ቀደም ሲል የጉበት ፋይብሮሲስ ባለባቸው ታካሚዎች ውስጥ የአንጀት-ውጤት ያለው ትራይፕቶፋን ሜታቦላይት ኢንዶል-3-ፕሮፒዮኒክ አሲድ (አይፒኤ) የሴረም መጠን ዝቅተኛ መሆኑን ሪፖርት አድርገናል። በዚህ ጥናት ውስጥ፣ ከሴረም IPA መጠን ጋር በተያያዘ በወፍራም ጉበት ውስጥ ያለውን ትራንስክሪፕቶሜም እና ዲኤንኤ ሜቲሎሜ እንዲሁም በብልቃጥ ውስጥ የሄፓቲክ ስቴሌት ሴሎችን (HSCs) ፌኖታይፒክ ኢንአክቲቭ በማድረግ ረገድ የአይፒኤ ሚና መርምረናል።
ጥናቱ በኩኦፒዮ ባሪያትሪክ የቀዶ ጥገና ማዕከል (KOBS) የባሪያትሪክ ቀዶ ጥገና የተደረገላቸው 116 ውፍረት ያላቸው ታካሚዎችን ያካተተ ሲሆን እነዚህም ዓይነት 2 የስኳር በሽታ (T2DM) የሌላቸው (ዕድሜያቸው 46.8 ± 9.3 ዓመት፤ BMI: 42.7 ± 5.0 ኪ.ግ/ሜ²) ነበሩ። የሚዘዋወሩ የአይፒኤ ደረጃዎች በሊኩዊድ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ተለክተዋል፣ የጉበት ትራንስክሪፕቶሜ ትንተና በጠቅላላው አር ኤን ኤ ሴኩዊንሲኬንሲንግ ተከናውኗል፣ እና የዲኤንኤ ሜቲሌሽን ትንተና የተካሄደው ኢንፊኒየም ሂዩማን ሜቲሌሽን450 ቤድቺፕን በመጠቀም ነው። የሰው ሄፓቲክ ስቴሌት ሴሎች (LX-2) ለኢንቪትሮ ሙከራዎች ጥቅም ላይ ውለዋል።
የሴረም IPA ደረጃዎች በጉበት ውስጥ በአፖፕቶቲክ፣ ሚቶፋጂክ እና ረጅም ዕድሜ ውስጥ ከሚገኙ የጂኖች አገላለጽ ጋር የተቆራኙ ናቸው። የAKT ሴሪን/ትሬዮኒን ኪናሴ 1 (AKT1) ጂን በጉበት ትራንስክሪፕት እና በዲኤንኤ ሜቲሌሽን መገለጫዎች ውስጥ በጣም በብዛት እና የበላይ የሆነ መስተጋብር ያለው ጂን ነበር። የአይፒኤ ሕክምና አፖፕቶሲስን፣ የማይቶኮንድሪያል መተንፈስን መቀነስን እና የሴል ሞርፎሎጂ እና የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስን በመቀየር የተለወጠ የሴል ሞርፎሎጂ እና የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስን አስከትሏል፣ ይህም ፋይብሮሲስን፣ አፖፕቶሲስን እና የLX-2 ሴሎችን ህልውና የሚቆጣጠሩትን ጂኖች አገላለጽ በመቀየር ነው።
እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሲጣመሩ፣ አይፒኤ የሕክምና ውጤቶች እንዳሉት እና አፖፕቶሲስን ሊያስከትል እና የኤችኤስሲ ፊኖታይፕን ወደ እንቅስቃሴ-አልባ ሁኔታ ሊያሸጋግር እንደሚችል ይደግፋሉ፣ በዚህም የጉበት ፋይብሮሲስን የመግታት እድልን በኤችኤስሲ ማግበር እና በማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም ውስጥ ጣልቃ በመግባት ያስፋፋል።
ከመጠን ያለፈ ውፍረት እና የሜታቦሊክ ሲንድሮም ስርጭት ከሜታቦሊዝም ጋር የተያያዘ የሰባ የጉበት በሽታ (MASLD) እየጨመረ ከመምጣቱ ጋር ተያይዟል፤ በሽታው ከጠቅላላው ህዝብ ከ25% እስከ 30% ይጎዳል [1]። የMASLD መንስኤ ዋና መዘዝ የጉበት ፋይብሮሲስ ሲሆን ይህም በተከታታይ የፋይበር ሴሉላር ማትሪክስ (ECM) ክምችት የሚለይ ተለዋዋጭ ሂደት ነው [2]። በጉበት ፋይብሮሲስ ውስጥ የተሳተፉት ዋና ዋና ሴሎች የጉበት ስቴሌት ሴሎች (HSCs) ሲሆኑ አራት የሚታወቁ ፊኖታይፖችን ያሳያሉ፡ ጸጥ ያሉ፣ የተነቃቁ፣ የተነቃቁ እና የእርጅና ጊዜ ያላቸው [3፣ 4]። HSCዎች ከጸጥታ ቅርጽ ወደ ከፍተኛ የኃይል ፍላጎት ያላቸው ፕሮሊፈሬቲቭ ፋይብሮብላስት-መሰል ሴሎች ሊነቃቁ እና ሊለወጡ ይችላሉ፣ ይህም የα-ለስላሳ የጡንቻ አክቲን (α-SMA) እና የአይነት I ኮላጅን (Col-I) አገላለጽን ይጨምራል [5፣ 6]። የጉበት ፋይብሮሲስ በሚቀለበስበት ጊዜ፣ የተነቃቁ HSCዎች በአፖፕቶሲስ ወይም በማነቃቃት ይወገዳሉ። እነዚህ ሂደቶች የፋይብሮጂኒክ ጂኖችን መቀነስ እና የፕሮሱርቪቫል ጂኖችን (እንደ NF-κB እና PI3K/Akt የምልክት መንገዶች ያሉ) ማስተካከልን ያካትታሉ [7, 8]፣ እንዲሁም በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ እና ተግባር ላይ የተደረጉ ለውጦችን [9]።
በአንጀት ውስጥ የሚመረተው የትራይፕቶፋን ሜታቦላይት ኢንዶሌ-3-ፕሮፒዮኒክ አሲድ (አይፒኤ) የሴረም መጠን በሰው ልጅ የሜታቦሊክ በሽታዎች ላይ MASLD [10-13]ን ጨምሮ ቀንሷል። IPA ከምግብ ፋይበር ቅበላ ጋር የተያያዘ ሲሆን በፀረ-ኦክሲዳንት እና ፀረ-ብግነት ተፅእኖዎች ይታወቃል፣ እና በቪቮ እና ኢንቪትሮ [11-14] ውስጥ በአመጋገብ ምክንያት የሚመጣውን የአልኮል ያልሆነ ስቴቶሄፓታይተስ (NASH) phenotypeን ይቀንሳል። አንዳንድ ማስረጃዎች ከቀደመው ጥናታችን የተገኙ ሲሆን ይህም በኩኦፒዮ ባሪያትሪክ የቀዶ ጥገና ጥናት (KOBS) ውስጥ የጉበት ፋይብሮሲስ ከሌላቸው ወፍራም ታካሚዎች ይልቅ የሴረም IPA መጠን ዝቅተኛ መሆኑን አሳይቷል። በተጨማሪም፣ የአይፒኤ ሕክምና በሰው ልጅ የጉበት ስቴሌት ሴል (LX-2) ሞዴል ውስጥ የሴል ማጣበቂያ፣ የሴል ፍልሰት እና የሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴል ማግበር ክላሲካል ምልክቶች የሆኑትን ጂኖች አገላለጽ ሊቀንስ እንደሚችል እና እምቅ የሄፓቶፕሮቴክቲቭ ሜታቦላይት [15] መሆኑን አሳይተናል። ሆኖም፣ IPA የኤችኤስሲ አፖፕቶሲስን እና ሚቶኮንድሪያል ባዮኢነርጂቲክስን በማግበር የጉበት ፋይብሮሲስ ሪግሬሽን እንዴት እንደሚያመጣ ግልጽ አይደለም።
እዚህ ላይ፣ የሴረም IPA በወፍራም ነገር ግን ዓይነት 2 የስኳር በሽታ በሌላቸው ሰዎች ጉበት ውስጥ በአፖፕቶሲስ፣ ሚቶፋጊ እና ረጅም ዕድሜ ውስጥ ከሚገኙ የጂኖች አገላለጽ ጋር የተቆራኘ መሆኑን እናሳያለን። በተጨማሪም፣ IPA በማነቃቂያ መንገድ በኩል የነቃ የሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎችን (HSCs) ማጽዳት እና መበላሸት ሊያስከትል እንደሚችል ደርሰንበታል። እነዚህ ውጤቶች ለአይፒኤ አዲስ ሚና ያሳያሉ፣ ይህም የጉበት ፋይብሮሲስ ሪግሬሽንን ለማሳደግ እምቅ የሕክምና ኢላማ ያደርገዋል።
ቀደም ሲል በKOBS ቡድን ውስጥ የተደረገ ጥናት እንደሚያሳየው የጉበት ፋይብሮሲስ ያለባቸው ታካሚዎች የጉበት ፋይብሮሲስ ከሌላቸው ታካሚዎች ጋር ሲነፃፀሩ ዝቅተኛ የደም ዝውውር IPA መጠን እንዳላቸው አሳይቷል [15]። የዓይነት 2 የስኳር በሽታ ሊያስከትል የሚችለውን ግራ የሚያጋባ ውጤት ለማስወገድ፣ ከ KOBS ጥናት ውስጥ እንደ ጥናት ሕዝብ [16] በጽሑፍ የተረጋገጠ ፈቃድ ሰጥተው በሰሜን ሳቮ ካውንቲ ሆስፒታል የሥነ ምግባር ኮሚቴ ጸድቋል።
የጉበት ባዮፕሲ ናሙናዎች የተገኙት በባሪያትሪክ ቀዶ ጥገና ወቅት ሲሆን ቀደም ሲል በተገለጹት መመዘኛዎች መሠረት ልምድ ባላቸው የፓቶሎጂ ባለሙያዎች ሂስቶሎጂያዊ በሆነ መንገድ ተገምግመዋል [17፣ 18]። የግምገማ መስፈርቶቹ በተጨማሪ ሰንጠረዥ S1 ውስጥ ተጠቃለዋል እና ቀደም ሲል ተገልጸዋል [19]።
የጾም ሴረም ናሙናዎች ለሜታቦሎሚክስ ትንተና (n = 116) ባልተነጣጠረ ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ-ማስ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) ተተነተኑ። ናሙናዎቹ ቀደም ሲል እንደተገለፀው በ UHPLC-qTOF-MS ስርዓት (1290 LC፣ 6540 qTOF-MS፣ Agilent Technologies፣ Waldbron፣ Karlsruhe፣ ጀርመን) በመጠቀም ተተነተኑ19። የኢሶፕሮፒል አልኮሆል (IPA) መለየት የተመሰረተው በማቆያ ጊዜ እና የ MS/MS ስፔክትረምን ከንፁህ ደረጃዎች ጋር በማነፃፀር ላይ ነው። በሁሉም ተጨማሪ ትንታኔዎች የአይፒኤ የምልክት ጥንካሬ (ከፍተኛ ቦታ) ግምት ውስጥ ገብቷል [20]።
ሙሉ የጉበት አር ኤን ኤ ቅደም ተከተል በኢሉሚና ሂሴክ 2500 በመጠቀም ተካሂዷል እና መረጃው ቀደም ሲል እንደተገለጸው [19፣ 21፣ 22] አስቀድሞ ተካሂዷል። ከሚቶሚኒየር 4.0 የውሂብ ጎታ [23] የተመረጡ 1957 ጂኖችን በመጠቀም በማይቶኮንድሪያል ተግባር/ባዮጄኔሲስ ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩ ግልባጮችን ኢላማ የተደረገ ልዩነት ያለው አገላለጽ ትንተና አድርገናል። የጉበት ዲኤንኤ ሜቲሌሽን ትንተና የተከናወነው ቀደም ሲል እንደተገለጸው [24፣ 25] በመጠቀም በኢንፊኒየም ሂዩማን ሜቲሌሽን450 ቤድቺፕ (ኢሉሚና፣ ሳንዲያጎ፣ ካሊፎርኒያ፣ ዩኤስኤ) በመጠቀም ነው።
የሰው ሄፓቲክ ስቴሌት ሴሎች (LX-2) በፕሮፌሰር ስቴፋኖ ሮሞ በደግነት ተሰጥቷቸው በDMEM/F12 መካከለኛ (ባዮዌስት፣ L0093-500፣ 1% Pen/Strep፤ Lonza፣ DE17-602E፣ 2% FBS፤ Gibco፣ 10270-106) ውስጥ ተቀርፀው ተጠብቀው ቆይተዋል። የIPA የስራ መጠን ለመምረጥ፣ የLX-2 ሴሎች በDMEM/F12 መካከለኛ ውስጥ ለ24 ሰዓታት በተለያዩ የIPA ክምችት (10 μM፣ 100 μM እና 1 mM፤ ሲግማ፣ 220027) ታክመዋል። በተጨማሪም፣ IPA HSCዎችን የማገድ ችሎታን ለመመርመር፣ የLX-2 ሴሎች በ5 ng/ml TGF-β1 (R&D ስርዓቶች፣ 240-B-002/CF) እና በ1 mM IPA ከሴረም-ነጻ መካከለኛ ጋር ለ24 ሰዓታት ታክመዋል። ለተዛማጅ የተሽከርካሪ መቆጣጠሪያዎች፣ 0.1% BSA የያዘ 4 nM HCL ለ TGF-β1 ሕክምና ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና 0.05% DMSO ለ IPA ሕክምና ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና ሁለቱም ለቅይጥ ሕክምና አንድ ላይ ጥቅም ላይ ውለዋል።
አፖፕቶሲስ የተገመገመው በአምራቹ መመሪያ መሠረት በFITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ከ7-AAD (ባዮሌጀንድ፣ ሳንዲያጎ፣ ካሊፎርኒያ፣ ዩኤስኤ፣ ካት# 640922) ጋር በFITC Annexin V Apoptosis Detection Kit በመጠቀም ነው። በአጭሩ፣ LX-2 (1 × 105 ሴሎች/ጉድጓድ) በአንድ ሌሊት በ12-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ተክለዋል ከዚያም በበርካታ የIPA ወይም IPA እና TGF-β1 መጠኖች ታክመዋል። በማግስቱ፣ ተንሳፋፊ እና ተጣባቂ ሴሎች ተሰብስበው፣ ትራይፕሲኒዝ ተደርገዋል፣ በPBS ታጥበዋል፣ በአኔክሲን V ማያያዣ ቋት ውስጥ እንደገና ተዘግተዋል፣ እና በFITC-Annexin V እና 7-AAD ለ15 ደቂቃዎች ታክመዋል።
በህይወት ህዋሶች ውስጥ ያለው ሚቶኮንድሪያ ለኦክሲዴቲቭ እንቅስቃሴ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific፣ Carlsbad፣ CA) ተቀባ። ለMTR ምርመራዎች፣ የLX-2 ሴሎች ከIPA እና TGF-β1 ጋር በእኩል መጠን እንዲተከሉ ተደርጓል። ከ24 ሰዓታት በኋላ፣ ሕያው ህዋሶች ትራይፕሲኒዝድ ተደርገዋል፣ በPBS ታጥበዋል፣ ከዚያም ቀደም ሲል እንደተገለጸው በ37°ሴ ለ20 ደቂቃዎች በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ በ100 μM MTR ታጥበዋል [26]። ለቀጥታ ህዋሳት ሞርፎሎጂ ትንተና፣ የህዋሳት መጠን እና የሳይቶፕላዝም ውስብስብነት በቅደም ተከተል ወደፊት ስትራክቸር (FSC) እና የጎን ስትራክቸር (SSC) መለኪያዎችን በመጠቀም ተተነተኑ።
ሁሉም መረጃዎች (30,000 ክስተቶች) የተገኙት NovoCyte Quanteon (Agilent) በመጠቀም ሲሆን NovoExpress® 1.4.1 ወይም FlowJo V.10 ሶፍትዌርን በመጠቀም ተተነተኑ።
የኦክስጅን ፍጆታ መጠን (OCR) እና ከሴል ውጭ ያለው የአሲድነት መጠን (ECAR) በእውነተኛ ጊዜ የተለኩት በአምራቹ መመሪያ መሰረት የሲሆርስ ኤክስትራሴሉላር ፍሉክስ አናሊዘር (Agilent Technologies፣ Santa Clara፣ CA) የተገጠመለትን የሲሆርስ ኤክስትራሴሉላር ፍሉክስ አናሊዘር (Agilent Technologies፣ Santa Clara፣ CA) በመጠቀም ነው። ባጭሩ፣ 2 × 104 LX-2 ሴሎች/ጉድጓድ በXF96 የሴል ባህል ሳህኖች ላይ ተዘርተዋል። በአንድ ሌሊት ከተቀቡ በኋላ፣ ሴሎች በኢሶፕሮፓኖል (IPA) እና TGF-β1 (ተጨማሪ ዘዴዎች 1) ታክመዋል። የውሂብ ትንተና የተከናወነው የሲሆርስ XF ሴል ኢነርጂ ፊኖታይፕ የሙከራ ሪፖርት ጀነሬተርን ጨምሮ የሲሆርስ XF ዌቭ ሶፍትዌርን በመጠቀም ነው። ከዚህ፣ የባዮኢነርጂቲክ የጤና መረጃ ጠቋሚ (BHI) ተሰላ [27]።
ጠቅላላ አር ኤን ኤ ወደ cDNA ተቀይሯል። ለተወሰኑ ዘዴዎች፣ ማጣቀሻውን [15] ይመልከቱ። የሰው 60S ራይቦሶም አሲድ ፕሮቲን P0 (RPLP0) እና ሳይክሎፊሊን A1 (PPIA) mRNA ደረጃዎች እንደ ኮንስቲቱቲቭ ጂን መቆጣጠሪያዎች ጥቅም ላይ ውለዋል። የኳንትስቱዲዮ 6 ፕሮ ሪል-ታይም PCR ሲስተም (ቴርሞ ፊሸር፣ ላንድስሜር፣ ኔዘርላንድስ) ከTaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ወይም Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline፣ BIO 94050) ጋር ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና አንጻራዊ የጂን አገላለጽ እጥፋት የተሰላው በንጽጽር የCt እሴት ዑደት መለኪያዎች (ΔΔCt) እና ∆∆Ct ዘዴ ነው። የፕሪመሮች ዝርዝሮች በተጨማሪ ሰንጠረዦች S2 እና S3 ውስጥ ቀርበዋል።
የኑክሌር ዲኤንኤ (ncDNA) እና ማይቶኮንድሪያል ዲኤንኤ (mtDNA) ቀደም ሲል እንደተገለጸው [28] የዲኔይስ ደም እና የቲሹ ኪት (Qiagen) በመጠቀም ተወስደዋል። የmtDNA አንጻራዊ መጠን የተሰላው የእያንዳንዱ ኢላማ mtDNA ክልል ከሶስቱ የኑክሌር ዲኤንኤ ክልሎች (mtDNA/ncDNA) ጂኦሜትሪክ አማካኝ ጋር በማነፃፀር ሲሆን ይህም በተጨማሪ ዘዴዎች 2 ላይ እንደተገለጸው ነው። የmtDNA እና ncDNA ፕሪመሮች ዝርዝሮች በተጨማሪ ሰንጠረዥ S4 ውስጥ ቀርበዋል።
ሕያው ሴሎች በMitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific፣ Carlsbad፣ CA) ቀለም የተቀቡ ሲሆን ይህም በሴል እና በሴሉላር ውስጥ በሚገኙ የ mitochondrial ኔትወርኮች ላይ ይታያል። LX-2 ሴሎች (1 × 104 ሴሎች/ጉድጓድ) በመስታወት ስላይዶች ላይ በተዛማጅ የመስታወት ታች ባላቸው የባህል ሳህኖች (Ibidi GmbH፣ Martinsried፣ Germany) ውስጥ ተቀርፀዋል። ከ24 ሰዓታት በኋላ፣ ሕያው LX-2 ሴሎች በ100 μM MTR ለ20 ደቂቃዎች በ37 °C እንዲቀቡ ተደርገዋል እና የሴል ኒውክሊየሶች ቀደም ሲል እንደተገለጸው በDAPI (1 μg/ml፣ Sigma-Aldrich) ቀለም የተቀቡ ነበሩ። የሚቶኮንድሪያል ኔትወርኮች በ37 °C እርጥበት ባለው ከባቢ አየር ውስጥ 5% CO2 ባለው 5% CO2 የተገጠመለት የዚይስ LSM 800 ኮንፎካል ሞዱል በመጠቀም ታይተዋል። ለእያንዳንዱ የናሙና አይነት አስር የZ-ተከታታይ ምስሎችን አግኝተናል። እያንዳንዱ የZ-ተከታታይ ክፍል 30 ክፍሎችን የያዘ ሲሆን እያንዳንዳቸው 9.86 μm ውፍረት አላቸው። ለእያንዳንዱ ናሙና፣ አስር የተለያዩ የእይታ መስኮች ምስሎች የተገኙት በZEN 2009 ሶፍትዌር (ካርል ዜይስ ማይክሮኢሜጂንግ GmbH፣ ጄና፣ ጀርመን) በመጠቀም ሲሆን፣ በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ትንተና የተከናወነው በተጨማሪ ዘዴዎች 3 ላይ በተዘረዘረው መለኪያ መሰረት በImageJ ሶፍትዌር (v1.54d) [30, 31] በመጠቀም ነው።
ሴሎቹ በ0.1 M ፎስፌት ቋት ውስጥ በ2% ግሉታራሌይድ ተስተካክለዋል፣ ከዚያም በ1% ኦስሚየም ቴትሮክሳይድ መፍትሄ (ሲግማ አልድሪክ፣ ኤምኦ፣ ዩኤስኤ) ተጠግነዋል፣ ቀስ በቀስ በአሴቶን (ሜርክ፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) ደረቅ ሆነው በመጨረሻም በኢፖክሲ ሬዚን ውስጥ ተክለዋል። እጅግ በጣም ቀጭን ክፍሎች ተዘጋጅተው በ1% ዩራኒል አሲቴት (ሜርክ፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) እና በ1% ሊድ ሲትሬት (ሜርክ፣ ዳርምስታድት፣ ጀርመን) ቀለም ተቀባ። እጅግ በጣም ቀጭን ምስሎች የተገኙት በ80 kV ፍጥነት ባለው የቮልቴጅ መጠን በጄኤም 2100F EXII ማስተላለፊያ ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፕ (JEOL Ltd፣ ቶኪዮ፣ ጃፓን) በመጠቀም ነው።
ለ24 ሰዓታት በአይፒኤ የታከሙ የLX-2 ሴሎች ሞርፎሎጂ በዜይስ የተገለበጠ የብርሃን ማይክሮስኮፕ (ዜይስ አክሲዮ ቨርት.ኤ1 እና አክሲዮካም ኤምአርኤም፣ ጄና፣ ጀርመን) በመጠቀም በ50x ማጉላት በደረጃ ንፅፅር ማይክሮስኮፒ ተተነተነ።
ክሊኒካዊ መረጃዎች እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ወይም መካከለኛ (ኢንተርኳርትል ክልል፡ IQR) ተገልጸዋል። በሦስቱ የጥናት ቡድኖች መካከል ያለውን ልዩነት ለማነፃፀር የልዩነት (ቀጣይነት ያላቸው ተለዋዋጮች) ወይም χ² ሙከራ (የምድብ ተለዋዋጮች) የአንድ አቅጣጫ ትንተና ጥቅም ላይ ውለዋል። የውሸት አዎንታዊ መጠን (FDR) ለብዙ ሙከራዎች ለማስተካከል ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና FDR < 0.05 ያላቸው ጂኖች በስታቲስቲክስ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ተቆጥረዋል። የስፓርማን ትስስር ትንተና የCpG ዲ ኤን ኤ ሜቲሌሽንን ከIPA የምልክት ጥንካሬ ጋር ለማዛመድ ጥቅም ላይ ውሏል፣ ስመታዊ p እሴቶች (p < 0.05) ሪፖርት ተደርጓል።
የፓትዌይ ትንተና የተከናወነው በድር ላይ የተመሠረተ የጂን ስብስብ ትንተና መሳሪያ (WebGestalt) በመጠቀም ሲሆን ይህም 268 ግልባጮችን (ስመ p < 0.01)፣ 119 ሚቶኮንድሪያን-ተያያዥ ግልባጮችን (ስመ p < 0.05) እና ከደም ዝውውር የሴረም IPA ደረጃዎች ጋር የተያያዙ 3093 የጉበት ግልባጮችን 4350 CpGs በመጠቀም ነው። በነፃ የሚገኘው የቬኒ DB (ስመ 2.1.0) መሳሪያ ተደራራቢ ጂኖችን ለማግኘት ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና StringDB (ስመ 11.5) የፕሮቲን-ፕሮቲን ግንኙነቶችን በምስል ለማየት ጥቅም ላይ ውሏል።
ለLX-2 ሙከራ፣ ናሙናዎች ለመደበኛነት የዲአጎስቲኖ-ፒርሰን ሙከራን በመጠቀም ተፈትነዋል። መረጃዎቹ ቢያንስ ከሶስት ባዮሎጂካል ቅጂዎች የተገኙ ሲሆን በቦንፌሮኒ ድህረ-ሆክ ሙከራ ለአንድ-መንገድ ANOVA ተገዝተዋል። ከ0.05 በታች የሆነ የp-እሴት በስታቲስቲክስ ጉልህ እንደሆነ ተቆጥሯል። መረጃው እንደ አማካይ ± SD ቀርቧል፣ እና የሙከራዎቹ ብዛት በእያንዳንዱ ምስል ላይ ተገልጿል። ሁሉም ትንታኔዎች እና ግራፎች የተከናወኑት ለዊንዶውስ GraphPad Prism 8 ስታቲስቲክስ ሶፍትዌርን በመጠቀም ነው (GraphPad Software Inc.፣ ስሪት 8.4.3፣ ሳንዲያጎ፣ አሜሪካ)።
በመጀመሪያ፣ የሴረም IPA ደረጃዎችን ከጉበት፣ ከመላው አካል እና ከሚቶኮንድሪያል ትራንስክሪፕቶች ጋር ያለውን ግንኙነት መርምረናል። በአጠቃላይ ትራንስክሪፕሽን ፕሮፋይል ውስጥ፣ ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር የተያያዘው በጣም ጠንካራው ጂን MAPKPK3 (FDR = 0.0077፤ mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3) ነበር፤ በማይቶኮንድሪያል-ተዛማጅ ትራንስክሪፕሽን ፕሮፋይል ውስጥ፣ በጣም ጠንካራው ተዛማጅ ጂን AKT1 (FDR = 0.7621፤ AKT serine/threonine kinase 1) (ተጨማሪ ፋይል 1 እና ተጨማሪ ፋይል 2) ነበር።
ከዚያም ዓለም አቀፍ ትራንስክሪፕቶችን (n = 268፤ p < 0.01) እና ሚቶኮንድሪያን-ተያያዥ ትራንስክሪፕቶችን (n = 119፤ p < 0.05) ተንትነናል፣ በመጨረሻም አፖፕቶሲስን እንደ በጣም ጉልህ የሆነ ቀኖናዊ መንገድ ለይተን አውቀነዋል (p = 0.0089)። ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር ለተያያዙ ሚቶኮንድሪያን ትራንስክሪፕቶች፣ በአፖፕቶሲስ (FDR = 0.00001)፣ ሚቶፋጊ (FDR = 0.00029) እና በTNF ሲግናል መንገዶች (FDR = 0.000006) ላይ አተኩረናል (ምስል 1A፣ ሠንጠረዥ 2፣ እና ተጨማሪ ምስሎች 1A-B)።
ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር በተያያዘ በሰው ጉበት ውስጥ ያሉ ዓለም አቀፍ፣ ከሚቶኮንድሪያ ጋር የተያያዙ ግልባጮች እና የዲኤንኤ ሜቲሌሽን መደራረብ ትንተና። A ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር የተያያዙ 3092 የCpG ጣቢያዎች ጋር የተነደፉ 268 ዓለም አቀፍ ግልባጮችን፣ 119 ሚቶኮንድሪያ ጋር የተያያዙ ግልባጮችን እና የዲኤንኤ ሜቲሌይት ግልባጮችን ይወክላል (p እሴቶች < 0.01 ለአለም አቀፍ ግልባጮች እና ዲኤንኤ ሜቲሌይት፣ እና p እሴቶች < 0.05 ለማቶኮንድሪያ ግልጋሎቶች)። ዋናዎቹ ተደራራቢ ግልባጮች በመሃል ላይ ይታያሉ (AKT1 እና YKT6)። ለ ከሌሎች ጂኖች ጋር ከፍተኛውን የግንኙነት ነጥብ (0.900) ያላቸው 13 ጂኖች የመተጋገዝ ካርታ የተገነባው ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር በእጅጉ የተያያዙ 56 ተደራራቢ ጂኖች (ጥቁር መስመር ክልል) ሲሆን እነዚህም ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር በእጅጉ የተያያዙት ከ StringDB የመስመር ላይ መሳሪያ በመጠቀም ነው። አረንጓዴ፡ ከጂን ኦንቶሎጂ (GO) ሴሉላር አካል ጋር የተነደፉ ጂኖች፡ ሚቶኮንድሪያ (GO:0005739)። AKT1 ከሌሎች ፕሮቲኖች ጋር በመረጃው ላይ ተመስርተው ለሚያደርጉት መስተጋብር ከፍተኛውን ውጤት (0.900) ያለው ፕሮቲን ነው (በጽሑፍ ማዕድን ማውጣት፣ ሙከራዎች፣ የውሂብ ጎታዎች እና በጋራ አገላለጽ ላይ የተመሠረተ)። የኔትወርክ ኖዶች ፕሮቲኖችን ይወክላሉ፣ እና ጠርዞች በፕሮቲኖች መካከል ያለውን ግንኙነት ይወክላሉ።
የአንጀት ማይክሮባዮታ ሜታቦላይቶች የኤፒጄኔቲክ ስብጥርን በዲኤንኤ ሜቲሌሽን [32] ሊቆጣጠሩ ስለሚችሉ፣ የሴረም IPA ደረጃዎች ከጉበት ዲኤንኤ ሜቲሌሽን ጋር የተያያዙ መሆናቸውን መርምረናል። ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር የተያያዙት ሁለቱ ዋና ዋና የሜቲሌሽን ቦታዎች ፕሮላይን-ሴሪን-ሪች ሪጅን 3 (C19orf55) እና የሙቀት ድንጋጤ ፕሮቲን ቤተሰብ B (ትንሽ) አባል 6 (HSPB6) አቅራቢያ መሆናቸውን ደርሰንበታል (ተጨማሪ ፋይል 3)። የ4350 CpG (p < 0.01) የዲኤንኤ ሜቲሌሽን ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር የተቆራኘ ሲሆን ረጅም ዕድሜ ባለው የቁጥጥር መንገዶች (p = 0.006) የበለፀገ ነው (ምስል 1A፣ ሠንጠረዥ 2፣ እና ተጨማሪ ምስል 1C)።
በሰው ጉበት ውስጥ ባለው የሴረም IPA ደረጃዎች፣ ዓለም አቀፍ ግልባጮች፣ ከሚቶኮንድሪያ ጋር የተያያዙ ግልባጮች እና የዲኤንኤ ሜቲሌሽን መካከል ያለውን ግንኙነት ለመረዳት፣ በቀድሞው የመንገድ ትንተና ውስጥ በተለዩት ጂኖች ላይ የተደራረበ ትንተና አድርገናል (ምስል 1A)። የ56 ተደራራቢ ጂኖች የመንገድ ማበልጸጊያ ትንተና ውጤቶች (በስእል 1A ውስጥ ባለው ጥቁር መስመር ውስጥ) የአፖፕቶሲስ መንገድ (p = 0.00029) ለሶስቱ ትንታኔዎች የተለመዱ ሁለት ጂኖችን አጉልቶ አሳይቷል፡ AKT1 እና YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog)፣ በቬን ዲያግራም (ተጨማሪ ምስል 2 እና ምስል 1A) ላይ እንደሚታየው። የሚገርመው፣ AKT1 (cg19831386) እና YKT6 (cg24161647) ከሴረም IPA ደረጃዎች ጋር በአዎንታዊ መልኩ የተቆራኙ መሆናቸውን አግኝተናል (ተጨማሪ ፋይል 3)። በጂን ምርቶች መካከል ሊሆኑ የሚችሉ የፕሮቲን ግንኙነቶችን ለመለየት፣ በ56 ተደራራቢ ጂኖች መካከል ከፍተኛውን የጋራ የክልል ውጤት (0.900) ያላቸውን 13 ጂኖች እንደ ግብዓት መርጠና የግንኙነት ካርታ ገንብተናል። በራስ መተማመን ደረጃ (የኅዳግ በራስ መተማመን) መሠረት፣ ከፍተኛ ውጤት (0.900) ያለው የAKT1 ጂን ከላይ ነበር (ምስል 1ለ)።
በመንገዱ ትንተና ላይ በመመስረት፣ አፖፕቶሲስ ዋነኛው መንገድ መሆኑን ደርሰንበታል፣ ስለዚህ የአይፒኤ ሕክምና በብልቃጥ ውስጥ የኤችኤስሲዎችን አፖፕቶሲስ ይጎዳ እንደሆነ መርምረናል። ቀደም ሲል የተለያዩ የአይፒኤ መጠኖች (10 μM፣ 100 μM እና 1 mM) ለLX-2 ሴሎች መርዛማ እንዳልሆኑ አሳይተናል [15]። ይህ ጥናት በ10 μM እና 100 μM ላይ ያለው የአይፒኤ ሕክምና የሚንቀሳቀሱ እና የነርቭ ሴሎችን ቁጥር እንደጨመረ አሳይቷል። ሆኖም፣ ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር፣ የሕዋስ ህያውነት በ1 mM IPA ክምችት ቀንሷል፣ የሕዋስ ኒክሮሲስ መጠን ግን ሳይለወጥ ቆይቷል (ምስል 2A፣ B)። በመቀጠል፣ በLX-2 ሴሎች ውስጥ አፖፕቶሲስን ለማስነሳት ተስማሚውን ክምችት ለማግኘት፣ ለ24 ሰዓታት 10 μM፣ 100 μM እና 1 mM IPA ሞክረናል (ምስል 2A-E እና ተጨማሪ ምስል 3A-B)። የሚገርመው ነገር፣ IPA 10 μM እና 100 μM የአፖፕቶሲስ መጠንን (%) ቀንሰዋል፣ ሆኖም ግን፣ IPA 1 mM ከቁጥጥር ጋር ሲነጻጸር የዘገየ አፖፕቶሲስ እና የአፖፕቶሲስ መጠን (%) ጨምሯል፣ ስለዚህ ለተጨማሪ ሙከራዎች ተመርጧል (ምስል 2A–D)።
IPA የLX-2 ሴሎችን አፖፕቶሲስ ያነሳሳል። የአፖፕቶቲክ መጠን እና የሴል ሞርፎሎጂን በፍሰት ሳይቶሜትሪ ለመለካት አኔክሲን ቪ እና 7-AAD ድርብ ቀለም ዘዴ ጥቅም ላይ ውሏል። የቢኤ ሴሎች በ10 μM፣ 100 μM እና 1 mM IPA ለ24 ሰዓታት ወይም በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ ለ24 ሰዓታት በF–H TGF-β1 (5 ng/ml) እና 1 mM IPA ተጨምረዋል። ​​ሀ፡ ሕያው ሴሎች (አኔክሲን V -/ 7AAD-); ለ፡ ኒክሮቲክ ሴሎች (አኔክሲን V -/ 7AAD+); C፣ F: ቀደምት (አኔክሲን V +/ 7AAD-); D፣ G: ዘግይቶ (አኔክሲን V+/7AAD.+); E፣ H: በአፖፕቶቲክ መጠን (%) ውስጥ የጠቅላላ የመጀመሪያ እና ዘግይቶ የአፖፕቶቲክ ሴሎች መቶኛ ይገለፃሉ። መረጃው እንደ አማካኝ ± SD፣ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎች ይገለጻል። የስታቲስቲክስ ንጽጽሮች የተከናወኑት በአንድ አቅጣጫ ANOVA ከቦንፌሮኒ የድህረ-ሆክ ሙከራ ጋር በመጠቀም ነው። *p < 0.05; ****p < 0.0001
ቀደም ብለን እንዳሳየነው፣ 5 ng/ml TGF-β1 የክላሲካል ማርከር ጂኖችን አገላለጽ በመጨመር የHSC ማግበርን ሊያመጣ ይችላል [15]። የLX-2 ሴሎች በ5 ng/ml TGF-β1 እና 1 mM IPA በጥምረት ታክመዋል (ምስል 2E-H)። የTGF-β1 ሕክምና የአፖፕቶሲስ መጠንን አልለወጠውም፣ ሆኖም የIPA የጋራ ሕክምና ከTGF-β1 ሕክምና ጋር ሲነጻጸር የዘገየ አፖፕቶሲስ እና የአፖፕቶሲስ መጠን (%) ጨምሯል (ምስል 2E-H)። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት 1 mM IPA ከTGF-β1 ኢንዳክሽን ውጭ በLX-2 ሴሎች ውስጥ አፖፕቶሲስን ሊያመጣ ይችላል።
በተጨማሪም የአይፒኤ (IPA) በLX-2 ሴሎች ውስጥ በሚቶኮንድሪያል መተንፈስ ላይ የሚያሳድረውን ተጽእኖ መርምረናል። ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት 1 mM IPA የኦክስጅን ፍጆታ መጠን (OCR) መለኪያዎችን ቀንሷል፡- የማይቶኮንድሪያል መተንፈስ፣ መሰረታዊ እና ከፍተኛ መተንፈስ፣ የፕሮቶን መፍሰስ እና የATP ምርት ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር (ምስል 3A፣ B)፣ የባዮኢነርጂቲክ የጤና መረጃ ጠቋሚ (BHI) ግን አልተለወጠም።
IPA በLX-2 ሴሎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል መተንፈስን ይቀንሳል። የማይቶኮንድሪያል የመተንፈሻ ኩርባ (OCR) እንደ ሚቶኮንድሪያል የመተንፈሻ መለኪያዎች (ማይቶኮንድሪያል ያልሆነ መተንፈስ፣ መሰረታዊ መተንፈስ፣ ከፍተኛ መተንፈስ፣ የፕሮቶን መፍሰስ፣ የATP ትውልድ፣ SRC እና BHI) ቀርቧል። ሴሎች A እና B በቅደም ተከተል ለ24 ሰዓታት በ10 μM፣ 100 μM እና 1 mM IPA ተቀላቅለዋል። ሴሎች C እና D በቅደም ተከተል በTGF-β1 (5 ng/ml) እና 1 mM IPA በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ ለ24 ሰዓታት ተቀላቅለዋል። ሁሉም መለኪያዎች በCyQuant ኪት በመጠቀም ወደ ዲኤንኤ ይዘት መደበኛ ተደርገዋል። BHI፡ ባዮኢነርጂቲክ የጤና መረጃ ጠቋሚ፤ SRC፡ የመተንፈሻ ክምችት አቅም፤ OCR፡ የኦክስጅን ፍጆታ መጠን። መረጃው እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት (SD)፣ n = 5 ገለልተኛ ሙከራዎች ቀርቧል። የስታቲስቲክስ ንፅፅሮች የተከናወኑት በአንድ አቅጣጫ ANOVA እና የቦንፌሮኒ ድህረ ሆክ ሙከራ በመጠቀም ነው። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ እና ***p < 0.001
IPA በ TGF-β1-activated LX-2 ሴሎች ባዮኢነርጂቲክ መገለጫ ላይ ስላለው ተጽእኖ የበለጠ ሰፊ ግንዛቤ ለማግኘት፣ በ OCR የሚቶኮንድሪያል ኦክሲዳቲቭ ፎስፈረሌሽን ተንትነናል (ምስል 3C፣D)። ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት የ TGF-β1 ሕክምና ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነጻጸር ከፍተኛውን የመተንፈስ፣ የመተንፈሻ ክምችት አቅም (SRC) እና BHIን ሊቀንስ ይችላል። በተጨማሪም፣ የተቀላቀለው ሕክምና መሰረታዊ የመተንፈስ፣ የፕሮቶን መፍሰስ እና የ ATP ምርትን ቀንሷል፣ ነገር ግን SRC እና BHI በ TGF-β1 ከታከሙት በእጅጉ ከፍ ያሉ ነበሩ (ምስል 3C፣D)።
በተጨማሪም በሲሆርስ ሶፍትዌር የቀረበውን "የሴሉላር ኢነርጂ ፊኖታይፕ ምርመራ" አድርገናል (ተጨማሪ ምስል 4A–D)። በተጨማሪ ምስል 3B ላይ እንደሚታየው፣ ሁለቱም OCR እና ECAR የሜታቦሊክ እምቅ አቅም ከTGF-β1 ህክምና በኋላ ቀንሰዋል፣ ሆኖም ግን፣ ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነጻጸር በጥምረት እና በIPA ህክምና ቡድኖች ውስጥ ምንም ልዩነት አልታየም። በተጨማሪም፣ ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነጻጸር ከተቀናጀ እና ከIPA ህክምና በኋላ የOCR መሰረታዊ እና የጭንቀት ደረጃዎች ቀንሰዋል (ተጨማሪ ምስል 4C)። የሚገርመው ነገር፣ ከTGF-β1 ህክምና ጋር ሲነጻጸር በECAR መሰረታዊ እና የጭንቀት ደረጃዎች ላይ ምንም ለውጥ ያልታየበት በጥምረት ህክምና ተመሳሳይ ንድፍ ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 4C)። በHSCዎች ውስጥ፣ በማይቶኮንድሪያል ኦክሲዴቲቭ ፎስፈረሌሽን መቀነስ እና ለTGF-β1 ህክምና ከተጋለጡ በኋላ SCR እና BHIን ወደነበረበት ለመመለስ ያለው ጥምረት ህክምና የሜታቦሊክ አቅምን (OCR እና ECAR) አልቀየሩም። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሲጣመሩ፣ አይፒኤ በኤችኤስሲዎች ውስጥ ባዮኢነርጂቲክስን ሊቀንስ እንደሚችል ያመለክታሉ፣ ይህም አይፒኤ የኤችኤስሲ ፊኖታይፕን ወደ እንቅስቃሴ-አልባነት የሚቀይር ዝቅተኛ የኢነርጂ መገለጫ ሊያስከትል እንደሚችል ይጠቁማል (ተጨማሪ ምስል 4D)።
የአይፒኤ (IPA) በማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ የሚመረመረው በማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ እና የኔትወርክ ግንኙነቶች ባለ ሶስት አቅጣጫዊ መለኪያ እንዲሁም የኤምቲአር ቀለም (ምስል 4 እና ተጨማሪ ምስል 5) በመጠቀም ነው። ምስል 4 ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር የቲጂኤፍ-β1 ሕክምና አማካይ የገጽታ ስፋት፣ የቅርንጫፍ ቁጥር፣ የጠቅላላ የቅርንጫፍ ርዝመት እና የቅርንጫፍ መጋጠሚያ ቁጥርን (ምስል 4A እና B) እንደቀነሰ እና የማይቶኮንድሪያን ድርሻ ከክብ ወደ መካከለኛ ሞርፎሎጂ እንደለወጠው ያሳያል (ምስል 4C)። የአይፒኤ ሕክምና ብቻ አማካይ የማይቶኮንድሪያል መጠንን ቀንሷል እና የማይቶኮንድሪያን ድርሻ ከክብ ወደ መካከለኛ ሞርፎሎጂ ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነጻጸር ቀይሯል (ምስል 4A)። በተቃራኒው፣ በሚቶኮንድሪያል ሽፋኑ እምቅ ጥገኛ MTR (ምስል 4A እና E) የተገመገመው ሉላዊነት፣ አማካይ የቅርንጫፍ ርዝመት እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ሳይለወጡ ቀርተዋል እና እነዚህ መለኪያዎች በቡድኖች መካከል አልተለያዩም። አንድ ላይ ሲወሰዱ፣ እነዚህ ውጤቶች የቲጂኤፍ-β1 እና የአይፒኤ ሕክምና በህይወት ባሉ LX-2 ሴሎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ቅርፅ እና መጠን እንዲሁም የኔትወርክ ውስብስብነትን የሚያስተካክሉ ይመስላሉ።
IPA በLX-2 ሴሎች ውስጥ የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ እና የማይቶኮንድሪያል ዲኤንኤ ብዛትን ይለውጣል። ሀ. በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ ለ24 ሰዓታት በTGF-β1 (5 ng/ml) እና 1 mM IPA የታቀፉ የቀጥታ LX-2 ሴሎች ተወካይ ኮንፎካል ምስሎች በMitotracker™ Red CMXRos እና በDAPI የተቀባ ኒውክሊየስ የተቀባ ሰማያዊ ማይቶኮንድሪያል ኔትወርኮችን ያሳያል። ሁሉም መረጃዎች በቡድን ቢያንስ 15 ምስሎችን ይዘዋል። ለእያንዳንዱ የናሙና አይነት 10 የZ-stack ምስሎችን አግኝተናል። እያንዳንዱ የZ-axis ቅደም ተከተል 30 ቁርጥራጮችን ይዟል፣ እያንዳንዳቸው 9.86 μm ውፍረት አላቸው። የመለኪያ አሞሌ፡ 10 μm። ለ. በምስሉ ላይ ተለዋዋጭ ገደብን በመተግበር ተለይተው የሚታወቁ ተወካይ ነገሮች (ሚቶኮንድሪያ ብቻ)። በእያንዳንዱ ቡድን ውስጥ ላሉ ሁሉም ሴሎች የቁጥር ትንተና እና የማይቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂካል አውታረ መረብ ግንኙነቶች ንፅፅር ተከናውኗል። ሐ. የማይቶኮንድሪያል ቅርፅ ጥምርታዎች ድግግሞሽ። ወደ 0 የሚጠጉ እሴቶች ክብ ቅርጾችን ያመለክታሉ፣ እና ወደ 1 የሚጠጉ እሴቶች የፋይላሜንተስ ቅርጾችን ያመለክታሉ። የዲ ሚቶኮንድሪያል ዲኤንኤ (mtDNA) ይዘት በቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ውስጥ እንደተገለጸው ተወስኗል። የኢ ሚቶትራክር™ ቀይ CMXRos ትንተና በቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ውስጥ እንደተገለጸው በፍሰት ሳይቶሜትሪ (30,000 ክስተቶች) ተካሂዷል። መረጃው እንደ አማካይ ± SD፣ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎች ቀርቧል። የስታቲስቲክስ ንፅፅሮች የተከናወኑት በአንድ አቅጣጫ ANOVA እና የቦንፌሮኒ ድህረ-ሆክ ሙከራ በመጠቀም ነው። *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ከዚያም በLX-2 ሴሎች ውስጥ ያለውን የmtDNA ይዘት እንደ ማይቶኮንድሪያል ቁጥር አመልካች አድርገን ተንትነናል። ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር፣ የmtDNA ይዘት በTGF-β1-ታክሟል ቡድን ውስጥ ጨምሯል (ምስል 4D)። ከTGF-β1-ታክሟል ቡድን ጋር ሲነጻጸር፣ የmtDNA ይዘት በተቀናጀ የሕክምና ቡድን ውስጥ ቀንሷል (ምስል 4D)፣ ይህም IPA የmtDNA ይዘትን እና ምናልባትም የማይቶኮንድሪያል ቁጥርን እንዲሁም የማይቶኮንድሪያል መተንፈስን ሊቀንስ እንደሚችል ይጠቁማል (ምስል 3C)። ከዚህም በላይ፣ IPA በተቀናጀ ሕክምና ውስጥ የmtDNA ይዘትን የሚቀንስ ቢመስልም በMTR-መካከለኛ ሚቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ላይ ተጽዕኖ አላሳደረም (ምስል 4A-C)።
የአይፒኤ (IPA) ከLX-2 ሴሎች ውስጥ ካለው ፋይብሮሲስ፣ አፖፕቶሲስ፣ ህልውና እና ሚቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጋር ከተያያዙ የጂኖች mRNA ደረጃዎች ጋር ያለውን ግንኙነት መርምረናል (ምስል 5A–D)። ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር፣ የቲጂኤፍ-β1-ታክሞ የነበረው ቡድን እንደ ኮላጅን አይነት I α2 ሰንሰለት (COL1A2)፣ α-ለስላሳ የጡንቻ አክቲን (αSMA)፣ ማትሪክስ ሜታሎፕሮቲኔዝ 2 (MMP2)፣ የሜታሎፕሮቲኔዝ 1 ቲሹ አጋቾች (TIMP1) እና ዲናሚን 1-መሰል ጂን (DRP1) ያሉ የጂኖች አገላለጽ ጨምሯል፣ ይህም የፋይብሮሲስ መጨመርን እና ማግበርን ያሳያል። በተጨማሪም፣ ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር፣ የቲጂኤፍ-β1 ሕክምና የኑክሌር እርግዝና ኤክስ ተቀባይ (PXR)፣ ካስፓሴ 8 (CASP8)፣ MAPKPK3፣ የቢ-ሴል α አጋቾች፣ የኑክሌር ፋክተር κ የጂን ብርሃን ፔፕታይድ (NFκB1A) እና የኑክሌር ፋክተር κB kinase ንዑስ β (IKBKB) አጋቾችን (ምስል 5A–D) ቀንሷል። ከTGF-β1 ሕክምና ጋር ሲነጻጸር፣ ከTGF-β1 እና IPA ጋር የሚደረግ ጥምረት ሕክምና የCOL1A2 እና MMP2 አገላለጽን ቀንሷል፣ ነገር ግን የPXR፣ TIMP1፣ B-ሴል ሊምፎማ-2 (BCL-2)፣ CASP8፣ NFκB1A፣ NFκB1-β እና IKBKB mRNA መጠን ጨምሯል። የIPA ሕክምና የMMP2፣ Bcl-2-ተያያዥ ፕሮቲን X (BAX)፣ AKT1፣ የኦፕቲክ አለመትሮፊ ፕሮቲን 1 (OPA1) እና የማይቶኮንድሪያል ፊውዥን ፕሮቲን 2 (MFN2) አገላለጽን በእጅጉ ቀንሷል፣ የCASP8፣ NFκB1A፣ NFκB1B እና IKBKB አገላለጽ ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር ጨምሯል። ሆኖም፣ በካስፓሴ-3 (CASP3)፣ በአፖፕቶቲክ ፔፕቲዳዝ አክቲዳዝ ፋክተር 1 (APAF1)፣ በማይቶኮንድሪያል ፊውዥን ፕሮቲን 1 (MFN1) እና በፊስሽን ፕሮቲን 1 (FIS1) አገላለጽ ላይ ምንም ልዩነት አልተገኘም። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች የአይፒኤ ሕክምና ከፋይብሮሲስ፣ ከአፖፕቶሲስ፣ ከህልውና እና ከማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጋር የተያያዙ የጂኖችን አገላለጽ እንደሚቀይር ይጠቁማሉ። የእኛ መረጃ እንደሚያመለክተው የአይፒኤ ሕክምና በLX-2 ሴሎች ውስጥ ፋይብሮሲስን ይቀንሳል፤ በተመሳሳይ ጊዜ፣ ፊኖታይፕን ወደ እንቅስቃሴ ማገድ በማዞር ህልውናን ያነቃቃል።
IPA በLX-2 ሴሎች ውስጥ የፋይብሮብላስት፣ የአፖፕቶቲክ፣ የህያውነት እና የማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጂኖችን አገላለጽ ያስተካክላል። ሂስቶግራሞች LX-2 ሴሎች በTGF-β1 እና IPA ለ24 ሰዓታት በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ ከተቀሰቀሱ በኋላ ከኢንዶጅናል ቁጥጥር (RPLP0 ወይም PPIA) ጋር ሲነጻጸር የ mRNA አገላለጽን ያሳያሉ። A ፋይብሮብላስትን ያመለክታል፣ B የአፖፕቶቲክ ሴሎችን ያመለክታል፣ C የተረፉ ሴሎችን ያመለክታል፣ እና D ማይቶኮንድሪያል ዳይናሚክስ ጂን አገላለጽን ያሳያል። መረጃው እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት (SD)፣ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎች ቀርቧል። የስታቲስቲክስ ንጽጽሮች የተከናወኑት በአንድ አቅጣጫ ANOVA እና የቦንፌሮኒ ድህረ-ሆክ ሙከራ በመጠቀም ነው። *p < 0.05፤ **p < 0.01፤ ***p < 0.001፤ ****p < 0.0001
ከዚያም፣ በሴል መጠን (FSC-H) እና በሳይቶፕላዝሚክ ውስብስብነት (SSC-H) ላይ የተደረጉ ለውጦች በፍሰት ሳይቶሜትሪ (ምስል 6A፣B) ተገምግመዋል፣ እና ከIPA ሕክምና በኋላ በሴል ሞርፎሎጂ ላይ የተደረጉ ለውጦች በትራንስሚሽን ኤሌክትሮን ማይክሮስኮፒ (TEM) እና በደረጃ ንፅፅር ማይክሮስኮፒ (ተጨማሪ ምስል 6A-B) ተገምግመዋል። እንደተጠበቀው፣ በTGF-β1-በታከመ ቡድን ውስጥ ያሉ ሴሎች ከቁጥጥር ቡድን ጋር ሲነፃፀሩ በመጠን ጨምረዋል (ምስል 6A፣B)፣ ይህም የሂማቶፖይቲክ ስቴም ሴል (HSC) ማግበርን ያሳያል (ተጨማሪ ምስል 6A)። ሆኖም፣ ከTGF-β1-በታከመ ቡድን ጋር ሲነጻጸር፣ የሴል መጠን፣ የሳይቶፕላዝሚክ ውስብስብነት (ምስል 6A፣B) እና የER* ይዘት በTGF-β1 እና IPA ጥምረት ሕክምና ቡድን ውስጥ ቀንሷል (ተጨማሪ ምስል 6A)። በተጨማሪም፣ የአይፒኤ ሕክምና የሕዋስ መጠንን፣ የሳይቶፕላዝማ ውስብስብነትን (ምስል 6A፣B)፣ የP እና የER* ይዘትን ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር ቀንሷል (ተጨማሪ ምስል 6A)። በተጨማሪም፣ የአፖፕቶቲክ ሴሎች ይዘት ከቁጥጥር ቡድኑ ጋር ሲነጻጸር ከ24 ሰዓታት በኋላ የአይፒኤ ሕክምና ከተደረገ በኋላ ጨምሯል (ነጭ ቀስቶች፣ ተጨማሪ ምስል 6B)። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት 1 mM IPA የኤችኤስሲ አፖፕቶሲስን ሊያነቃቃ እና በቲጂኤፍ-β1 የሚፈጠሩ የሕዋስ ሞርፎሎጂካል መለኪያዎች ላይ ለውጦችን ሊቀለበስ ይችላል፣ በዚህም የሕዋስ መጠንን እና ውስብስብነትን ይቆጣጠራል፣ ይህም ከኤችኤስሲ እንቅስቃሴ መገደብ ጋር ሊዛመድ ይችላል።
IPA በLX-2 ሴሎች ውስጥ የሴል መጠን እና የሳይቶፕላዝማ ውስብስብነትን ይለውጣል። የፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና ተወካይ ምስሎች። ትንታኔው ለLX-2 ሴሎች የተወሰነ የጌት ስትራቴጂ ተጠቅሟል፡ የሴል ብዛትን ለመግለጽ SSC-A/FSC-A፣ ድርብ ክፍሎችን ለመለየት FSC-H/FSC-A እና SSC-H/FSC-H ለሴል መጠን እና ውስብስብነት ትንተና። ሴሎች በሴረም-ነጻ መካከለኛ ውስጥ ለ24 ሰዓታት በTGF-β1 (5 ng/ml) እና 1 mM IPA ታፍነዋል። የLX-2 ሴሎች ለሴል መጠን እና ለሳይቶፕላዝማ ውስብስብነት ትንተና ወደ ታችኛው የግራ ኳድራንት (SSC-H-/FSC-H-)፣ የላይኛው የግራ ኳድራንት (SSC-H+/FSC-H-)፣ የታችኛው የቀኝ ኳድራንት (SSC-H-/FSC-H+) እና የላይኛው የቀኝ ኳድራንት (SSC-H+/FSC-H+) ተከፋፍለዋል። ለ. የሕዋስ ሞርፎሎጂ በፍሰት ሳይቶሜትሪ FSC-H (ወደፊት መበታተን፣ የሕዋስ መጠን) እና SSC-H (የጎን መበታተን፣ የሳይቶፕላዝም ውስብስብነት) (30,000 ክስተቶች) በመጠቀም ተተነተነ። መረጃው እንደ አማካይ ± SD፣ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎች ቀርቧል። የስታቲስቲክስ ንፅፅሮች የተከናወኑት በአንድ አቅጣጫ ANOVA እና የቦንፌሮኒ ድህረ-ሆክ ሙከራ በመጠቀም ነው። *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 እና ****p < 0.0001
እንደ IPA ያሉ የአንጀት ሜታቦላይቶች በአንጀት ማይክሮባዮታ ውስጥ አዳዲስ ኢላማዎች ሊገኙ እንደሚችሉ የሚጠቁም የምርምር ርዕስ ሆኗል። ስለዚህ በሰዎች ላይ ከጉበት ፋይብሮሲስ ጋር የተገናኘነው አይፒኤ [15] ሜታቦላይት በእንስሳት ሞዴሎች ውስጥ ሊሆን የሚችል ፀረ-ፋይብሮቲክ ውህድ መሆኑ ትኩረት የሚስብ ነው [13፣ 14]። እዚህ፣ ለመጀመሪያ ጊዜ በሴረም IPA እና በዓለም አቀፍ የጉበት ትራንስክሪፕቶሚክስ እና በዲኤንኤ ሜቲሌሽን መካከል ያለውን ግንኙነት እናሳያለን፣ ይህም ዓይነት 2 የስኳር በሽታ (T2D) በሌላቸው ወፍራም ግለሰቦች ላይ አፖፕቶሲስን፣ ሚቶፋጊን እና ረጅም ዕድሜን እንዲሁም የጉበት ሆሞስታሲስን የሚቆጣጠር ሊሆን የሚችል እጩ ጂን AKT1 ያሳያል። የጥናታችን ሌላ አዲስ ነገር በ LX-2 ሴሎች ውስጥ የአይፒኤ ሕክምናን ከአፖፕቶሲስ፣ ከሴል ሞርፎሎጂ፣ ከማቶኮንድሪያል ባዮኢነርጂቲክስ እና ከዳይናሚክስ ጋር ያለውን መስተጋብር ማሳየታችን ሲሆን ይህም የኤችኤስሲን ፌኖታይፕ ወደ ኢንአክቲቪቲ የሚያዞር ዝቅተኛ የኢነርጂ ስፔክትረም መኖሩን ያሳያል፣ ይህም IPA የጉበት ፋይብሮሲስን ለማሻሻል እምቅ እጩ ያደርገዋል።
አፖፕቶሲስ፣ ሚቶፋጊ እና ረጅም ዕድሜ ከደም ዝውውር IPA ጋር በተያያዙ የጉበት ጂኖች ውስጥ የበለፀጉ በጣም አስፈላጊ ቀኖናዊ መንገዶች መሆናቸውን ደርሰንበታል። የማይቶኮንድሪያል የጥራት ቁጥጥር (MQC) ስርዓት መቋረጥ ወደ ሚቶኮንድሪያል መዛባት፣ ሚቶፋጊ እና አፖፕቶሲስ ሊያመራ ይችላል፣ በዚህም የMASLD መከሰትን ያበረታታል[33፣ 34]። ስለዚህ፣ IPA በጉበት ውስጥ በአፖፕቶሲስ፣ ሚቶፋጊ እና ረጅም ዕድሜ አማካኝነት የሕዋስ ተለዋዋጭነትን እና የማይቶኮንድሪያል ታማኝነትን በመጠበቅ ረገድ ሊሳተፍ እንደሚችል መገመት እንችላለን። መረጃዎቻችን እንደሚያሳዩት በሦስቱ ምርመራዎች ውስጥ ሁለት ጂኖች የተለመዱ ነበሩ፡ YKT6 እና AKT1። YKT6 በሴል ሽፋን ውህደት ሂደት ውስጥ የተሳተፈ SNARE ፕሮቲን ነው። በራስ-ሰር ፋጎሶም ላይ ከSTX17 እና SNAP29 ጋር የመነሻ ውስብስብ በመፍጠር በራስ-ሰር ፋጎሶም ውስጥ ሚና ይጫወታል፣ በዚህም የራስ-ሰር ፋጎሶሞች እና ሊሶሶሞች ውህደትን ያበረታታል[35]። በተጨማሪም፣ የYKT6 ተግባር መጥፋት ሚቶፋጂ ችግር ያስከትላል[36]፣ የYKT6 ቁጥጥር መጨመር ከሄፓቶሴሉላር ካርሲኖማ (HCC) እድገት ጋር የተቆራኘ ሲሆን የሕዋስ ህልውና መጨመርን ያሳያል[37]። በሌላ በኩል፣ AKT1 በጣም አስፈላጊው መስተጋብር ያለው ጂን ሲሆን በጉበት በሽታዎች ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል፣ ይህም የPI3K/AKT ምልክት መንገድ፣ የሕዋስ ዑደት፣ የሕዋስ ፍልሰት፣ እድገት፣ የትኩረት ማጣበቂያ፣ የማይቶኮንድሪያል ተግባር እና የኮላጅን ፈሳሽን ጨምሮ[38–40]። የነቃ የPI3K/AKT ምልክት መንገድ የሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎችን (HSCs) ሊያነቃ ይችላል፣ እነዚህም ከሴሎች ውጭ የሆነ ማትሪክስ (ECM) ለማምረት ኃላፊነት የሚወስዱት ሴሎች ናቸው፣ እና የቁጥጥር ህዋሱ የጉበት ፋይብሮሲስ መከሰት እና እድገት ላይ አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል[40]። በተጨማሪም፣ AKT p53-ጥገኛ የሕዋስ አፖፕቶሲስን የሚከለክሉ ቁልፍ የሕዋስ ህልውና ምክንያቶች አንዱ ነው፣ እና የAKT ማግበር ከጉበት ሴል አፖፕቶሲስ መከልከል ጋር ሊዛመድ ይችላል[41፣ 42]። የተገኙት ውጤቶች እንደሚያመለክቱት አይፒኤ በጉበት ሚቶኮንድሪያ-ተያያዥ አፖፕቶሲስ ውስጥ ሊሳተፍ ይችላል፣ ይህም ወደ አፖፕቶሲስ ወይም ህልውና መካከል የሄፓቶሳይት ውሳኔ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል። እነዚህ ውጤቶች በ AKT እና/ወይም በYKT6 እጩ ጂኖች ሊቆጣጠሩ ይችላሉ፣ እነዚህም ለጉበት ሆሞስታሲስ ወሳኝ ናቸው።
ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት 1 mM IPA በ LX-2 ሴሎች ውስጥ አፖፕቶሲስን እና የቲጂኤፍ-β1 ሕክምናን ሳይጨምር የ mitochondrial መተንፈስን አስከትሏል። አፖፕቶሲስ ለፋይብሮሲስ መፍትሄ እና ለሄማቶፖይቲክ ስቴም ሴል (HSC) ማግበር ዋና መንገድ መሆኑ ልብ ሊባል የሚገባው ነው፣ እንዲሁም የጉበት ፋይብሮሲስ በተገላቢጦሽ ፊዚዮሎጂያዊ ምላሽ ውስጥ ቁልፍ ክስተት ነው [4፣ 43]። ከዚህም በላይ፣ ከተጣመረ ህክምና በኋላ በ LX-2 ሴሎች ውስጥ የ BHI መልሶ ማቋቋም በማይቶኮንድሪያል ባዮኢነርጂቲክስ ቁጥጥር ውስጥ የ IPA እምቅ ሚና ላይ አዲስ ግንዛቤዎችን ሰጥቷል። በእረፍት እና እንቅስቃሴ-አልባ ሁኔታዎች ውስጥ፣ የሂማቶፖይቲክ ሴሎች በተለምዶ ATP ለማምረት እና ዝቅተኛ የሜታቦሊክ እንቅስቃሴ ለማድረግ ሚቶኮንድሪያል ኦክሳይድ ፎስፈረስሌሽን ይጠቀማሉ። በሌላ በኩል፣ የ HSC ማግበር ወደ ግላይኮሊቲክ ሁኔታ ለመግባት የሚጠይቀውን የኃይል ፍላጎት ለማካካስ የማይቶኮንድሪያል መተንፈስን እና ባዮሲንተሲስን ያሻሽላል [44]። IPA የሜታቦሊክ አቅምን እና ECARን አለመነካቱ የግሉኮሊቲክ መንገድ ብዙም ቅድሚያ የሚሰጠው እንዳልሆነ ያሳያል። በተመሳሳይ፣ ሌላ ጥናት እንዳመለከተው 1 mM IPA በካርዲዮሚዮሳይቶች፣ በሰው ሄፓቶሳይት ሴል መስመር (Huh7) እና በሰው እምብርት ደም ስር ኢንዶቴሊየል ሴሎች (HUVEC) ውስጥ የማይቶኮንድሪያል የመተንፈሻ ሰንሰለት እንቅስቃሴን ማስተካከል ችሏል፤ ሆኖም ግን፣ IPA በካርዲዮሚዮሳይቶች ውስጥ በግላይኮሊሲስ ላይ ምንም አይነት ተጽእኖ አልተገኘም፣ ይህም IPA የሌሎች የሴል ዓይነቶችን ባዮኢነርጂቲክስ ሊጎዳ እንደሚችል ይጠቁማል [45]። ስለዚህ፣ 1 mM IPA እንደ መለስተኛ የኬሚካል ማፍረሻ ሆኖ ሊያገለግል እንደሚችል እንገምታለን፣ ምክንያቱም የ mtDNA መጠን ሳይቀይር የፋይብሮጂኒክ ጂን አገላለጽን፣ የሴል ሞርፎሎጂን እና የማይቶኮንድሪያል ባዮኢነርጂቲክስን በእጅጉ ሊቀንስ ይችላል [46]። ሚቶኮንድሪያል መክፈቻዎች በባህል ምክንያት የሚመጣ ፋይብሮሲስን እና የኤችኤስሲ ማግበርን ሊከላከሉ ይችላሉ [47] እና እንደ መክፈቻ ፕሮቲኖች (UCP) ወይም አዴኒን ኑክሊዮታይድ ትራንስሎኬዝ (ANT) ባሉ የተወሰኑ ፕሮቲኖች የሚተዳደሩ ወይም የሚመነጩትን የማይቶኮንድሪያል ATP ምርትን ሊቀንሱ ይችላሉ። በሴል አይነት ላይ በመመስረት፣ ይህ ክስተት ሴሎችን ከአፖፕቶሲስ ሊከላከል እና/ወይም አፖፕቶሲስን ሊያበረታታ ይችላል [46]። ይሁን እንጂ፣ የሂማቶፖይቲክ ስቴም ሴል ኢንአክቲቭ ውስጥ እንደ ሚቶኮንድሪያል ዊንተር ...
ከዚያም በሚቶኮንድሪያል መተንፈስ ላይ የተደረጉ ለውጦች በህይወት ባሉ LX-2 ሴሎች ውስጥ በሚቶኮንድሪያል ሞርፎሎጂ ውስጥ ይንጸባረቃሉ ወይ የሚለውን መርምረናል። የሚገርመው ነገር፣ የTGF-β1 ሕክምና የማይቶኮንድሪያል መጠንን ከክብ ወደ መካከለኛ ይለውጣል፣ ይህም የማይቶኮንድሪያል ቅርንጫፍ መቀነስ እና የDRP1 አገላለጽ መጨመር ሲሆን ይህም በማይቶኮንድሪያል ብልጭታ ውስጥ ቁልፍ ነገር ነው [48]። በተጨማሪም፣ የማይቶኮንድሪያል ብልሽት ከአጠቃላይ የኔትወርክ ውስብስብነት ጋር የተቆራኘ ነው፣ እና ከውህደት ወደ ብልሽት የሚደረግ ሽግግር ለሂማቶፖይቲክ ስቴም ሴል (HSC) ማግበር ወሳኝ ነው፣ የማይቶኮንድሪያል ብልሽት መከልከል ደግሞ ወደ HSC አፖፕቶሲስ ይመራል [49]። ስለዚህ፣ ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት የTGF-β1 ሕክምና ከቀነሱ ቅርንጫፎች ጋር በማይቶኮንድሪያል ኔትወርክ ውስብስብነት ላይ መቀነስ ሊያስከትል ይችላል፣ ይህም ከተነቃቁ የሂማቶፖይቲክ ስቴም ሴሎች (HSCs) ጋር በተያያዘው በማይቶኮንድሪያል ብልሽት ውስጥ የተለመደ ነው። በተጨማሪም፣ መረጃዎቻችን IPA የማይቶኮንድሪያል መጠንን ከክብ ወደ መካከለኛ ቅርፅ ሊለውጥ እንደሚችል እና በዚህም የ OPA1 እና MFN2 አገላለጽን ሊቀንስ እንደሚችል አሳይተዋል። ጥናቶች እንደሚያሳዩት የ OPA1 ቁጥጥር መቀነስ የማይቶኮንድሪያል ሽፋን አቅምን ሊቀንስ እና የሴል አፖፕቶሲስን ሊያስጀምር ይችላል [50]። ኤምኤፍኤን2 የማይቶኮንድሪያል ፊውዥን እና አፖፕቶሲስን በማስተባበር ይታወቃል[51]። የተገኙት ውጤቶች እንደሚያሳዩት የLX-2 ሴሎችን በTGF-β1 እና/ወይም IPA ማነሳሳት የማይቶኮንድሪያል ቅርፅንና መጠንን እንዲሁም የማግበር ሁኔታን እና የኔትወርክ ውስብስብነትን የሚያስተካክል ይመስላል።
ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት የTGFβ-1 እና IPA ጥምረት ሕክምና በአፖፕቶሲስ በሚሸሹ ሴሎች ውስጥ የፋይብሮሲስ፣ የአፖፕቶሲስ እና ከህልውና ጋር የተያያዙ ጂኖችን mRNA አገላለጽ በመቆጣጠር mtDNA እና የሕዋስ ሞርፎሎጂ መለኪያዎችን ሊቀንስ ይችላል። በእርግጥም፣ IPA የAKT1 እና እንደ COL1A2 እና MMP2 ያሉ አስፈላጊ የፋይብሮሲስ ጂኖችን mRNA አገላለጽ ደረጃ ቀንሷል፣ ነገር ግን ከአፖፕቶሲስ ጋር የተያያዘውን የCASP8 አገላለጽ ደረጃ ጨምሯል። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት የIPA ሕክምና ከተደረገ በኋላ የBAX አገላለጽ ቀንሷል እና የTIMP1 ቤተሰብ ንዑስ ክፍሎች፣ BCL-2 እና NF-κB mRNA አገላለጽ ጨምሯል፣ ይህም IPA አፖፕቶሲስን የሚያመልጡ በሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎች (HSCs) ውስጥ የመዳን ምልክቶችን ሊያነቃቃ እንደሚችል ይጠቁማል። እነዚህ ሞለኪውሎች በተነቃቁ የሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎች ውስጥ እንደ ፕሮ-ሰርቪቫል ምልክቶች ሆነው ሊያገለግሉ ይችላሉ፣ ይህም ከፀረ-አፖፕቶቲክ ፕሮቲኖች (እንደ Bcl-2 ያሉ) መጨመር፣ የፕሮ-አፖፕቶቲክ BAX አገላለጽ መቀነስ እና በTIMP እና NF-κB መካከል ውስብስብ መስተጋብር ጋር ሊዛመድ ይችላል [5፣ 7]። IPA በPXR በኩል ተፅዕኖ ያሳድራል፣ እና ከTGF-β1 እና IPA ጋር ያለው ጥምረት ሕክምና የPXR mRNA አገላለጽ ደረጃዎችን እንደጨመረ ደርሰንበታል፣ ይህም የHSC ማግበርን መገደብን ያሳያል። የነቃ የPXR ምልክት በቪቮ እና በብልቃጥ ውስጥ የHSC ማግበርን እንደሚገታ ይታወቃል [52፣ 53]። ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት IPA አፖፕቶሲስን በማስፋፋት፣ ፋይብሮሲስን እና ማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝምን በመቀነስ እና የተነቃ የHSC phenotypeን ወደ ያልተነቃ የHSC phenotype የሚቀይሩ የተለመዱ ሂደቶችን በማሻሻል በተነቃ የHSC ን ማጽዳት ውስጥ ሊሳተፍ ይችላል። የIPA በአፖፕቶሲስ ውስጥ ሊኖር የሚችል ዘዴ እና ሚና ሌላው ሊሆን የሚችል ማብራሪያ በዋነኛነት በማይቶፋጂ (ውስጣዊ መንገድ) እና በውጫዊ የTNF ምልክት ማድረጊያ መንገድ (ሠንጠረዥ 1) በኩል መያዙ ነው፣ ይህም በቀጥታ ከNF-κB የመዳን ምልክት ማድረጊያ መንገድ ጋር የተገናኘ ነው (ተጨማሪ ምስል 7)። የሚገርመው ነገር፣ ከአይፒኤ ጋር የተያያዙ የበለጸጉ ጂኖች በአፖፕቶቲክ መንገድ [54] ውስጥ ፕሮ-አፖፕቶቲክ እና ፕሮ-አፕቶቪቭ ምልክቶችን ማስነሳት ችለዋል፣ ይህም አይፒኤ ከእነዚህ ጂኖች ጋር በመገናኘት የአፖፕቶቲክ መንገድን ወይም ህልውናን ሊያመጣ እንደሚችል ይጠቁማል። ሆኖም፣ አይፒኤ በኤችኤስሲ ማግበር እና በሜካኒካል መንገዶቹ ወቅት አፖፕቶሲስን ወይም ህልውናን እንዴት እንደሚያመጣ ግልጽ አይደለም።
IPA ከአመጋገብ ትራይፕቶፋን የሚመነጨው ማይክሮባዮታ በአንጀት ማይክሮባዮታ በኩል ከሚገኝ የምግብ ትራይፕቶፋን የሚፈጠር ማይክሮባላይት ሜታቦላይት ነው። ጥናቶች እንደሚያሳዩት በአንጀት አካባቢ ውስጥ ፀረ-ብግነት፣ ፀረ-ኦክሲዳንት እና ኤፒጄኔቲክ የቁጥጥር ባህሪያት አሉት።[55] ጥናቶች እንደሚያሳዩት IPA የአንጀት መከላከያ ተግባርን ማስተካከል እና የኦክሳይድ ውጥረትን መቀነስ ይችላል፣ ይህም ለአካባቢያዊ የፊዚዮሎጂካል ተፅእኖዎቹ አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል።[56] እንደ እውነቱ ከሆነ፣ IPA በደም ዝውውር በኩል ወደ ኢላማ አካላት ይጓጓዛል፣ እና IPA ከትራይፕቶፋን፣ ሴሮቶኒን እና ኢንዶል ተዋጽኦዎች ጋር ተመሳሳይ የሆነ ዋና የሜታቦላይት መዋቅር ስለሚጋራ፣ IPA የሜታቦሊክ እርምጃዎችን ይወስዳል፣ ይህም ተወዳዳሪ የሜታቦሊክ እጣ ፈንታዎችን ያስከትላል።[52] IPA በኢንዛይሞች ወይም በተቀባዮች ላይ ለማሰር ከትራይፕቶፋን የተገኙ ሜታቦላይቶች ጋር ሊወዳደር ይችላል፣ ይህም መደበኛ የሜታቦሊክ መንገዶችን ሊያስተጓጉል ይችላል። ይህ የሕክምና መስኮቱን በተሻለ ለመረዳት በፋርማኮኪኔቲክስ እና በፋርማኮዳይናሚክስ ላይ ተጨማሪ ጥናቶችን አስፈላጊነት ያጎላል።[57] ይህ በሄማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎች (HSCs) ውስጥም ሊከሰት እንደሚችል መታየት የለበትም።
ጥናታችን የተወሰኑ ገደቦች እንዳሉት እንገነዘባለን። ከአይፒኤ ጋር የተያያዙ ግንኙነቶችን በተለይም ለመመርመር፣ የዓይነት 2 የስኳር በሽታ (T2DM) ያለባቸውን ታካሚዎች አግልለናል። ይህ የግኝቶቻችንን ሰፊ ተግባራዊነት ለዓይነት 2 የስኳር በሽታ እና ለከፍተኛ የጉበት በሽታ ላለባቸው ታካሚዎች እንደሚገድብ እንገነዘባለን። በሰው ሴረም ውስጥ ያለው የአይፒኤ ፊዚዮሎጂካል ክምችት 1-10 μM [11፣ 20] ቢሆንም፣ የ1 mM IPA ክምችት የተመረጠው በከፍተኛ መርዛማ ያልሆነ ክምችት [15] እና ከፍተኛውን የአፖፕቶሲስ መጠን ላይ በመመስረት ሲሆን ይህም በኒውክሮቲክ ሴል ህዝብ መቶኛ ላይ ምንም ልዩነት የለውም። ምንም እንኳን የአይፒኤ ሱፕራፊዚዮሎጂካል ደረጃዎች በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ ቢውሉም፣ በአሁኑ ጊዜ ስለ አይፒኤ ውጤታማ መጠን ምንም መግባባት የለም [52]። ውጤቶቻችን ጉልህ ቢሆኑም፣ የአይፒኤ ሰፊ የሜታቦሊክ እጣ ፈንታ ንቁ የምርምር መስክ ሆኖ ቀጥሏል። ከዚህም በላይ፣ በሴረም IPA ደረጃዎች እና በጉበት ግልባጮች የዲኤንኤ ሜቲሌሽን መካከል ስላለው ግንኙነት ያገኘናቸው ግኝቶች የተገኙት ከሂማቶፖይቲክ ግንድ ሴሎች (HSCs) ብቻ ሳይሆን ከጉበት ሕብረ ሕዋሳትም ጭምር ነው። ቀደም ሲል ከትራንስክሪፕቶሜ ትንተና የተገኙትን ግኝቶች መሠረት በማድረግ የሰው LX-2 ሴሎችን ለመጠቀም መርጠናል፤ ይህም IPA ከሄማቶፖይቲክ ስቴም ሴል (HSC) ማግበር ጋር የተያያዘ ነው [15]፣ እና HSCዎች በጉበት ፋይብሮሲስ እድገት ውስጥ የተሳተፉ ዋና ዋና ሴሎች ናቸው። ጉበት ከብዙ የሴል ዓይነቶች የተዋቀረ ነው፣ ስለዚህ እንደ ሄፓቶሳይት-ኤችኤስሲ-የበሽታ መከላከያ ሴል የጋራ ባህል ስርዓት ያሉ ሌሎች የሴል ሞዴሎች ከካስፔዝ ማግበር እና የዲኤንኤ መከፋፈል ጋር ተጣምረው እንዲሁም የፕሮቲን ደረጃን ጨምሮ የተግባር ዘዴ የአይፒኤ ሚና እና ከሌሎች የጉበት ሴል ዓይነቶች ጋር ያለውን መስተጋብር ለማጥናት ግምት ውስጥ መግባት አለባቸው።