦርኒቲን ከታከመ በኋላ የተራ ባቄላ ነጭ ሻጋታ በበሽታው እድገት ኩርባ (AUDPC) ስር ያለው ቦታ። እሴቶች የአምስት ባዮሎጂካል ድግግሞሾችን አማካይ ± SD ይወክላሉ (n = 5)። የተለያዩ ፊደላት በሕክምናዎች መካከል በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (p < 0.05)።
ከ42 ቀናት በኋላ 250 ሚ.ግ./ሊትር የኤል-ኦርኒቲን ውጫዊ አጠቃቀም የእፅዋትን ቁመት ቀስ በቀስ ጨምሯል (ምስል 4A)፣ በእያንዳንዱ ተክል ውስጥ የቅርንጫፎች ብዛት (ምስል 4B) እና በእያንዳንዱ ተክል ውስጥ የቅጠሎች ብዛት (ምስል 4C)። የንግድ ፈንገስ ሪዞሌክስ-ቲ (50 ሚ.ግ./ሊትር) በተጠኑት ሁሉም የአመጋገብ መለኪያዎች ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ቢኖረውም፣ 250 ሚ.ግ./ሊትር የኤል-ኦርኒቲን ውጫዊ አጠቃቀም ከህክምና ካልተደረገላቸው መቆጣጠሪያዎች ጋር ሲነጻጸር ሁለተኛው ትልቁ ውጤት አስገኝቷል (ምስል 4A-C)። በሌላ በኩል፣ የL-ኦርኒቲን ሕክምና በፎቶሲንተቲክ ቀለሞች ክሎሮፊል ኤ (ምስል 4D) እና ክሎሮፊል ቢ (ምስል 4E) ይዘት ላይ ምንም ዓይነት ጉልህ ተጽዕኖ አላሳደረም፣ ነገር ግን ከአሉታዊ ቁጥጥር (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) እና አዎንታዊ ቁጥጥር (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt፤ ምስል 4F) ጋር ሲነጻጸር አጠቃላይ የካሮቲኖይድ ይዘት (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) በትንሹ ጨምሯል። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች L-ኦርኒቲን ለተታከሙ ጥራጥሬዎች ፋይቶቶክሲክ እንዳልሆነ እና እድገታቸውን እንኳን ሊያነቃቃ እንደሚችል ያመለክታሉ።
ምስል 4. በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ በ Sclerotinia sclerotiorum የተበከሉ የባቄላ ቅጠሎች ውጫዊ L-ornithine አተገባበር በእድገት ባህሪያት እና ፎቶሲንተቲክ ቀለሞች ላይ ያለው ተጽእኖ። (A) የእፅዋት ቁመት (ሴሜ)፣ (ለ) በአንድ ተክል የቅርንጫፎች ብዛት፣ (C) በአንድ ተክል የቅጠሎች ብዛት፣ (D) የክሎሮፊል a ይዘት (mg g-1 fr wt)፣ (E) የክሎሮፊል b ይዘት (mg g-1 fr wt)፣ (F) ጠቅላላ የካሮቲኖይድ ይዘት (mg g-1 fr wt)። እሴቶች የአምስት ባዮሎጂካል ድግግሞሽ አማካይ ± SD ናቸው (n = 5)። የተለያዩ ፊደላት በሕክምናዎች መካከል በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (p < 0.05)።
በቦታ ውስጥ የሪአክቲቭ ኦክሲጅን ዝርያዎች (ROS፤ እንደ ሃይድሮጂን ፐርኦክሳይድ [H2O2]) እና ፍሪ ራዲካልስ (እንደ ሱፐርኦክሳይድ አኒየኖች [O2•−]) ውጫዊ አተገባበር የ L-ornithine (250 mg/L) ውጫዊ አተገባበር የ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW፤ ምስል 5A) እና O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW፤ ምስል 5B) ክምችትን በእጅጉ ቀንሶታል፤ ሁለቱም ያልተያዙ የተበከሉ ተክሎች (በቅደም ተከተል 173.31 ± 12.06 እና 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) እና በ50 ሚ.ግ/ሊ የንግድ ፈንገስ ሪዞሌክስ-ቲ (170.12 ± 9.50 እና 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt)፣ በቅደም ተከተል) በ72 ሰዓታት ውስጥ። ከፍተኛ መጠን ያለው H2O2 እና O2•− በ hpt ስር ተከማችተዋል (ምስል 5A፣ B)። በተመሳሳይ፣ በ TCA ላይ የተመሠረተ ማሎንዲያልዴይድ (MDA) ምርመራ እንደሚያሳየው በ S. sclerotiorum የተበከሉ የባቄላ ተክሎች በቅጠሎቻቸው ውስጥ ከፍተኛ መጠን ያለው MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) አከማችተዋል (ምስል 5C)። ሆኖም፣ የ L-ornithine ውጫዊ አተገባበር በታከሙ ተክሎች ውስጥ የ MDA ይዘት መቀነስ (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) በመቀነሱ ምክንያት የሊፒድ ፐርኦክሳይድ መጠንን በእጅጉ ቀንሷል።
ምስል 5. በግሪንሀውስ ሁኔታዎች ውስጥ ከበሽታ በኋላ በ72 ሰዓታት ውስጥ በኤስ. ስክሌሮቲዮረም በተያዙ የባቄላ ቅጠሎች ላይ የውጪ L-ኦርኒቲን አተገባበር በዋና ዋና የኦክሳይድ ውጥረት ምልክቶች እና ኢንዛይማቲክ ያልሆነ የፀረ-ኦክሲዳንት መከላከያ ዘዴዎች ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ። (A) ሃይድሮጂን ፐርኦክሳይድ (H2O2፤ nmol g−1 FW) በ72 hpt፣ (B) ሱፐርኦክሳይድ አኒዮን (O2•−፤ nmol g−1 FW) በ72 hpt፣ (C) ማሎንዲያልዴይድ (MDA፤ nmol g−1 FW) በ72 hpt፣ (D) ጠቅላላ የሚሟሟ ፊኖሎች (mg GAE g−1 FW) በ72 hpt፣ (E) ጠቅላላ የሚሟሟ ፍኖቮኖይድ (mg RE g−1 FW) በ72 hpt፣ (F) ጠቅላላ ነፃ አሚኖ አሲዶች (mg g−1 FW) በ72 hpt፣ እና (G) የፕሮሊን ይዘት (mg g−1 FW) በ72 hpt። እሴቶች የ5 ባዮሎጂካል ድግግሞሽዎችን አማካይ ± መደበኛ መዛባት (አማካኝ ± SD) ይወክላሉ (n = 5)። የተለያዩ ፊደላት በሕክምናዎች መካከል በስታቲስቲክስ ጉልህ የሆኑ ልዩነቶችን ያመለክታሉ (p < 0.05)።