በሴክሬተሪ መንገድ ውስጥ የፕሮቲን መደርደር የሴል ክፍፍልን እና ሆሞስታሲስን ለመጠበቅ አስፈላጊ ነው። ከሼል-መካከለኛ መደርደር በተጨማሪ፣ በሴክሬተሪ ትራንስፖርት ሂደት ውስጥ የሊፒድስ ሚና በኪኔሲን መደርደር ሂደት ውስጥ እስካሁን መልስ ያልተሰጠበት ረጅም ጊዜ የቆየ መሠረታዊ ጥያቄ ነው። እዚህ፣ አዲስ የተዋሃዱ ግላይስኮሲልፎስፋቲዲሊኖሲቶል-ኢንሞቢላይዝድ ፕሮቲኖች በጣም ረጅም የሴራሚድ ሊፒድ ክፍሎች ያላቸው ልዩ ኢንዶፕላዝሞች ውስጥ ተሰባስበው ወደ ልዩ ኢንዶፕላዝሞች እንደሚመደቡ ለማረጋገጥ በቪቮ ውስጥ 3D በአንድ ጊዜ ባለብዙ ቀለም ከፍተኛ ጥራት ያለው የእውነተኛ ጊዜ ምስል እናከናውናለን። የተጣራ መውጫ ቦታ፣ ይህም ከትራንስሜምብራን ፕሮቲኖች ከሚጠቀሙበት የተለየ ነው። በተጨማሪም፣ በኢንዶፕላስሚክ ሬቲኩለም ሽፋን ውስጥ ያለው የሴራሚድ ሰንሰለት ርዝመት ለዚህ የመደርደር ምርጫ ወሳኝ መሆኑን እናሳያለን። ጥናታችን የፕሮቲን ጭነቶችን በሊፒድ ሰንሰለት ርዝመት ላይ ተመስርተው በሴክሬተሪ መንገድ ውስጥ በተመረጡ የኤክስፖርት ቦታዎች ለመመደብ የመጀመሪያውን ቀጥተኛ በቪቮ ማስረጃ ያቀርባል።
በዩካርዮቲክ ሴሎች ውስጥ፣ በኢንዶፕላስሚክ ሬቲኩለም (ER) ውስጥ የተዋሃዱ ፕሮቲኖች ከዚያም ወደ ተገቢው ሴሉላር መድረሻቸው ለማድረስ በሚስጥር መንገድ በኩል በሚጓጓዝበት ጊዜ ይደረደራሉ (1)። ከሽፋን-መካከለኛ ድርደራ በተጨማሪ፣ የተወሰኑ ሊፒዶች የተወሰኑ ፕሮቲኖችን (2-5) ወደተወሰኑ የሜምብሬን ጎራዎች በመከፋፈል እንደ ምርጫ መውጫ ነጥቦች ሊያገለግሉ እንደሚችሉ ለረጅም ጊዜ ይገመታል። ሆኖም፣ ይህንን ሊሆን የሚችል የሊፒድ-ተኮር ዘዴን የሚያረጋግጥ ቀጥተኛ በቪቮ ማስረጃ እጥረት አሁንም አለ። ይህንን መሰረታዊ ችግር ለመፍታት፣ እንዴት ግላይስኮሲልፎስፋቲዲሊኖሲቶል (GPI) መልሕቅ ያላቸው ፕሮቲኖች (GPI-APs) ከER በተለየ መንገድ እንደሚላኩ እርሾ ውስጥ አጥንተናል። GPI-APs የተለያዩ ከሊፒድ ጋር የተገናኙ የሴል ወለል ፕሮቲኖች ናቸው (6፣ 7)። GPI-AP በግሉኮሊፒድ ክፍል (GPI መልሕቅ) በኩል ከፕላዝማ ሽፋን ውጫዊ በራሪ ወረቀቶች ጋር የተያያዘ የሚወጣ ፕሮቲን ነው። የጂፒአይ መልሕቆችን በER lumen ውስጥ እንደ ወግ አጥባቂ የድህረ-ትርጉም ማሻሻያዎች አድርገው ይቀበላሉ (8)። ከተያያዘ በኋላ፣ GPI-AP ከ ER ወደ ፕላዝማ ሽፋን በጎልጂ መሳሪያ (5, 9) በኩል ያልፋል። የጂፒአይ መልሕቆች መኖር GPI-AP ከሚወጡት ትራንስሜምብራን ፕሮቲኖች (ሌሎች የፕላዝማ ሽፋን ፕሮቲኖችን ጨምሮ) በተናጠል በሚስጥር መንገድ (5, 9, 10) እንዲጓጓዝ ያደርገዋል። በእርሾ ሴሎች ውስጥ፣ GPI-APዎች ከሌሎች በኢንዶፕላስሚክ ሬቲኩለም ውስጥ ከሚለቀቁ ፕሮቲኖች የተለዩ ሲሆኑ ከዚያም በኮት ፕሮቲን ውስብስብ II (COPI) (6, 7) በተጠቀለሉ ልዩ ቬሲክልዎች ውስጥ የታሸጉ ናቸው። በ ER ኤክስፖርት ሂደት ውስጥ የዚህ የምደባ ሂደት መወሰኛዎች ግልጽ አይደሉም፣ ነገር ግን ይህ ዘዴ ቅባቶችን ሊፈልግ እንደሚችል ይገመታል፣ በተለይም የጂፒአይ መልሕቅ የሊፒድ ክፍል መዋቅራዊ እድሳት (5, 8)። በእርሾ ውስጥ፣ የጂፒአይ ሊፕቲድ እድሳት GPI ከተያያዘ በኋላ ወዲያውኑ ይጀምራል፣ እና በብዙ አጋጣሚዎች፣ ሴራሚድ ከ26-ካርቦን ረጅም ሰንሰለት የተሟሉ የሰባ አሲድ (C26:0) ጋር እንዲጣበቅ ያደርጋል (11, 12)። C26 ሴራሚድ እስካሁን ድረስ በእርሾ ሴሎች የሚመረት ዋናው ሴራሚድ ነው። በER ውስጥ የተዋሃደ ሲሆን አብዛኛው ወደ ጎልጂ መሳሪያ በ COPII vesicles (13) በኩል ይላካል። የ GPI-AP ER ኤክስፖርት በተለይ ቀጣይነት ያለው የሴራሚድ ውህደትን ይፈልጋል (14፣ 15)፣ እና በተራው ደግሞ በጎልጂ መሳሪያ ውስጥ ሴራሚድ ወደ ኢኖሲቶል ፎስፌት ሴራሚድ (IPC) መለወጥ በ GPI መልሕቅ ውህደት ላይ የተመሰረተ ነው (16)። ከአርቲፊሻል ሽፋኖች ጋር የተደረጉ የባዮፊዚካል ጥናቶች እንደሚያሳዩት በጣም ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚዶች ልዩ የሆኑ አካላዊ ባህሪያት ያላቸውን የተደረደሩ ጎራዎችን ለመፍጠር ሊዋሃዱ ይችላሉ (17፣ 18)። እነዚህ መረጃዎች C26 ሴራሚድ እና GPI-AP ከ C26 ሴራሚድ ጋር በአንፃራዊነት በተዛባ የ ER ሽፋን ሊፒድ አካባቢ ውስጥ ወደ ሥርዓታማ ክልሎች ወይም ክልሎች እንዲዋሃዱ ወደ መላምት ይመራሉ። በዋናነት አጭር እና ያልተሟሉ ግሊሰሮሊፒዶችን (C16:1 እና C18:1) ያቀፈ ነው (19፣ 20)። እነዚህ ክልሎች በተመረጡ የER መውጫ ቦታዎች (ERES) ላይ ያተኩራሉ፣ ሴራሚድ እና ሴራሚድ ላይ የተመሰረተ GPI-AP በተመሳሳይ የተወሰነው COPII vesicle (5) ውስጥ ወደ ጎልጊ ሊጓጓዙ ይችላሉ።
በዚህ ጥናት፣ ይህንን በሊፒድ ላይ የተመሠረተ ዘዴ በቀጥታ በሱፐር-ሪፎርም ኮንፎካል ሪል-ታይም ኢሜጂንግ ማይክሮስኮፒ (SCLIM) በመጠቀም ሞክረነዋል፣ ይህም ዘመናዊ ማይክሮስኮፒ ቴክኒክ ሲሆን በተመሳሳይ ጊዜ ፍሎረሰንት የተለጠፉ ፕሮቲኖችን ማየት ይችላል። ባለ ሶስት ቀለም እና ባለ ሶስት አቅጣጫዊ (3D) ምስሎች በህያው ሴሎች ውስጥ እጅግ በጣም ከፍተኛ ጥራት እና ፍጥነት አላቸው (21፣ 22)።
በመጀመሪያ የSCLIM ቴክኖሎጂን ተግባራዊ ያደረግነው ከ ER ውስጥ ከወጡ በኋላ ከ C26 ሴራሚድ ቡድን ጋር ያለው መደበኛ GPI-AP ከትራንስሜምብራን ከሚወጡ ፕሮቲኖች እንዴት እንደተጣራ የበለጠ ለመግለጽ ነው። የ ER ምደባን ለመፈተሽ፣ አዲስ የተዋሃዱ ጭነት ወደ ERES in vivo (7፣ 23) በቀጥታ ማየት የሚችል የጄኔቲክ ስርዓት ተጠቅመናል። እንደ ጭነት፣ በአረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (GFP) እና በትራንስሜምብራን የሚወጣው ፕሮቲን ሚድ2 በተሰየመ አቅራቢያ-ኢንፍራሬድ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (iRFP) ምልክት የተደረገበት C26 ሴራሚድ ላይ የተመሠረተ GPI-AP Gas1 ን መርጠናል፣ ሁለቱም የፕላዝማ ሽፋንን (24-26) ያነጣጠሩ ናቸው። በsec31-1 የሙቀት-ስሜታዊ ሚውቴሽን ውስጥ፣ እነዚህ ሁለት ጭነቶች በጋላክቶስ-ኢንዱሲብል ፕሮሞተር እና በተዋሃደ ERES ምልክት ስር ይገለፃሉ። በከፍተኛ ሙቀት (37°C)፣ የsec31-1 ሚውቴሽን የCOPI ሽፋን ክፍል Sec31 ተግባርን ስለሚጎዳ፣ አዲስ የተዋሃዱ ጭነቶች በER ላይ ይከማቻሉ (23)። ወደ ዝቅተኛ የሙቀት መጠን (24°ሴ) ከቀዘቀዙ በኋላ፣ የ sec31-1 ሚውቴሽን ሴሎች ከሴክሬተሪ አካባቢ ተመልሰዋል፣ እና የተከማቹት አዲስ ሰው ሰራሽ ጭነት ከ ER መላክ ጀምሯል። የ CLIM ምስላዊ እይታ እንደሚያሳየው አብዛኛዎቹ አዲስ የተቀናጁ Gas1-GFP እና Mid2-iRFP በ sec31-1 ሚውቴሽን ሴሎች ER ውስጥ በ37°ሴ ከተቀበሩ በኋላ እና ከዚያም በ24°ሴ ለ5 ደቂቃዎች ይለቀቃሉ (ምስል 1)። Mid2-iRFP በጠቅላላው የ ER ሽፋን ላይ ስለሚሰራጭ እና Gas1-GFP በተቋረጠው የ ER ሽፋን አካባቢ ስለሚከማች ስርጭታቸው ሙሉ በሙሉ የተለየ ነው (ምስል 1፣ A ወደ C እና Movie S1)። በተጨማሪም፣ በምስል 1D ላይ እንደሚታየው፣ Gas1-GFP ክላስተር Mid2-iRFP የለውም። እነዚህ ውጤቶች GPI-AP እና ትራንስሜምብራን ፕሮቲኖች ቀደም ብለው ወደተለያዩ የ ER ሽፋን ክልሎች እንደተከፋፈሉ ያመለክታሉ። የጋዝ1-ጂኤፍፒ ክላስተር ከ mCherry's COPII ሽፋን ፕሮቲን ሴክ 13 (ምስል 1፣ E እና F፣ እና ፊልም S1) (23) ጋር ከተሰየመ ልዩ ERES አጠገብ ነው።
የ sec31-1 ሴሎች በጋላክቶስ ምክንያት የሚፈጠሩ ፈሳሾችን ይገልጻሉ፣ ረጅም የአሲል ሰንሰለት (C26) ሴራሚድ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP፣ አረንጓዴ) እና የትራንስሜምብራን ፕሮቲን Mid2-iRFP (TMP፣ ሰማያዊ) እና ይህ ገንቢ የ ERES መለያ Sec13-mCherry (ERES፣ ማጀንታ) በ37°ሴ ለ30 ደቂቃዎች እንዲታቀብ ተደርጓል፣ ወደ 24°ሴ ተንቀሳቅሷል፣ እና ከ5 ደቂቃዎች በኋላ በ SCLIM ምስል ቀርቧል። (ከA እስከ C) የአንድ አውሮፕላን (A)፣ የ10 z-ክፍሎች (B) 2D ፕሮጀክሽን ምስል ወይም የ3D ሴል ንፍቀ ክበብ የጭነት እና የ ERES ማርከሮች (C) ምስል ተወካይ ወይም ነጠላ የ2D ምስል ያሳያል። የመለኪያ አሞሌ 1μm (A እና B)። የመለኪያ አሃዱ 0.551μm (C) ነው። Gas1-GFP በተለዩ የ ER ክልሎች ወይም ክላስተሮች ውስጥ ተገኝቷል፣ ሚድ2-iRFP ደግሞ በ ER ሽፋን (C) ውስጥ ተገኝቶ ተሰራጭቷል። (መ) ግራፉ በነጭ የቀስት መስመር (ግራ) በኩል ባለው የGas1-GFP ክላስተር ውስጥ ያለውን የGas1-GFP እና Mid2-iRFP አንጻራዊ የፍሎረሰንስ ጥንካሬ ያሳያል። AU፣ የዘፈቀደ አሃድ። (E እና F) እቃዎችን እና የERES ምልክትን የሚያጣምር የ3D ምስልን ይወክላሉ። የGas1-GFP ክላስተሮች በተወሰነው ERES አቅራቢያ ተገኝተዋል። የመለኪያ አሃዱ 0.551μm ነው። (F) ነጭው ጠንካራ ቀስት ከERES ጋር የተያያዘውን የGas1-GFP ክላስተር ያመለክታል። የመሃል እና የቀኝ ፓነሎች የተቀላቀለውን የተስፋፋ 3D ምስል እና የተመረጠውን Gas1-GFP ክላስተር የተሽከረከረ እይታ ያሳያሉ።
በጋዝ1-ጂኤፍፒ ክላስተር እና በተወሰነ ERES መካከል ያለው የጠበቀ የቦታ ግንኙነት Gas1-ጂኤፍፒ ወደ መራጭ ERES መግባት እንደሚችል ያሳያል፣ ይህም ከ ER ለመውጣት Mid2-iRFP ከሚጠቀምበት ምርጫ የተለየ ነው። ይህንን እድል ለመፍታት፣ ለአንድ ወይም ለሁለት እቃዎች ብቻ የ ERES ጥምርታን ለካነው (ምስል 2፣ A እስከ C)። አብዛኛዎቹ ERES (70%) አንድ የጭነት አይነት ብቻ እንደያዙ ደርሰንበታል። የምስል 2C የታችኛው ምስል Gas1-ጂኤፍፒ ብቻ (ምስል 1) ወይም Mid2-iRFP ብቻ (ምስል 2) ያላቸውን የ ERES ሁለት የተለመዱ ምሳሌዎችን ያሳያል። በተቃራኒው፣ በግምት 20% የሚሆነው ERES በተመሳሳይ አካባቢ የሚደራረቡ ሁለት የጭነት አይነቶችን ይይዛል። አንዳንድ ERES (10%) ሁለት የጭነት አይነቶችን እንደያዙ ተገኝቷል፣ ነገር ግን በግልጽ በተለያዩ አካባቢዎች ተለይተዋል። ስለዚህ፣ ይህ የስታቲስቲክስ ትንተና እንደሚያሳየው ER ከተላከ በኋላ GPI-AP Gas1-GFP እና ትራንስሜምብራን ጭነት Mid2-iRFP ወደተለያዩ ERES ይከፈላሉ (ምስል 2D)። ይህ የመደርደር ቅልጥፍና ከቀደመው ባዮኬሚካላዊ ትንተና (6) እና ሞርፎሎጂካል ውሳኔ (7) ጋር በጣም የሚስማማ ነው። እንዲሁም ወደ ERES (ምስል 2E እና ፊልም S2) የሚገባውን የተገለለ ጭነት ባህሪ ማየት እንችላለን። ምስል 2E የሚያሳየው የGas1-GFP (ፓነል 3) ወይም Mid2-iRFP (ፓነል 4) ትንሽ ክፍል ብቻ ከአንድ ጎን ወደ ERES እንደሚገባ እና በተለየ ቦታ ውስጥ እንደተገደበ ነው። የምስል 2E ፓነል 5 እንደሚያሳየው Gas1-GFP እና Mid2-iRFP አንዳንድ ጊዜ በተመሳሳይ ERES ውስጥ ይገኛሉ፣ ነገር ግን ከተለያዩ ጎኖች ይገባሉ እና የተለያዩ የ COPII ቬሲክልዎችን ሊወክሉ በሚችሉ የተለያዩ ክልሎች ውስጥ የተከማቹ ናቸው። እንዲሁም የC26 ሴራሚድ-ተኮር GPI-AP Gas1 እንደ መራጭ ERES መለየት እና ምደባ የተለየ መሆኑን አረጋግጠናል ምክንያቱም ሌላ ትራንስሜምብራን የሚወጣ ጭነት፣ GFP-መለያ የተደረገበት የፕላዝማ ሽፋን ፕሮቲን Axl2 (27)፣ ከ Mid2-iRFP ጋር ተመሳሳይ ባህሪ ያሳያል። (ስዕል S1 እና ፊልም S3)። አዲስ የተቀናበረው Axl2-GFP እንደ Mid2-iRFP (ምስል S1፣ A እና B) ባሉ የER ሽፋን በኩል ይሰራጫል፣ እና በአብዛኛዎቹ ERES (ምስል S1፣ B እስከ D) ውስጥ ከ Mid2-iRFP ጋር አብሮ አካባቢያዊ ሆኖ ይገኛል። በምስል 1 ላይ ያሉት ፓነሎች 1 እና 2። S1C ሁለት የትራንስሜምብራን ጭነት የሚደራረቡባቸውን ሁለት የተለመዱ የERES ምሳሌዎችን ያሳያል። በእነዚህ አጋጣሚዎች ሁለቱም እቃዎች አንድ ላይ ወደ ERES ይገባሉ (ምስል S1E፣ ፓነል 3 እና ፊልም S3)።
የጋላክቶስ ኢንዳሲቭ ፈሳሾችን፣ Gas1-GFP (GPI-AP፣ አረንጓዴ) እና Mid2-iRFP (TMP፣ ሰማያዊ) እና የERES መለያ Sec13-mCherry (ERES፣ ማጀንታ) በ37 ላይ ተቀምጠዋል በ°ሴ ለ30 ደቂቃዎች ከተቀቡ በኋላ፣ የፈሳሽ ማገጃውን ለመልቀቅ ወደ 24 °C ይንቀሳቀሱ እና ከ20 ደቂቃዎች በኋላ በSCLIM ምስል ይቅረጹ። (A እስከ C) የሚወክሉ 2D ፕሮጀክሽን ምስሎች (A፤ የልኬት አሞሌ፣ 1μm) ወይም የ3D ሴል ንፍቀ ክበብ ምስሎች (B እና C፤ የልኬት አሃድ፣ 0.456μm) እና በERES ምልክት የተደረገባቸው 10 z-ክፍሎች። በ(B) ውስጥ ያለው የታችኛው ፓነል እና በ(C) ውስጥ ያለው ፓነል በERES (ማጀንታ) [ጋዝ1-GFP (ግራጫ) እና Mid2-iRFP (ቀላል ሰማያዊ)] ውስጥ ያሉትን እቃዎች ብቻ ለማሳየት የተስተካከሉ ምስሎችን ያሳያሉ። (ሐ) ክፍት ቀስት፡ ERES አንድ የጭነት ቁራጭ ብቻ ይይዛል (ከ1 እስከ 4)። ግራጫ ቀስት፡ ERES የተነጠለ ጭነት (5) ይዟል። ነጭ ጠጣር ቀስት፡ አብሮ የሚገኝ ጭነት የያዘ ERES። ከዚህ በታች፡ የተመረጠው ነጠላ ERES Gas1-GFP (1) ወይም Mid2-iRFP (2) ብቻ ይይዛል። የመለኪያ አሞሌ፣ 100 nm። (መ) በ (ሐ) ውስጥ የተገለጸውን የፎቶማይክሮግራፍ መጠን። አንድ ጭነት (Gas1-GFP ወይም Mid2-iRFP) ብቻ የያዘው የERES አማካይ መቶኛ፣ የተነጠለ ጭነት እና ተደራራቢ ጭነት። በሦስት ገለልተኛ ሙከራዎች፣ n=432 በ54 ሴሎች ውስጥ። የስህተት አሞሌ = SD። ባለ ሁለት ጭራ ያልተጣመረ የt ሙከራ። *** P = 0.0002። (ሠ) በ (C) ምልክት የተደረገባቸው የተመረጡ የገለልተኛ ጭነት ERES 3D ምስል። ጋዝ1-GFP (አረንጓዴ) (3) ወይም Mid2-iRFP (ሰማያዊ) (4) ከአንድ በኩል ወደ ERES (ማጀንታ) ይገባል እና በ ERES ውስጥ ባለ ትንሽ ቦታ ብቻ የተገደበ ነው። አንዳንድ ጊዜ፣ ሁለቱም የጭነት ዓይነቶች ከአንድ ጎን ወደ ተመሳሳይ ERES (5) ይገባሉ እና በ ERES ውስጥ ወደተለየ ቦታ ብቻ ይወሰናሉ። የመለኪያ አሞሌ፣ 100 nm።
ቀጥሎም፣ በER ሽፋን ውስጥ ያለው ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚድ (C26) የጋዝ1ን የተወሰነ ክላስተር እና መደርደር ወደ መራጭ ERES እንደሚያመራ የሚገልጽ መላምት ሞክረናል። ለዚህም፣ የተሻሻለ የእርሾ ዝርያ GhLag1 ተጠቅመናል፣ በዚህም ውስጥ ሁለቱ ኢንዶጀንታል ሴራሚድ ሲንቴዝስ Lag1 እና Lac1 በGhLag1 (የጥጥ Lag1 ተመሳሳይነት ያለው) ተተኩ፣ በዚህም ምክንያት የሴል ሽፋን ያለው የሴራሚድ ዝርያ ከዱር አይነት ያነሰ የእርሾ ዝርያ አስገኝቷል (ምስል 3A) (28)። የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (MS) ትንተና እንደሚያሳየው በዱር አይነት ዝርያዎች ውስጥ 95% የሚሆነው አጠቃላይ ሴራሚድ በጣም ረጅም (C26) ሰንሰለት ሴራሚድ ሲሆን በGhLag1 ውስጥ ደግሞ 85% የሚሆነው ሴራሚድ በጣም ረጅም (C18 እና C16) ነው፣ ሴራሚድ 2% ብቻ በጣም ረጅም (C26) ሰንሰለት ሴራሚድ ነው። ምንም እንኳን C18 እና C16 ሴራሚዶች እስካሁን ድረስ በGhLag1 ሽፋን ውስጥ የተገኙት ዋና ዋና ሴራሚዶች ቢሆኑም፣ የMS ትንተና በGhLag1 ዝርያ ውስጥ የተገለጸው የGas1-GFP GPI መልህቅ C26 ሴራሚድን እንደያዘ አረጋግጧል፣ ይህም ከዱር ዓይነት ሊፒዶች ጋር ተመሳሳይ ነው። ጥራቱ ተመሳሳይ ነው (ምስል 3A) (26)። ስለዚህ፣ ይህ ማለት የሴራሚድ ማሻሻያ ኢንዛይም Cwh43 ለC26 ሴራሚድ በጣም መራጭ ነው ማለት ነው፣ በምስል 26 ላይ እንደሚታየው፣ በGhLag1 ዝርያ ውስጥ ካለው አነስተኛ መጠን ያለው C26 ሴራሚድ የጂፒአይ መልህቅን በተመረጠ ሁኔታ ያካትታል። S2 (29)። ያም ሆኖ፣ የGhLag1 የሴል ሽፋን በመሠረቱ C18-C16 ሴራሚድን ብቻ ​​ይይዛል፣ Gas1-GFP ደግሞ C26 ሴራሚድ አለው። ይህ እውነታ ይህንን ዝርያ በER ውስጥ ያለውን የአሲል ሰንሰለት የሽፋን ሴራሚድ ርዝመት ችግርን ለመፍታት ተስማሚ መሣሪያ ያደርገዋል። የክፍል እና የመደርደር ግምታዊ ሚና። ከዚያም፣ በመጀመሪያ በ GhLag1 ውስጥ በሴክ31-1 የሙቀት መጠን ስሜታዊ የሆነ የሚውቴሽን አሌል በመጠቀም በሴክ31-1 በተለምዷዊ የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ አማካኝነት የመከማቸት ችሎታን አጥንተናል፣ እዚያም ረጅም (C18-C16) ሰንሰለት ብቻ በER ሽፋን ሴራሚድ ውስጥ ይገኛል (ምስል 3)። በሴክ31-1 ውስጥ፣ አብዛኛው የ Gas1-GFP በክላስተሮች ውስጥ እንደተከማቸ፣ በሴክ31-1 GhLag1 ውስጥ ያለው Gas1-GFP ረጅም (C18-C16) ረጅም የሴራሚድ ER ሽፋን ያለው ሲሆን በዋናነት ያልተሰበሰበ እና በመላው የER ሽፋን ውስጥ ያልተሰራጨ መሆኑን አስተውለናል። ትክክለኛ ለመሆን፣ በC26 ሴራሚድ ላይ የተመሠረተ ክላስተር ከተወሰኑ ERES ጋር በቅርበት የተቆራኘ ስለሆነ (ምስል 1)፣ ይህ ሂደት የER ኤክስፖርት ፕሮቲን ዘዴን ተግባር ሊያካትት ይችል እንደሆነ ቀጥሎ መርምረናል። GPI-AP ለER ኤክስፖርት ልዩ የ COPII ስርዓት ይጠቀማል፣ ይህም በቴድ1 የጂፒአይ መልህቅ የግላይካን ክፍል መዋቅራዊ እድሳት (30፣ 31) በንቃት የሚተዳደር ነው። ከዚያም እንደገና የሚዋሃድ GPI-glycan በትራንስሜምብራን የጭነት ተቀባይ p24 ውስብስብነት የሚታወቅ ሲሆን፣ ይህ ደግሞ በዋናው የ COPII የጭነት ማያያዣ ንዑስ ክፍል ሴክ 24 የተወሰነ ኢሶፎርም የሆነውን Lst1ን በምርጫ የሚቀጥር ሲሆን፣ በ GPI-AP የበለፀገ COPII ቬሴሎች አስፈላጊ ናቸው (31-33)። ስለዚህ፣ የእነዚህን ነጠላ ፕሮቲኖች (p24 ውስብስብ አካል Emp24፣ GPI-glycan ሬሞዲንግ ኢንዛይም Ted1 እና የተወሰነው COPII ንዑስ ክፍል Lst1) ከ sec31-1 ሚውቴሽን ዝርያ ጋር በማጣመር ድርብ ሚውቴሽን ገንብተናል፣ እና አጠናናቸው። Gas1-cluster GFP መፍጠር ይቻላል? (ምስል 3)። በsec31-1emp24Δ እና sec31-1ted1Δ ውስጥ፣ Gas1-GFP በዋናነት ያልተሰበሰበ እና በER ሽፋን ውስጥ በሙሉ እንደሚሰራጭ አስተውለናል፣ ቀደም ሲል በsec31-1 GhLag1 ላይ እንደታየው፣ በsec31-1lst1Δ ውስጥ ደግሞ Gas1-GFP እንደ sec31-1። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት በER ሽፋን ውስጥ የC26 ሴራሚድ መኖር በተጨማሪ የGas1-GFP ክላስተር ከp24 ውስብስብ ጋር መያያዝ እንዳለበት እና የተለየ የLst1 ምልመላ እንደማያስፈልግ ነው። ከዚያም፣ በER ሽፋን ውስጥ ያለው የሴራሚድ ሰንሰለት ርዝመት የGas1-GFPን ከp24 ጋር ማያያዝን ሊቆጣጠር እንደሚችል ተመልክተናል። ሆኖም፣ በሽፋኑ ውስጥ የC18-C16 ሴራሚድ መኖር በp24 ውስብስብ (S3 እና S4፣ A እና B) የተገነቡትን GPI-glycans ወይም ከGPI-AP ጋር ማያያዝ እና GPI-AP መላክ ችሎታን እንደማይጎዳ ደርሰንበታል። የ COPII ንዑስ አይነት Lst1ን ይቅጠሩ (ምስል S4C)። ስለዚህ፣ የC26 ሴራሚድ-ጥገኛ ክላስተር ከተለያዩ የ ER ኤክስፖርት ፕሮቲን ዘዴዎች ጋር የፕሮቲን መስተጋብር አያስፈልገውም፣ ነገር ግን በሊፒድ ርዝመት የሚመራ አማራጭ የመደርደር ዘዴን ይደግፋል። ከዚያም፣ በ ER ሽፋን ውስጥ ያለው የሴራሚድ አሲል ሰንሰለት ርዝመት እንደ መራጭ ERES ውጤታማ በሆነ መንገድ Gas1-GFPን ለመመደብ አስፈላጊ መሆኑን ተንትነናል። በ GhLag1 ዝርያ ውስጥ ያለው ጋዝ1 በአጭር ሰንሰለት ሴራሚድ ውስጥ ካለው ER ወጥቶ ወደ ፕላዝማ ሽፋን ስለሚገባ (ምስል S5)፣ መደርደሩ በሴራሚድ አሲል ሰንሰለት ርዝመት የሚመራ ከሆነ፣ በ GhLag1 ዝርያ ውስጥ ያለው ጋዝ1 ሊዘዋወር እና ሊሻገር እንደሚችል እናምናለን። ተመሳሳይ ሽፋን ያላቸው የ ERES እቃዎች።
(ሀ) የGhLag1 የሴል ሽፋን በዋናነት አጠር ያሉ የC18-C16 ሴራሚዶችን ይይዛል፣ የGas1-GFP GPI መልህቅ ግን አሁንም ከዱር ዓይነት ሴሎች ጋር ተመሳሳይ የC26 IPC አለው። ከላይ፡ በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (MS) በዱር ዓይነት (Wt) እና GhLag1p ዝርያዎች የሴል ሽፋን ውስጥ የሴራሚድ አሲል ሰንሰለት ርዝመት ትንተና። መረጃው የጠቅላላ ሴራሚድ መቶኛን ይወክላል። የሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች አማካይ። የስህተት አሞሌ = SD። ባለ ሁለት ጭራ ያልተጣመረ የt ሙከራ። **** P ＜0.0001። የታችኛው ፓነል፡ በዱር ዓይነት እና በGhLag1p ዝርያዎች ውስጥ በተገለጸው በGas1-GFP (GPI-IPC) GPI መልህቅ ውስጥ የሚገኘው የIPC የአሲል ሰንሰለት ርዝመት MS ትንተና። መረጃው የጠቅላላ IPC ምልክት መቶኛን ይወክላል። የአምስት ገለልተኛ ሙከራዎች አማካይ። የስህተት አሞሌ = SD። ባለ ሁለት ጭራ ያልተጣመረ የt ሙከራ። ns፣ አስፈላጊ አይደለም። P = 0.9134። (ለ) የ sec31-1፣ sec31-1 GhLag1፣ sec31-1emp24Δ፣ sec31-1ted1Δ እና sec31-1lst1Δ ሴሎች በጋላክቶስ ምክንያት የተፈጠረውን Gas1-GFP የሚገልጹ የፍሎረሰንስ ማይክሮግራፎች በ37°ሴ ለ30 ደቂቃዎች ተቆልፈው ወደ 24°ሴ መደበኛ የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ ያስተላልፉ። ነጭ ቀስት፡ ER Gas1-GFP ክላስተር። ክፍት ቀስት፡ ያልተሰበሰበ Gas1-GFP በጠቅላላው የ ER ሽፋን ላይ ይሰራጫል፣ ይህም የ ER ባህሪ ያለው የኑክሌር ቀለበት ቀለም ያሳያል። የመለኪያ አሞሌ፣ 5μm። (ሐ) በ (B) ውስጥ የተገለጸው የፎቶማይክሮግራፍ መጠን። የነጥብ Gas1-GFP መዋቅር ያላቸው የሕዋሶች አማካይ መቶኛ። በሦስት ገለልተኛ ሙከራዎች፣ n≥300 ሴሎች። የስህተት አሞሌ = SD። ባለ ሁለት ጭራ ያልተጣመረ t ሙከራ። **** P ＜0.0001.
ይህንን ችግር በቀጥታ ለመፍታት፣ በ GhLag1 ውስጥ የ Gas1-GFP እና Mid2-iRFP SCLIM ምስላዊ እይታን በ sec31-1 የሙቀት-ስሜታዊ ሚውቴሽን አሌሌ (ምስል 4 እና ፊልም S4) አድርገናል። ER በ37°ሴ ተይዞ በ24°ሴ ከተለቀቀ በኋላ፣ አብዛኛዎቹ አዲስ የተዋሃዱ Gas1-GFP በ ER ሽፋን ውስጥ አልተሰባሰቡም እና አልተሰራጩም፣ በባህላዊ ማይክሮስኮፖች እንደሚታየው (ምስል 4፣ A እና B)። በተጨማሪም፣ ከፍተኛ የ ERES (67%) መቶኛ በውስጡ ሁለት የጭነት ዓይነቶችን ያካትታል (ምስል 4D)። በስእል 4C ውስጥ ያሉት ፓነሎች 1 እና 2 እርስ በእርስ የሚደራረቡ Gas1-GFP እና Mid2-GFP ያላቸው ሁለት የተለመዱ የ ERES ምሳሌዎችን ያሳያሉ። በተጨማሪም፣ ሁለቱም እቃዎች በተመሳሳይ ERES ውስጥ ተመልምለዋል (ምስል 4E፣ ፓነል 3 እና ፊልም S4)። ስለዚህ፣ ውጤቶቻችን በ ER ሽፋን ውስጥ ያለው የሴራሚድ አሲል ሰንሰለት ርዝመት የ ER ፕሮቲን ውህደት እና ምደባ አስፈላጊ መሆኑን ያመለክታሉ።
በጋላክቶስ ምክንያት የሚፈጠሩ ፈሳሾችን የሚገልጹ የሴክ 31-1 GhLag1 ሴሎች፣ Gas1-GFP (GPI-AP፣ አረንጓዴ) እና Mid2-iRFP (TMP፣ ሰማያዊ) እና በኮንስቲቲዩቲቭ ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES፣ ማጀንታ) በ37°ሴ ያፍቁ። ለ30 ደቂቃዎች ይቀጥሉ፣ ፈሳሾችን ለመልቀቅ ወደ 24°ሴ ይወርዱ እና ከ20 ደቂቃዎች በኋላ በSCLIM ምስል ይስሩ። (A እስከ C) በጭነት እና ERES ምልክት የተደረገባቸው 10 z-ክፍሎች ተወካይ 2D ፕሮጀክሽን ምስሎች (A፤ የመለኪያ አሞሌ፣ 1μm) ወይም 3D የሴል ንፍቀ ክበብ ምስሎች (B እና C፤ የመለኪያ አሃድ፣ 0.45μm)። በ(B) ውስጥ ያለው የታችኛው ፓነል እና በ(C) ውስጥ ያለው ፓነል በERES (ማጀንታ) [ጋዝ1-GFP (ግራጫ) እና Mid2-iRFP (ፈዛዛ ሰማያዊ)] ውስጥ ያሉትን እቃዎች ብቻ ለማሳየት የተስተካከሉ ምስሎችን ያሳያሉ። (C) ነጭ የተሞላ ቀስት፡ ERES፣ እቃዎች መደራረብ። ክፍት ቀስት፡ ERES አንድ ንጥል ብቻ ይዟል። የታችኛው ፓነል፡ የተመረጠው ERES በ (C) ምልክት የተደረገባቸው ተደራራቢ እቃዎች (1 እና 2) አሉት። የመለኪያ አሞሌ፣ 100 nm። (መ) በ (C) ውስጥ የተገለጸው የፎቶ ማይክሮግራፍ መጠን። በ sec31-1 እና sec31-1 GhLag1 አሃዶች ውስጥ፣ አንድ ጭነት (Gas1-GFP ወይም Mid2-iRFP) ብቻ ተካትቷል፣ እና ለተገለሉ ጭነት እና ለተደራራቢ ጭነት አማካይ የERES መቶኛ ተካትቷል። በሶስት ገለልተኛ ሙከራዎች ውስጥ፣ n = 432 በ 54 ሴሎች (sec31-1) እና n = 430 በ 47 ሴሎች (sec31-1 GhLag1)። የስህተት አሞሌ = SD። ባለ ሁለት ጭራ ያልተጣመረ የt ሙከራ። *** P = 0.0002 (sec31-1) እና ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)። (E) በተደራራቢ ጭነት (3) ምልክት የተደረገባቸው የተመረጡ ERES 3D ምስል። ጋዝ1-ጂኤፍፒ (አረንጓዴ) እና ሚድ2-iRFP (ሰማያዊ) አቀራረብ ERES (ማጀንታ) ከተመሳሳይ ጎን ሆነው በተመሳሳይ የERES የተገደበ ቦታ ላይ ይቆያሉ። የመለኪያ አሞሌ፣ 100 nm።
ይህ ጥናት በሊፒድ ላይ የተመሰረቱ የፕሮቲን ጭነቶች በሚስጥር መንገድ ውስጥ በተመረጡ የኤክስፖርት ቦታዎች እንደሚመደቡ የሚያሳይ ቀጥተኛ የቪቮ ማስረጃ ይሰጣል፣ እና ለምደባ ምርጫ የአሲል ሰንሰለት ርዝመት አስፈላጊነትን ያሳያል። SCLIM የተባለ ኃይለኛ እና ዘመናዊ የማይክሮስኮፕ ቴክኒክን በመጠቀም፣ አዲስ የተዋሃደውን Gas1-GFP (በጣም ረጅም የአሲል ሰንሰለት (C26) የሴራሚድ lipid ክፍል ያለው ዋና የፕላዝማ ሽፋን GPI-AP) በእርሾ ውስጥ አሳይተናል። በተለዩ ERs ውስጥ የተሰባሰቡ ክልሎች ከተወሰኑ ERES ጋር የተቆራኙ ሲሆኑ፣ ትራንስሜምብራን የሚለቀቁ ፕሮቲኖች ደግሞ በER ሽፋን ውስጥ ይሰራጫሉ (ምስል 1)። በተጨማሪም፣ እነዚህ ሁለት የሸቀጦች ዓይነቶች በምርጫ የተለያዩ ERES ይገባሉ (ምስል 2)። በሽፋኑ ውስጥ ያለው የሴሉላር ሴራሚድ የአሲል ሰንሰለት ርዝመት ከC26 ወደ C18-C16 ይቀንሳል፣ የGas1-GFP ክላስተር ወደ ዲስትሪቢዩሪቲ ER ክልል ይስተጓጎላል፣ እና Gas1-GFP ERን ከትራንስሜምብራን ፕሮቲን ጋር በተመሳሳይ ERES በኩል እንዲተው ወደ ሌላ አቅጣጫ ይላካል (ምስል 3 እና ምስል 3)። 4)።
ምንም እንኳን GPI-AP ከ ER ለመውጣት ልዩ የፕሮቲን ዘዴን ቢጠቀምም፣ የC26 ሴራሚድ ጥገኛ መለያየት ወደ ERES ልዩ ትኩረት ሊሰጥ በሚችል ልዩነት የፕሮቲን መስተጋብር ላይ እንደማይመሰረት ደርሰንበታል (ምስል S4 እና S5)። በምትኩ፣ ግኝቶቻችን በሊፒድ ላይ የተመሠረተ የፕሮቲን ክላስተር እና ሌሎች ጭነቶችን በቀጣይነት በማግለል የሚመራ አማራጭ የምደባ ዘዴን ይደግፋሉ። ምልከታዎቻችን እንደሚያሳዩት የጋስ1-GFP ክልል ወይም ክላስተር ከአንድ የተወሰነ ERES ጋር የተያያዘው የትራንስሜምብራን የሚወጣው ፕሮቲን ሚድ2-iRFP የለውም፣ ይህም የC26 ሴራሚድ-ጥገኛ GPI-AP ክላስተር ወደ ተዛማጅ ERES መግባታቸውን ያመቻቻል፣ እና በተመሳሳይ ጊዜ ትራንስሜምብራንን አያካትትም። ፈሳሾቹ ወደዚህ ልዩ ERES ይገባሉ (ምስል 1 እና 2)። በተቃራኒው፣ በER ሽፋን ውስጥ የC18-C16 ሴራሚዶች መኖር GPI-AP ክልሎችን ወይም ክላስተሮችን እንዲፈጥር አያደርግም፣ ስለዚህ ትራንስሜምብራን የሚለቀቁ ፕሮቲኖችን ወደ ተመሳሳይ ERES አያካትትም ወይም አይተኩም (ምስል 3 እና 4)። ስለዚህ፣ C26 ሴራሚድ ከተወሰኑ ERES ጋር የተገናኙ ፕሮቲኖችን በማሰባሰብ መለያየትንና ምደባን እንደሚያበረታታ እናሳያለን።
ይህንን የC26 ሴራሚድ ጥገኛ የሆነ ክላስተር ወደ አንድ የተወሰነ የER አካባቢ እንዴት ማግኘት ይቻላል? የሜምብሬን ሴራሚድ በጎን በኩል የመለየት ዝንባሌ GPI-AP እና C26 ሴራሚድ አጫጭር እና ያልተሟሉ ግሊሰሮሊፒዶችን በያዘው የER ሽፋን ውስጥ በጣም መደበኛ ባልሆነ የሊፒድ አካባቢ ውስጥ ትናንሽ እና ወዲያውኑ የተደረደሩ ቅባቶችን እንዲፈጥሩ ሊያደርግ ይችላል። ጥራት ያላቸው ክላስተሮች (17፣ 18)። እነዚህ ትናንሽ ጊዜያዊ ክላስተሮች ከp24 ውስብስብ ጋር ከተጣመሩ በኋላ ወደ ትላልቅ እና ይበልጥ የተረጋጋ ክላስተሮች ሊዋሃዱ ይችላሉ (34)። ከዚህ ጋር በሚስማማ መልኩ፣ C26 Gas1-GFP ትላልቅ የሚታዩ ክላስተሮችን ለመፍጠር ከp24 ውስብስብ ጋር መስተጋብር መፍጠር እንዳለበት አሳይተናል (ምስል 3)። የp24 ውስብስብ በእርሾ ውስጥ አራት የተለያዩ p24 ትራንስሜምብራን ፕሮቲኖችን ያቀፈ ሄትሮዚጎስ ኦሊጎመር ነው (35)፣ ይህም ባለብዙ ቫለንት ትስስር ይሰጣል፣ ይህም ትናንሽ የጂፒአይ-ኤፒ ክላስተሮችን ወደ መስቀል-ማገናኘት ሊያመራ ይችላል፣ በዚህም ትልቅ የተረጋጋ ክላስተር (34) ይፈጥራል። በጂፒአይ-ኤፒዎች የፕሮቲን ኢክቶዶሜኖች መካከል ያለው መስተጋብር በአጥቢ እንስሳት ፖላራይዝድ ኤፒተልየል ሴሎች ውስጥ በሚያደርጉት የጎልጊ ትራንስፖርት ወቅት እንደሚታየው ለስብስባቸው አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል። ሆኖም ግን፣ የC18-C16 ሴራሚድ በER ሽፋን ውስጥ ሲገኝ፣ የp24 ውስብስብ ከGas1-GFP ጋር ሲጣበቅ፣ ትላልቅ የተለያዩ ክላስተሮች አይፈጠሩም። መሰረታዊው ዘዴ ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚድ ልዩ አካላዊ እና ኬሚካላዊ ባህሪያት ላይ የተመሠረተ ሊሆን ይችላል። የአርቴፊሻል ሽፋኖች ባዮፊዚካል ጥናቶች እንደሚያሳዩት ረጅም (C24) እና አጭር (C18-C16) የአሲል ሰንሰለት ሴራሚዶች የደረጃ መለያየትን ሊያስከትሉ ቢችሉም፣ ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚዶች (C24) ብቻ ፊልሙን እንደገና ለመቅረጽ ከፍተኛ ኩርባ እና የፊልም መታጠፍን ሊያበረታቱ ይችላሉ። በጋራ ማጣቀሻ (17፣ 37፣ 38)። የ TMED2 ትራንስሜምብራን ሄሊክስ፣ የ Emp24 የሰው ልጅ ተመሳሳይነት፣ በሳይቶፕላዝሚክ ሎቡሎች (39) ውስጥ ካለው C18 ሴራሚድ ላይ የተመሠረተ ስፊንጎምዬሊን ጋር በምርጫ እንደሚገናኝ ታይቷል። ሞለኪውላር ዳይናሚክስ (MD) ማስመሰያዎችን በመጠቀም፣ ሁለቱም C18 እና C26 ሴራሚዶች በ Emp24 ትራንስሜምብራን ሄሊክስ ሳይቶፕላዝሚክ ሎቡሎች ዙሪያ እንደሚከማቹ እና ተመሳሳይ ምርጫዎች እንዳሏቸው ደርሰንበታል (ምስል S6)። ይህ የሚያመለክተው የ Emp24 ትራንስሜምብራን ሄሊክስ በሜምብራው ውስጥ ወደ ያልተመጣጠነ የሊፒድስ ስርጭት ሊያመራ እንደሚችል መሆኑን ልብ ሊባል ይገባል። ይህ በአጥቢ እንስሳት ሴሎች ላይ የተመሠረተ የቅርብ ጊዜ ውጤት ነው። ተመሳሳይ የ MD ማስመሰያዎች የኤተር ሊፒዶች መኖራቸውንም ያሳያሉ (40)። ስለዚህ፣ በ ER26 ሁለት ሎቡሎች ውስጥ ያለው C26 ሴራሚድ በአካባቢው የበለፀገ ነው ብለን እንገምታለን። በብርሃን ሎቡሎች ውስጥ ያለው GPI-AP በቀጥታ ከባለብዙ ቫለንት p24 ጋር ሲገናኝ እና በሳይቶፕላዝሚክ ሎቡሎች ውስጥ የC26 ሴራሚድ ክምችት በ p24 ዙሪያ ሲከማች፣ አብሮ የሚመጣውን የፕሮቲን ውህደት እና የሜምብሬን ኩርባ በጣቶቹ በኩል ይፈጠራል (41)፣ ይህም GPI-AP ከ ERES አጠገብ ወደ ተለዩ ክልሎች እንዲለያይ ያደርገዋል፣ ይህም የ ER ሽፋንን በጣም የተጠማዘዙ ክልሎችን ይደግፋል (42)። ቀደም ሲል የተደረጉ ሪፖርቶች የታቀደውን ዘዴ ደግፈዋል (43፣ 44)። ኦሊጎሌክቲንስ፣ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ወይም ፀረ እንግዳ አካላት በፕላዝማ ሽፋን ላይ ከሴራሚድ-ተኮር ግላይኮስፊንጎሊፒድስ (GSL) ጋር ባለብዙ ቫለንታይን ትስስር ትልቅ የጂኤስኤል ውህደትን ያስነሳል፣ የደረጃ መለያየትን ያሻሽላል እና የሽፋን መበላሸት እና ውስጣዊነትን ያስከትላል (44)። ኢዋቡቺ ወዘተ. (43) ረጅም (C24) ነገር ግን አጭር (C16) የአሲል ሰንሰለቶች ባሉበት፣ ከጂኤስኤል ላክቶሲልሴራሚድ ጋር የተሳሰረው ባለብዙ ቫለንት ሊጋንድ ትላልቅ ክላስተሮችን እና የሜምብሬን ኢንቫይጂንግን እንዳስከተለ እና በበራሪ ወረቀቶቹ ላይ ያለው ሳይቶፕላዝም በሊን የሚመራ የሲግናል ትራንስዱክሽን በተጣመሩ ኒውትሮፊልዎች ውስጥ በአሲል ሰንሰለቶች መካከል እንደሚቆራረጥ ተገኝቷል።
በአጥቢ እንስሳት ፖላራይዝድ ኤፒተልየል ሴሎች ውስጥ፣ የፀረ-ጎልጊ ኔትወርክ (TGN) ክምችት እስከ አፒካል ፕላዝማ ሽፋን ደረጃ ድረስ የጂፒአይ-ኤፒን መለየት እና መደርደርን ይቆጣጠራል (10፣ 45)። ይህ ውህደት የሚመራው በጂፒአይ-ኤፒ ኦሊጎሜራይዜሽን (36) ነው፣ ነገር ግን በእርሾ ውስጥ በምናገኘው የሴራሚድ ሰንሰለት ርዝመት ላይም ሊመሰረት ይችላል። አጥቢ እንስሳት ጂፒአይ-ኤፒ በኤተር ላይ የተመሠረተ ሊፕይድ ላይ የተመሠረተ መልህቅ ቢኖረውም፣ እና የኬሚካል አወቃቀሩ በጣም ረጅም ከሆነው የአሲል ሰንሰለት ሴራሚድ በጣም የተለየ ቢሆንም፣ በቅርቡ የተደረገ ጥናት ሁለቱም ቅባቶች በዝግመተ ለውጥ ተመሳሳይ አካላዊ እና ኬሚካላዊ ባህሪያት እና ተግባር እንዳላቸው አረጋግጧል (40)። ስለዚህ፣ በአጥቢ እንስሳት ሴሎች ውስጥ ያለው የኤተር ሊፒድ ክፍል በእርሾ ውስጥ ካለው የC26 ሴራሚድ ጋር ተመሳሳይ ሊሆን ይችላል፣ እና ሚናው የጂፒአይ-ኤፒ ውህደትን እና መደርደርን ለማስተዋወቅ በሜምብሬኑ ውስጥ ካለው ረጅም ሰንሰለት ሴራሚድ ጋር ማያያዝ ነው። ምንም እንኳን ይህ እድል አሁንም በቀጥታ መፈተሽ ቢያስፈልግም፣ ቀደም ሲል የተገኙት ግኝቶች ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚድ ወደ ጎልጊ አካል ማጓጓዝ በሳይቶፕላዝሚክ ዝውውር ፕሮቲኖች እንደማይከናወን፣ ነገር ግን እንደ እርሾ ባሉ የጂፒአይ መልሕቆች ውህደት ላይ የተመሰረተ መሆኑን ይደግፋሉ። ስለዚህ፣ የዝግመተ ለውጥ ወግ አጥባቂ ዘዴ በጣም ረጅም የአሲል ሰንሰለት ሴራሚድ እና ጂፒአይ-ኤፒ (13፣ 16፣ 20፣ 46፣ 47) በተመሳሳይ የትራንስፖርት ቬሲክል ውስጥ በምርጫ ማጓጓዝ የሚችል ይመስላል።
በእርሾ እና በአጥቢ እንስሳት ፖላራይዝድ ኤፒተልየል ሴል ሲስተሞች ውስጥ፣ የጂፒአይ-ኤፒ ውህደት እና ከሌሎች የፕላዝማ ሽፋን ፕሮቲኖች መለየት ሁሉም የሚከሰቱት ወደ ሴል ወለል ከመድረሳቸው በፊት ነው። ፓላዲኖ እና ሌሎች (48) አጥቢ እንስሳት ፖላራይዝድ ኤፒተልየል ሴሎች TGN ላይ፣ የጂፒአይ-ኤፒ ክላስተር ማድረግ የጂፒአይ-ኤፒዎችን ወደ አፒካል ፕላዝማ ሽፋን ለመመደብ ብቻ ሳይሆን የጂፒአይ-ኤፒዎችን እና የባዮሎጂካል እንቅስቃሴውን የክላስተር አደረጃጀት ይቆጣጠራል። የሴል ወለል። በእርሾ ውስጥ፣ ይህ ጥናት በER ላይ ያለው የC26 ሴራሚድ-ጥገኛ GPI-AP ክላስተር በፕላዝማ ሽፋን ላይ የጂፒአይ-ኤፒ ክላስተር የክላስተር አደረጃጀት እና ተግባራዊ እንቅስቃሴን ሊቆጣጠር እንደሚችል አሳይቷል (24፣ 49)። ከዚህ ሞዴል ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የጂፒአይ-ኤፒ ሴሎች የሴል ግድግዳ ታማኝነትን ለሚነኩ የጂፒአይ አጋቾች ወይም መድሃኒቶች አለርጂክ ናቸው (28)፣ እና በእርሾ ሴሎች ውህደት ውስጥ የሚተነበየው የጫፍ ሴራሚድ ተግባራዊ Gas1-GFP ክላስተሮች (49) አስፈላጊነት Gን ያሳያል። የhLag1 ሴሎች ሊሆኑ የሚችሉ የፊዚዮሎጂ ውጤቶችን ያሳያል። የጂፒአይ-ኤፒ ስህተት። ይሁን እንጂ፣ የሴል ወለል ተግባራዊ አደረጃጀት ከ ER በሊፒድ ርዝመት ላይ ተመስርቶ በመደርደር ዘዴ መዘጋጀቱን ተጨማሪ ምርመራ ማድረግ የወደፊት ጥናታችን ርዕሰ ጉዳይ ይሆናል።
በዚህ ሥራ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት የሳክቻሮሚሴስ ሴሬቪሲያe ዝርያዎች በሰንጠረዥ S1 ውስጥ ተዘርዝረዋል። ለቀጥታ ሴል ምስል የሚሆኑ የSCLIM MMY1583 እና MMY1635 ዝርያዎች የተገነቡት በW303 ዳራ ውስጥ ነው። እነዚህ የFluorescent ፕሮቲን መለያ ያላቸው የSec13-mCherryን የሚገልጹ ዝርያዎች የተገነቡት በፖሊሜሬዝ ሰንሰለት ምላሽ (PCR) ላይ የተመሠረተ ዘዴን በመጠቀም በpFA6a ፕላዝሚድ እንደ አብነት (23) በመጠቀም ነው። በGAL1 ፕሮሞተር ቁጥጥር ስር ባለው ፍሎረሰንት ፕሮቲን የተሰየመው የMid2-iRFP ምልክት ያለው ዝርያ እንደሚከተለው ተገንብቷል። ከpKTiRFP-KAN ቬክተር የiRFP-KanMx ቅደም ተከተል PCR ማጉላት (የE. O'Shea ስጦታ፣ Adgene plasmid ቁጥር 64687፤ http://n2t.net/addgene: 64687፤ የምርምር ሀብት መለያ (RRID): Adgene_64687) እና ወደ ኢንዶጅናል Mid2 C-terminus ውስጥ ገብተዋል። የMid2-iRFP ጂኖም ቅደም ተከተል ከተጠናከረ እና ወደ GAL1 ፕሮሞተር ከተሰቀለ በኋላ፣ በNot I-Sac I ውህድ ፕላዝሚድ pRS306 ቦታ ውስጥ ተዋህዷል። የተገኘው ፕላዝሚድ pRGS7 ከPst I ጋር በመስመራዊ መልኩ ወደ URA3 ሎከስ እንዲዋሃድ ተደርጓል።
የጋስ1-ጂኤፍፒ ውህደት ጂን በሴንትሮሜር (CEN) ፕላዝሚድ ውስጥ ባለው የGAL1 ፕሮሞተር ቁጥጥር ስር ይገለጻል፣ እሱም እንደሚከተለው ተገንብቷል። የጋስ1-ጂኤፍፒ ቅደም ተከተል ከpRS416-GAS1-GFP ፕላዝሚድ (24) (የL. ፖፖሎ ስጦታ) በPCR ተሻሽሎ በCEN ፕላዝሚድ pBEVY-GL LEU2 (የC ስጦታ) Xma I–Xho I ቦታ ላይ ተቀርጿል። ሚለር፤ የአጅጅን ፕላዝሚድ ቁጥር 51225፤ http://n2t.net/addgene: 51225፤ RRID: Addgene_51225)። የተገኘው ፕላዝሚድ pRGS6 ተብሎ ተሰይሟል። የAxl2-GFP ውህደት ጂን በpBEVY-GL LEU2 ቬክተር GAL1 ፕሮሞተር ቁጥጥር ስርም ይገለጻል፣ እና ግንባታው እንደሚከተለው ነው። የAxl2-GFP ቅደም ተከተል ከpRS304-p2HSE-Axl2-GFP ፕላዝሚድ (23) በPCR ተሻሽሎ ወደ pBEVY-GL LEU2 ቬክተር ባም HI-Pst I ቦታ ተቀርጿል። የተገኘው ፕላዝሚድ pRGS12 ተብሎ ተሰይሟል። በዚህ ጥናት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት ኦሊጎኑክሊዮታይዶች ቅደም ተከተል በሰንጠረዥ S2 ውስጥ ተዘርዝሯል።
ይህ ዝርያ እንደ ካርቦን ምንጭ 0.2% አዴኒን እና 2% ግሉኮስ [YP-ዴክስትሮዝ (YPD)]፣ 2% ራፊኖዝ [YP-ራፊኖዝ] የበለፀገ የእርሾ ማውጣት ፕሮቲን p (YP) መካከለኛ (1% የእርሾ ማውጣት እና 2% ፕሮቲን ኤፕት)። (YPR)] ወይም 2% ጋላክቶስ [YP-ጋላክቶስ (YPG)] ወይም ለአመጋገብ የሚያስፈልጉትን ተገቢ አሚኖ አሲዶች እና መሰረቶች ለማሟላት በተዋሃደ አነስተኛ መካከለኛ (0.15% የእርሾ ናይትሮጅን መሰረት እና 0.5% አሞኒየም ሰልፌት) ውስጥ ተጨምሮበታል፣ እና 2% ግሉኮስ (ሲንተቲክ ግሉኮስ አነስተኛ መካከለኛ መካከለኛ) ወይም 2% ጋላክቶስ (ሲንተቲክ ጋላክቶስ አነስተኛ መካከለኛ መካከለኛ) እንደ ካርቦን ምንጭ ተጨምሯል።
ለእውነተኛ ጊዜ ምስል፣ በGAL1 ፕሮሞተር ስር ያለውን መዋቅር የሚገልጹ የሙቀት መጠን ስሜታዊ የሆኑ የ sec31-1 ሚውቴሽን ሴሎች በYPR መካከለኛ ውስጥ በአንድ ሌሊት በ24°ሴ እስከ መካከለኛ ደረጃ ድረስ አድጓል። በYPG ውስጥ ለ1 ሰዓት በ24°ሴ ውስጥ ከተቀነባበረ በኋላ፣ ሴሎቹ በ37°ሴ በSG ውስጥ ለ30 ደቂቃዎች እንዲቆዩ ተደርገዋል፣ ከዚያም ከሚወጣው ማገጃ እንዲወጡ ወደ 24°ሴ ተዛውረዋል። ኮንካናቫሊን ኤ ህዋሶቹን በመስታወት ስላይድ ላይ ለማስተካከል እና በSCLIM ምስል ለማሳየት ጥቅም ላይ ውሏል። SCLIM የኦሊምፐስ IX-71 የተገለበጠ የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፕ እና የUPlanSApo 100×1.4 የቁጥር አፔር ኦይል ሌንስ (ኦሊምፐስ)፣ ከፍተኛ ፍጥነት እና ከፍተኛ-ሲግናል-ወደ-ጫጫታ ጥምርታ የሚሽከረከር ዲስክ ኮንፎካል ስካነር (ዮኮጋዋ ኤሌክትሪክ)፣ ብጁ ስፔክትሮሜትር እና ብጁ ማቀዝቀዣ ጥምረት ነው። የስርዓቱ የምስል ማጠንከሪያ (ሃማማትሱ ፎቶኒክስ) ×266.7 የመጨረሻ ማጉላት እና ኤሌክትሮኖችን የሚያባዛ የኃይል መሙያ መሳሪያ ካሜራ (ሃማማትሱ ፎቶኒክስ) (21) ያለው የማጉያ ሌንስ ስርዓት ማቅረብ ይችላል። የምስል ማግኛ የሚከናወነው በብጁ ሶፍትዌር (ዮኮጋዋ ኤሌክትሪክ) ነው። ለ3-ልኬት ምስሎች፣ የኦፕሊኬሽን ሌንስን በአቀባዊ ለማንቀጥቀጥ ብጁ የተሰራ ፒኢዞኤሌክትሪክ አክቲቬተር ተጠቅመናል፣ እና የኦፕቲካል ክፍሎችን በ100 nm ርቀት ላይ በአንድ ቁልል ውስጥ ሰብስበናል። የZ-stack ምስል ወደ 3D ቮክሰል ዳታ ይቀየራል፣ እና ለሚሽከረከር ዲስክ ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ጥቅም ላይ የሚውለው የቲዎሬቲካል ነጥብ ስርጭት ተግባር በቮሎሲቲ ሶፍትዌር (ፐርኪንኤልመር) ለዲኮንቮሉሽን ሂደት ጥቅም ላይ ይውላል። የቮልሲቲ ሶፍትዌርን በመጠቀም ለጋራ-ቦታ ትንተና በራስ-ሰር ገደብ በማድረግ፣ ጭነትን ጨምሮ ERES ተለክቷል። የመስመር ቅኝት ትንተና የተከናወነው በMetaMorph ሶፍትዌር (ሞለኪውላር መሳሪያዎች) በመጠቀም ነው።
የስታቲስቲክስ ጠቀሜታን ለመወሰን የግራፍፓድ ፕሪዝም ሶፍትዌርን ይጠቀሙ። ለባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ እና ለተለመደው የአንድ-መንገድ የልዩነት ትንተና (ANOVA) ፈተና፣ በቡድኖች መካከል ያሉ ልዩነቶች በP <0.05 (*) ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ እንዳላቸው ይታሰባል።
ለ Gas1-GFP የፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ፣ የሎግ ፌዝ ሴሎች በአንድ ሌሊት በYPD ውስጥ አድገው በሴንትሪፉጌሽን ተሰብስበዋል፣ በፎስፌት በተበተነ ሳላይን ሁለት ጊዜ ታጥበው ቢያንስ ለ15 ደቂቃዎች በበረዶ ላይ ተቆፍረው፣ ከዚያም ቀደም ሲል እንደተገለጸው ቼክ (24) በመጠቀም በማይክሮስኮፕ ስር ተወስደዋል። የLeica DMi8 ማይክሮስኮፕ (HCX PL APO 1003/1.40 ዘይት PH3 CS) በኦብጀክት ሌንስ፣ L5 (GFP) ማጣሪያ፣ የሃማማቱሱ ካሜራ እና የአፕሊኬሽን ስዊት X (LAS X) ሶፍትዌር ለግዥ ጥቅም ላይ ውሏል።
ናሙናዎቹ በ65°ሴ የሙቀት መጠን ለ10 ደቂቃዎች በSDS ናሙና ቋት ተቆርጠው በSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) ተለያይተዋል። ለኢሚውኖብሎቲንግ ትንተና፣ በአንድ መስመር 10 μl ናሙና ተጭኗል። ዋና ፀረ እንግዳ አካል፡- በ1፡3000 ዲሉሽን የጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ-ጋዝ1፣ በ1፡500 ዲሉሽን የጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ-Emp24 እና በ1፡3000 ዲሉሽን የጥንቸል ፖሊክሎናል ፀረ-ጂኤፍፒ (ከኤች. ራይዝማን የተሰጠ ስጦታ) ይጠቀሙ። የመዳፊት ሞኖክሎናል ፀረ-Pgk1 ፀረ እንግዳ አካል በ1፡5000 ዲሉሽን (ከጄ. ዴ ላ ክሩዝ የተሰጠ ስጦታ) ጥቅም ላይ ውሏል። ሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካል፡- ሆርስራዲሽ ፔሮክሲዳሴ (HRP) የተዋሃደ ፍየል ፀረ-ጥንቸል ኢሚውኖግሎቡሊን G (IgG) በ1፡3000 ዲሉሽን ጥቅም ላይ ውሏል (ፒርስ)። በኤችአርፒ የተዋሃደ የፍየል ፀረ-አይጥ IgG በ1፡3000 (ፒርስ) በመቀነስ ጥቅም ላይ ውሏል። የበሽታ መከላከያ ምላሽ ዞን የታየው በሱፐርሲግናል ዌስት ፒኮ ሪጋንት (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) የኬሚሉሚኒሴንስ ዘዴ ነው።
በ(31) ላይ እንደተገለጸው፣ በተሻሻለው የER ክፍልፋይ ላይ ተፈጥሯዊ የበሽታ መከላከያ ሙከራ ተካሂዷል። በአጭሩ፣ የእርሾ ሴሎችን በTNE ቋት [50 mM tris-HCl (pH 7.5)፣ 150 mM NaCl፣ 5 mM EDTA፣ 1 mM ፌኒልሜቲልሰልፎኒል ፍሎራይድ እና ፕሮቴዝ አጋቾች ድብልቅ) በ100 ኦፕቲካል ጥግግት ሁለት ጊዜ በ600 nm (OD600) ያጠቡ። በመስታወት ዶቃዎች ተሰበረ፣ ከዚያም የሴል ፍርስራሾች እና የመስታወት ዶቃዎች በሴንትሪፉጌሽን ተወግደዋል። ከዚያም ሱፐርናታንቱ በ17,000 ግራም ለ15 ደቂቃዎች በ4°ሴ ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። እንክብሉ በTNE ውስጥ እንደገና ተዘግቶ ዲጂታልስ ሳፖኒን በመጨረሻው ክምችት 1% ተጨምሯል። እገዳው ለ1 ሰዓት በ4°ሴ ሲሽከረከር ታጥቧል፣ ከዚያም የማይሟሟ ክፍሎች በ4°ሴ በ13,000 ግራም ሴንትሪፉጂንግ ለ60 ደቂቃዎች ተወግደዋል። ለጋዝ1-ጂኤፍፒ የበሽታ መከላከያ ፕሪሲፒቴሽን፣ በመጀመሪያ ናሙናውን በባዶ የአጋሮዝ ዶቃዎች (ChromoTek) በ4°ሴ ለ1 ሰዓት ቀድመው ያፍሉት፣ ከዚያም በ4°ሴ ለ3 ሰዓታት በGFP-Trap_A (ChromoTek) ያፍሉት። የበሽታ መከላከያ ፕሪሲፒቴድ ዶቃዎች አምስት ጊዜ 0.2% ዲጎክሲጀኒን በያዘ TNE ታጥበው በSDS ናሙና ቋት ተለይተው በSDS-PAGE ላይ ተለያይተው በImmunoblotting ተተነተኑ።
በ(31) ላይ እንደተገለጸው፣ በተሻሻለው የER ክፍልፋይ ላይ የመስቀል-ሊንክ መወሰን ተካሂዷል። በአጭሩ፣ የተሻሻለው የER ክፍልፋይ በ0.5 mM dithiobis(succinimidyl propolyte) (Pierce፣ Thermo Fisher Scientific፣ Rockford፣ IL፣ USA፤ 20°C፣ 20 ደቂቃ) ተጨምሯል። የመስቀል-ሊንክ ምላሹ ግሊሲን (50 mM የመጨረሻ ክምችት፣ 5 ደቂቃዎች፣ 20°C) በመጨመር ጠፍቷል።
ቀደም ሲል እንደተገለጸው (50)፣ በዱር-አይነት እና በGhLag1 ዝርያዎች ውስጥ የሴራሚድ የኤምኤስ ትንተና ተካሂዷል። ባጭሩ፣ ሴሎች በYPD በ30°ሴ ወደ ኤክስፖኔንታል ደረጃ (ከ3 እስከ 4 OD600 ዩኒት/ሚሊ ሊትር) አድጓል፣ እና 25×107 ሴሎች ተሰብስበዋል። ሜታቦሊዝም በትሪክሎሮአሴቲክ አሲድ ይጠፋል። የማውጣት ሟሟት [ኤታኖል፣ ውሃ፣ ኤተር፣ ፒሪዲን እና 4.2 N አሞኒየም ሃይድሮክሳይድ (15:15:5:1:0.018 v/v)] እና 1.2 nmol የውስጥ መደበኛ C17 ሴራሚድ (860517፣ አቫንቲ ፖላር ሊፕይድ) ጥራት ይጠቀሙ። የማውጣቱ መለስተኛ የአልካላይን ሃይድሮሊሲስ ለማድረግ የሞኖሜቲላሚን ሬጀንት [ሜታኖል፣ ውሃ፣ n-ቡታኖል እና ሜታሊሚን መፍትሄ (4:3:1:5 v/v)] ይጠቀሙ፣ እና ከዚያም በውሃ የተሞላ n-ቡታኖል በመጠቀም ጨውን ለማስወገድ ይጠቀሙ። በመጨረሻም፣ ማውጣት በአዎንታዊ ሁነታ ሶልቬንት [ክሎሮፎርም/ሜታኖል/ውሃ (2:7:1) + 5 mM አሞኒየም አሲቴት] ውስጥ እንደገና ተወግዶ በጅምላ ስፔክትሮሜትር ውስጥ ተወግቷል። የስፊንጎሊፒድ ሞለኪውሎችን ለመለየት እና ለመለካት ባለብዙ-ምላሽ ክትትል (MRM) ተከናውኗል። የTSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ለሊፕዲድ ትንተና በሮቦቲክ ናኖፍሎው አዮን ምንጭ ናኖሜት ኤችዲ (Advion Biosciences, Ithaca, NY) የተገጠመለት ነው። የግጭት ኃይል ለእያንዳንዱ ሴራሚድ ምድብ የተመቻቸ ነው። የMS መረጃ የተገኘው በአዎንታዊ ሁነታ ነው። ለእያንዳንዱ ባዮሎጂካል ቅጂ፣ የሊፕቲድ ሲግናል የሶስት ገለልተኛ መለኪያዎች መካከለኛ ነው።
በ(31) ላይ እንደተገለጸው፣ Gas1-GFPን የሚገልጹት ሴሎች (800×107) ለተፈጥሮ የበሽታ መከላከያ ክትባት ተዳርገዋል። የተጣራው Gas1-GFP በSDS-PAGE ተለያይቶ ወደ ፖሊቪኒሊዲን ፍሎራይድ (PVDF) ሽፋን ተላልፏል። ፕሮቲኑ PVDFን በአሚድ ጥቁር ቀለም በመቀባት ታይቷል። የGas1-GFP ባንድ ከPVDF ተቆርጦ 5 ጊዜ በሜታኖል እና አንድ ጊዜ በፈሳሽ ክሮማቶግራፊ-MS (LC-MS) ደረጃ ውሃ ታጥቧል። የሽፋኑን ስትሪፕ በ500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)፣ በቋፍ እና 500μl አዲስ በሟሟ 1 M ሶዲየም ናይትሬት ድብልቅ በ37°ሴ ለ3 ሰዓታት በማሳደግ፣ የሊፒድ ክፍልፋዩ ከGas1-GFP ይለቀቃል እና በግሉኮሳሚን እና በኢኖሲቶል መካከል የኢኖሲን ፎስፌት ሴራሚድ ይለቀቃል (51)። ከዚያ በኋላ የሜምብሬም ስትሪፕ አራት ጊዜ በLC-MS ደረጃ ውሃ ታጥቦ በክፍል ሙቀት ደርቆ እስኪተነተን ድረስ በ -80°ሴ ናይትሮጅን ከባቢ አየር ውስጥ ተከማችቷል። እንደ መቆጣጠሪያ፣ ለእያንዳንዱ ሙከራ ባዶ የPVDF ሽፋን ናሙና ጥቅም ላይ ውሏል። ከዚያም ከGas1-GFP የተወሰደው ሊፒድ እንደተገለጸው በMS ተተነተነ (50)። ባጭሩ፣ GPI-lipid የያዙ የPVDF ስትሪፖች በ75μl አሉታዊ የሻጋታ መሟሟት [ክሎሮፎርም/ሜታኖል (1:2) + 5 mM አሞኒየም አሲቴት] ውስጥ እንደገና ተዘግተው ኤሌክትሮስፕሬይ አዮንአይዜሽን (ESI)-MRM/MS የስፊንጎሊፒድ ዝርያዎች ትንተና (TSQ Vantage) አልፈዋል። በዚህ ሁኔታ፣ የMS መረጃ በአሉታዊ አዮን ሁነታ ተገኝቷል።
ቀደም ሲል እንደተጠቀሰው፣ የጂፒአይ መልህቅ የሊፒድ ክፍል ከ[3H]-ኢኖሲቶል-መለያ GPI-AP (16) ተለይቷል። ሊፒዶቹ በቀጭን ንብርብር ክሮማቶግራፊ በሶልቬት ሲስተም (55:45:10 ክሎሮፎርም-ሜታኖል-0.25% KCl) ተለያይተው በFLA-7000 (ፉጂፊልም) በመጠቀም በምስል ታይተዋል።
Gas1-GFP (600×107) የሚገልጹት ሴሎች ሁለት ጊዜ በTNE ቋት ከTNE ቋት ጋር ታጥበው በመስታወት ዶቃዎች ተሰበሩ፣ ከዚያም የሴል ፍርስራሾችን እና የመስታወት ዶቃዎችን ለማስወገድ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። ከዚያም የላይኛው ቋት በ17,000 ግራም ለ1 ሰዓት በ4°ሴ ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። እንክብሉ በTNE ታጥቦ በ37°ሴ ለ1 ሰዓት በTNE ውስጥ 0.2% ዲጂታል ሳፖኒን የያዘ 1 U PI-PLC (Invitrogen) ተጨምሯል። የኢንዛይም ህክምና ከተደረገ በኋላ ሽፋኑ በ4°ሴ ለ1 ሰዓት በ17,000 ግራም ሴንትሪፉጂንግ ተወግዷል። Gas1-GFPን የመከላከል አቅምን ለማሻሻል፣ የላይኛው ቋት በአንድ ሌሊት በ4°ሴ በGFP-Trap_A (ChromoTek) ተጨምሯል። በSDS-PAGE የተለየው የተጣራው Gas1-GFP በኮማሲ ብሩህ ሰማያዊ ቀለም ተቀባ። የጋስ1-ጂኤፍፒ የእድፍ ባንድ ከውሃ ቱቦው ዙሪያ ካለው ግራጫ ተቆርጧል፣ ከዚያም ከአዮዶአሴታሚድ ጋር አልኪላይዜሽን እና ከዲቲዮትሬይቶል ጋር ከተቀነሰ በኋላ፣ ከትራይፕሲን ጋር በጄል ውስጥ መፈጨት ተደረገ። ትራይፕቲክ ፔፕታይዶችን እና ፔፕታይዶችን ከጂፒአይ-ግሊካንስ ጋር አውጥተው ያድርቁ። የደረቀው ፔፕታይድ በ20 μl ውሃ ውስጥ ፈሰሰ። አንድ ክፍል (8μl) ወደ LC ውስጥ ይወጉ። ኦክታዴሲልሲላን (ODS) አምድ (ዴቬሎሲል 300ODS-HG-5፤ ውስጣዊ ዲያሜትር 150 ሚሜ × 1.0 ሚሜ፤ ኖሙራ ኬሚካል፣ አይቺ ፕሪፌክቸር፣ ጃፓን) በተወሰኑ የግራዲየንት ሁኔታዎች ውስጥ ፔፕታይዶችን ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል። የሞባይል ደረጃው ሶሉቲቭ ኤ (0.08% ፎርሚክ አሲድ) እና ሶሉቲቭ ቢ (0.15% ፎርሚክ አሲድ በ80% አሴቶኒትሪል) ነው። የአኬላ ኤችፒኤልሲ ሲስተም (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ቦስተን፣ ማሳቹሴትስ) በ55 ደቂቃዎች ውስጥ በ50 μl ደቂቃ-1 የፍሰት ፍጥነት በ50 μl ደቂቃ-1 የፍሰት መጠን ከሟሟ A ጋር ያለውን አምድ ለ5 ደቂቃዎች ለማውጣት ጥቅም ላይ ውሏል፣ ከዚያም የሟሟ B ክምችት ወደ 40% ጨምሯል፣ ዩናይትድ ስቴትስ)። ኤሉቴቱ በተከታታይ ወደ ESI ion ምንጭ አስተዋውቋል፣ እና ትራይፕቲክ ፔፕታይዶች እና ፔፕታይዶች ከጂፒአይ-ግሊካንስ ጋር በLTQ Orbitrap XL (ሃይብሪድ ሊኒየር ion trap-orbitrap mass spectrometer፤ Thermo Fisher Scientific) ተተነተነ። በMS ማዋቀር ውስጥ፣ የካፒላሪ ምንጭ ቮልቴጅ ወደ 4.5 ኪ.ቮ ተቀናብሯል፣ እና የማስተላለፊያ ካፕላሪ ሙቀት በ300°ሴ ተቀምጧል። የካፒላሪ ቮልቴጅ እና የቱቦ ሌንስ ቮልቴጅ በቅደም ተከተል ወደ 15 V እና 50 V ተቀናብረዋል። የኤምኤስ መረጃ የተገኘው በ300/ሜ/ዝ የጅምላ/ቻርጅ ጥምርታ (ሜ/ዝ) 3000 በሆነ የጅምላ ክልል ውስጥ በአዎንታዊ አዮን ሁነታ (60,000 ጥራት፤ በሚሊዮን 10 ክፍሎች የጅምላ ትክክለኛነት) ነው። የኤምኤስ/ኤምኤስ መረጃ የሚገኘው በLTQ Orbitrap XL [መረጃው የተመሰረተባቸው የመጀመሪያዎቹ 3 አሃዞች፣ የግጭት መከፋፈል (CID)] ውስጥ ባለው የአዮን ወጥመድ በኩል ነው።
የMD ማስመሰያዎች የተከናወኑት በGROMACS (52) ሶፍትዌር እና በ MARTINI 2 force field (53-55) በመጠቀም ነው። ከዚያም የCHARMM GUI Membrane Builder (56፣ 57) ዳይኦሌዮይልፎስፋቲዲልኮሊን (DOPC) እና Cer C18 ወይም DOPC እና Cer C26 የያዘ ባለሁለት ሽፋን ለመገንባት ጥቅም ላይ ውሏል። የC26 ቶፖሎጂ እና መጋጠሚያዎች ከስፊንጎሲን ጅራት ተጨማሪ ዶቃዎችን በማስወገድ ከDXCE የተገኙ ናቸው። ድርብ ንብርብርን ለማመጣጠን እና ለማስኬድ ከዚህ በታች የተገለጸውን ሂደት ይጠቀሙ፣ ከዚያም Emp24 የያዘ ስርዓት ለመገንባት የስርዓቱን የመጨረሻ መጋጠሚያዎች ይጠቀሙ። የእርሾ Emp24 ትራንስሜምብራን ጎራ (ቅሪቶች ከ173 እስከ 193) የእይታ MD (VMD) መሣሪያ ሞለኪውላዊ መዋቅር (58) በመጠቀም እንደ α-ሄሊክስ ተገንብቷል። ከዚያም፣ የተደራረቡትን ሊፒዶች ካስወገዱ በኋላ፣ ፕሮቲኑ በደንብ ተቆርጦ በCHARMM GUI በመጠቀም ወደ ባለሁለት ንብርብር ውስጥ ገብቷል። የመጨረሻው ስርዓት 1202 DOPC እና 302 Cer C26 ወይም 1197 DOPC እና 295 Cer C18 እና Emp24 ይዟል። ስርዓቱን ወደ 0.150M ክምችት ያብሩት። ለሁለት ባለሁለት ንብርብር ውህዶች አራት ገለልተኛ ቅጂዎች ተፈጥረዋል።
የሊፒድ ባይሌየር የሚስተካከለው በCHARMM GUI ሂደት ሲሆን ይህም 405,000 ደረጃዎችን መቀነስ እና ከዚያም ማመጣጠንን ያካትታል፣ የቦታ ገደቦች ቀስ በቀስ የሚቀነሱ እና የሚወገዱበት እና የጊዜ ደረጃው ከ0.005 ps ወደ 0.02 ps ይጨምራል። ከእኩልታ በኋላ፣ በ0.02 ps የጊዜ ደረጃ 6 µs ያመነጫል። Emp24 ን ካስገቡ በኋላ፣ ስርዓቱን ለመቀነስ እና ለማመጣጠን ተመሳሳይ የCHARMM GUI ሂደትን ይጠቀሙ እና ከዚያ በምርት ጊዜ ለ8 ሰከንዶች ያሂዱ።
ለሁሉም ስርዓቶች፣ በማመጣጠን ሂደት ወቅት፣ ግፊቱ በቤሬንድሰን ባሮስታት (59) ቁጥጥር የሚደረግበት ሲሆን፣ በምርት ሂደቱ ወቅት ግፊቱ በፓሪኔሎ-ራህማን ባሮስታት (60) ቁጥጥር ይደረግበታል። በሁሉም ሁኔታዎች፣ አማካይ ግፊት 1 ባር ሲሆን ከፊል-ኢሶትሮፒክ የግፊት ማገናኛ ዘዴ ጥቅም ላይ ይውላል። በሚዛን እና በምርት ሂደት ውስጥ፣ የፍጥነት ማሻሻያ ያለው ቴርሞስታት (61) የፕሮቲን፣ የሊፒድ እና የሟሟ ቅንጣቶችን የሙቀት መጠን በቅደም ተከተል ለማጣመር ጥቅም ላይ ይውላል። በጠቅላላው አሠራር ወቅት፣ የታለመው የሙቀት መጠን 310 ኪ.ሜ ነው። የማይገጣጠም መስተጋብር የሚሰላው በ0.005 ቋት መቻቻል ባለው የቨርሌት ዘዴ በመጠቀም የማጣመሪያ ዝርዝር በመፍጠር ነው። የኩሎምብ ቃል የሚሰላው በምላሽ መስክ እና በ1.1 ናሜ ርቀት የመቁረጥ ርቀት በመጠቀም ነው። የቫንደር ዋልስ ቃል 1.1 ናሜ የመቁረጥ ርቀት ያለው የመቁረጥ ዘዴ ይጠቀማል፣ እና የቨርሌት የመቁረጥ ዘዴ ለሚቻል መንሸራተት (62) ጥቅም ላይ ይውላል።
VMDን በመጠቀም፣ በDOPC ፎስፌት ዶቃዎች ወይም በሴራሚድ AM1 ዶቃዎች እና በፕሮቲኑ መካከል ያለው የመቁረጫ ሞገድ ርዝመት 0.7 nm ሲሆን ከፕሮቲኑ ጋር የሚገናኙት የሊፒዶች ብዛት ይሰላል። በሚከተለው ቀመር መሠረት፣ በ(63) ውስጥ እንደሚታየው የመሟጠጥ-ማበልጸጊያ (DE) ፋክተርን ያሰሉ፡ DE ፋክተር = (በፕሮቲን 0.7 ውስጥ ያለው የጠቅላላ ቅባቶች መጠን) በፕሮቲን 0.7 (በጠቅላላ ቅባቶች ውስጥ ያለው የCer መጠን)
የተዘገበው እሴት እንደ አማካይ የሚገኝ ሲሆን የስህተት አሞሌዎቹ ደግሞ አራት ገለልተኛ የSE ቅጂዎች ናቸው። የDE ፋክተር ስታቲስቲካዊ ጠቀሜታ የሚሰላው በ t test [(አማካይ DE-factor-1)/SE] ነው። ከአንድ-ጅራት ስርጭት የP እሴቱን ያሰሉ።
የGROMACS መሳሪያው Emp24 ን የያዘውን ስርዓት የ2D የጎን ጥግግት ካርታ ለማስላት ጥቅም ላይ ውሏል። የሴራሚድ ማበልጸጊያ/መሟጠጥ ካርታ ለማግኘት የCer ጥግግት ካርታ በCer እና DOPC ካርታ ድምር የተከፈለ ሲሆን ከዚያም በሰውነት ውስጥ ባለው የCer ክምችት ይከፈላል። ተመሳሳይ የቀለም ካርታ ልኬት ጥቅም ላይ ይውላል።
ለዚህ ጽሑፍ ተጨማሪ ቁሳቁሶችን ለማግኘት እባክዎ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ን ይመልከቱ።
ይህ በCreative Commons Attribution-Non-Commercial License ውል መሠረት የተሰራጨ ክፍት መዳረሻ ያለው ጽሑፍ ሲሆን የመጨረሻው አጠቃቀም ለንግድ ጥቅም ካልሆነ እና የመጀመሪያው ስራ ትክክል ከሆነ በማንኛውም ሚዲያ ውስጥ መጠቀም፣ ማሰራጨት እና ማባዛት ያስችላል። ማጣቀሻ።
ማሳሰቢያ፡ የኢሜይል አድራሻዎን እንዲያቀርቡ የምንጠይቅዎት እርስዎ ለገጹ የሚመክሩት ሰው ኢሜይሉን እንዲያዩት እንደሚፈልጉ እና አይፈለጌ መልዕክት እንዳልሆነ እንዲያውቅ ብቻ ነው። ምንም አይነት የኢሜይል አድራሻዎችን አንይዝም።
ይህ ጥያቄ ጎብኚ መሆንዎን ለመፈተሽ እና በራስ-ሰር የአይፈለጌ መልዕክት ማስገባትን ለመከላከል ይጠቅማል።
ሶፊያ ሮድሪጌዝ-ጋላርዶ፣ ካዙኦ ኩሮካዋ፣ ሱሳና ሳቢዶ-ቦዞ፣ አሌሃንድሮ ኮርቴዝ · ጎሜዝ (አሌጃንድሮ ኮርቴስ-ጎሜዝ)፣ አትሱኮ ኢኬዳ (አትሱኮ ኢኬዳ)፣ ቫለሪያ ዞኒ (ቫሌሪያ ዞኒ)፣ Auxiliadora Aguilera-Romero፣ አና ማሪያ ፔሬዝ - ሊኔሮ)፣ ሰርጂዮ ሎፔዝ (ሴርጆ ሎጋማን) (ሚሳኮ አርማን)፣ ሚያኮ ሪማን (ሚያኮ ሪማን)፣ ፕሮው አኪራ፣ ስቴፋኖ ፋኒ፣ አኪሂኮ ናካኖ፣ ማኑኤል ሙኒዝ
ባለ 3-ልኬት ከፍተኛ ጥራት ያለው የእውነተኛ ጊዜ ምስል በተመረጡ የውጤት ቦታዎች ላይ የፕሮቲን መደርደርን በተመለከተ የሴራሚድ ሰንሰለት ርዝመት ምን ያህል አስፈላጊ እንደሆነ ያሳያል።
ሶፊያ ሮድሪጌዝ-ጋላርዶ፣ ካዙኦ ኩሮካዋ፣ ሱሳና ሳቢዶ-ቦዞ፣ አሌሃንድሮ ኮርቴዝ · ጎሜዝ (አሌጃንድሮ ኮርቴስ-ጎሜዝ)፣ አትሱኮ ኢኬዳ (አትሱኮ ኢኬዳ)፣ ቫለሪያ ዞኒ (ቫሌሪያ ዞኒ)፣ Auxiliadora Aguilera-Romero፣ አና ማሪያ ፔሬዝ - ሊኔሮ)፣ ሰርጂዮ ሎፔዝ (ሴርጆ ሎጋማን) (ሚሳኮ አርማን)፣ ሚያኮ ሪማን (ሚያኮ ሪማን)፣ ፕሮው አኪራ፣ ስቴፋኖ ፋኒ፣ አኪሂኮ ናካኖ፣ ማኑኤል ሙኒዝ
ባለ 3-ልኬት ከፍተኛ ጥራት ያለው የእውነተኛ ጊዜ ምስል በተመረጡ የውጤት ቦታዎች ላይ የፕሮቲን መደርደርን በተመለከተ የሴራሚድ ሰንሰለት ርዝመት ምን ያህል አስፈላጊ እንደሆነ ያሳያል።
©2020 የአሜሪካ የሳይንስ እድገት ማህበር። ሁሉም መብቶች የተጠበቁ ናቸው. AAAS የHINARI፣ AGORA፣ OARE፣ CHORUS፣ CLOCKSS፣ CrossRef እና COUNTER አጋር ነው። ScienceAdvances ISSN 2375-2548.