Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት ለCSS የተወሰነ ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳሃኝነት ሁነታን እንዲያጠፉ) እንመክራለን። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
ከአከርካሪ አጥንቶች በተለየ መልኩ ነፍሳት በወንድ ላይ የተመሰረተ የወሲብ ስቴሮይድ ሆርሞኖች እንደሌላቸው በሰፊው ይታሰባል። በአኖፌልስ ጋምቢያ ውስጥ፣ ኤክዲሲን ስቴሮይድ 20-ሃይድሮክሲክዳይሶን (20E) በሴቶች ሲዋሃድ የእንቁላል እድገትን ለመቆጣጠር እና በወንዶች ላይ የግብረ ሥጋ ግንኙነት ሲተላለፍ የማርባት መቃወሚያ ጊዜን ለማነሳሳት የተለወጠ ይመስላል። የእንቁላል እድገት እና ማጣመር አስፈላጊ የመራቢያ ባህሪያት ስለሆኑ፣ የሴት አኖፌልስ ትንኞች እነዚህን የሆርሞን ምልክቶችን እንዴት እንደሚያዋህዱ መረዳት አዳዲስ የወባ መቆጣጠሪያ ፕሮግራሞችን ዲዛይን ሊያመቻች ይችላል። እዚህ፣ እነዚህ የመራቢያ ተግባራት ውስብስብ በሆነ የኢክዳይስቴሮይድ-አክቲቬቲንግ/ኢንአክቲቬቲንግ ኢንዛይሞች አውታረ መረብ አማካኝነት በተለያዩ የወሲብ ስቴሮይድዎች እንደሚተዳደሩ እናሳያለን። በወንድ ላይ የተመሰረተ ኦክሳይድ የተደረገበት ኤክዳይሶን፣ 3-ዲሃይድሮ-20E (3D20E) ለይተናል፣ ይህም ከወሲብ ዝውውር በኋላ እና በዲፎስፈረላይዜሽን ማግበርን በመዝጋት የወላጅነትን ይጠብቃል። በተለይም፣ የ3D20E ዝውውር በፕላዝሞዲየም ኢንፌክሽን ወቅት የእንቁላል እድገትን የሚጠብቁ የመራቢያ ጂኖችን አገላለጽ አስከትሏል፣ ይህም የተጠቁ ሴቶችን ጤና ያረጋግጣል። ከሴት የተገኘ 20E ወሲባዊ ግንኙነትን አያመጣም። ምላሽ፣ ነገር ግን 20E-inhibiting kinases ከተከለከሉ በኋላ የተጋቡ ግለሰቦች እንቁላል እንዲጥሉ ያስችላቸዋል። የዚህ ወንድ-ተኮር የነፍሳት ስቴሮይድ ሆርሞን መለየት እና የሴትን የግብረ ሥጋ ግንኙነት መቀበል፣ የመራባት እና ከፕላስሞዲየም ጋር ያለውን መስተጋብር በመቆጣጠር ረገድ ያለው ሚና የወባ በሽታ አስተላላፊ ትንኞች የመራቢያ ስኬትን የመቀነስ አቅም እንዳለው ይጠቁማል።
የወባ በሽታ እና የሞት መጠን እንደገና እየጨመረ ነው4 ምክንያቱም የሰው ልጅ የወባ ጥገኛ ተውሳኮች ብቸኛ ተሸካሚ በሆነው አኖፌልስ ትንኞች ላይ ሰፊ የፀረ-ተባይ መድኃኒት የመቋቋም አቅም በመኖሩ ነው። የእነዚህ ትንኞች የመተሳሰር ባዮሎጂ በተለይ ለአዲስ የወባ መቆጣጠሪያ ጣልቃገብነቶች ማራኪ ኢላማ ነው ምክንያቱም ሴቶች አንድ ጊዜ ብቻ የሚተሳሰሩ ናቸው፤ ይህንን ነጠላ የመተሳሰር ክስተት መጸዳት በሜዳ ላይ የወባ ትንኞችን ቁጥር ለመቀነስ ትልቅ አቅም ይኖረዋል።
ሴቶች ከወንዶች ከፍተኛ መጠን ያለው የስቴሮይድ ሆርሞኖችን ከተቀበሉ በኋላ የጾታዊ ግንኙነት አቅመ ቢስ ይሆናሉ። ጥናቶች እንደሚያሳዩት ለተጨማሪ ውህደት ችግር የሚፈጠረው 20-ሃይድሮክሲክዳይሶን (20E) ሲሆን በእጭ ደረጃ ላይ የማቅለጫ ዑደት ተቆጣጣሪ በመባል የሚታወቀው የስቴሮይድ ሆርሞን ነው። የወንዶች 20E የማምረት እና የማስተላለፍ ችሎታ በተለይም ሴሊያ7 ንዑስ ዝርያ አካል በሆኑት የአኖፌልስ ዝርያዎች ውስጥ ተሻሽሏል፣ ይህም በአፍሪካ ውስጥ የሚሰራጨው እና አኖፌልስ ጋምቢያን ጨምሮ በጣም አደገኛ የወባ ቬክተሮችን ያካትታል። ይህ በተለይ ትኩረት የሚስብ ነው ምክንያቱም በእነዚህ ዝርያዎች ውስጥ ሴቶች ከእያንዳንዱ የደም ምግብ በኋላ 20E ያመነጫሉ፣ እና 20E የኦጄኔሲስ ዑደትን ይመራል (ማጣቀሻ 8ን ይመልከቱ)። ሆኖም፣ ሴቶች ከሁለት የተለያዩ የኤክዲሲን ምንጮች (የወንድ ዝውውር እና የደም መመገብ ኢንዳክሽን) ምልክቶችን እንዴት እንደሚያዋህዱ ብዙም የሚታወቅ ነገር የለም። እንደ እውነቱ ከሆነ፣ በሴቶቹ የሚመረተው 20E የጾታዊ አለመቻቻልን የሚቀሰቅስ ከሆነ፣ ይህ በድንግል በሚመገቡ ግለሰቦች ላይ መሃንነት ያስከትላል፣ ይህም በእነዚህ ትንኞች ውስጥ በጣም የተለመደ ባህሪ ነው5።
ሊሆን የሚችል ማብራሪያ የኤ. ጋምቢያ ወንዶች የተሻሻለ ወንድ-ተኮር ኤክዲሲን ያስተላልፋሉ፣ ይህም በሴት የመራቢያ ትራክት ውስጥ የምልክት ክምችትን ያነቃቃል፣ ይህም የመራቢያ አለመረጋጋትን ያስከትላል። ሆኖም ግን፣ የጀርባ አጥንት ያላቸው ሰዎች እንደ ኢስትሮጅን እና አንድሮጅን ያሉ በርካታ የስቴሮይድ ሆርሞኖች ቢኖሯቸውም (በማጣቀሻ 9 ላይ የተገመገመ)፣ እኛ እስከምናውቀው ድረስ፣ አንድሮጅኒክ-ባዶ ስቴሮይድ በነፍሳት ውስጥ አልታወቀም።
ሊሆኑ የሚችሉ የሚሻሻሉ ስቴሮይድዎችን ለመፈለግ በጾታዊ የጎለመሱ ኤ. ጋምቢያ ውስጥ ባለው የወንድ ወንድ መለዋወጫ እጢ (MAG) ውስጥ የስቴሮይድ ሆርሞኖችን ስብስብ ለመወሰን ወሰንን። ቀደም ሲል ጥቅም ላይ ከዋለው ያነሰ ልዩ ዘዴ ይልቅ ከፍተኛ አፈፃፀም ያለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊን በመጠቀም፣ በዚህ ቲሹ ውስጥ ኤክዲሲዞን (E) እና 20E ን አግኝተናል፣ ይህም የቀደመውን ውጤት አረጋግጠናል። ሆኖም፣ ናሙናው ከቀመር 3-ዲሃይድሮ-20E-22-ፎስፌት (3D20E22P)12 ጋር በሚጣጣም ኦክሲዴድ ፎስፈረስሌድ ስቴሮይድስ ተቆጣጥሮ ነበር (ምስል 1)። ሌሎች ቅርጾች 3-ዲሃይድሮ-20E (3D20E) እና 20E-22-ፎስፌት (20E22P) ያካትታሉ። የ3D20E22P HPLC-MS/MS የምልክት ጥንካሬ ከዲፎስፈረስሌድ ቅርፁ 3D20E ሁለት የመጠን ደረጃዎች እና ከE እና 20E ሶስት የመጠን ደረጃዎች ከፍ ያሉ ነበሩ (ምስል 1)። ምንም እንኳን በሌሎች የ2D20E ክፍሎች ውስጥ አካል እና የታችኛው የመራቢያ ትራክት (LRT፤ የተራዘመ መረጃ ምስል 1a)። እንዲሁም አዲስ በተዘጉ (ከ1 ቀን በታች) ወንዶች እና ሴቶች ላይ ኤክዳይስቴሮይድ ተንትነናል እና 3D20E እና 3D20E22P በMAG ውስጥ ብቻ አግኝተናል፤ E፣ 20E እና 20E22P በሁለቱም ፆታዎች ውስጥ ተገኝተዋል (የተራዘመ መረጃ ምስል 1ለ)። እነዚህ መረጃዎች የA. gambiae አዋቂ ወንዶች በMAGዎቻቸው ውስጥ በሴቶች ያልተዋሃዱ ከፍተኛ መጠን ያላቸው የሚቀይሩ ሆርሞኖችን እንደሚያመነጩ ይጠቁማሉ።
MAG እና ሴት LRT (አትሪያ፣ ሴሚናል ቬሲክል እና ፓሮቫሪየምን ጨምሮ) ከ4-ቀን (4-ቀን) ድንግል ወንዶች እና ድንግል እና የተጋቡ ሴቶች (0.5፣ 3 እና 12 hpm) ተቆርጠዋል። በእነዚህ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ያለው ኤክዲሲን በHPLC-MS/MS (አማካይ ± ሴም፤ ያልተጣመረ የቲ-ሙከራ፣ ባለ ሁለት ጎን፣ የውሸት ግኝት መጠን (FDR) ተስተካክሏል፤ NS፣ ጉልህ አይደለም፤ *P < 0.05፣ **P < 0.01 . 3D20E: 3 ሰዓታት ከ0.5 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.035; 12 ሰዓታት ከ3 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.0015; 12 ሰዓታት ከ0.5 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.030. 3D20E22P: 3 ሰዓታት ከ0.5 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.25፤ 12 ሰዓታት ከ3 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.0032፤ 12 ሰዓታት ከ0.5 ሰዓታት ጋር ሲነጻጸር፣ P = 0.015)። መረጃው ከሶስት ባዮሎጂካል ቅጂዎች የተወሰደ ነው። ለእያንዳንዱ ፍላጎት ላለው ኤክዲሲን ከፍተኛው ቦታ የተሰላ እና መደበኛ የሆነው በትንኞች ብዛት ነው። ኤክዲሲን እንደሚከተለው በቀለም ይወከላል፡ ኢ፣ አረንጓዴ፤ 20ኢ፣ ብርቱካናማ፤ 20ኢ22ፒ፣ ወይንጠጅ ቀለም፤ 3D20E፣ ሰማያዊ፤ 3D20E22P፣ ሮዝ። ኢንሴቱ ዝቅተኛ የኢክዲሲን መጠን ለማሳየት በy-ዘንግ ላይ ያለውን ልኬት ይጨምራል።
3D20E22P እና 3D20E በጋብቻ ወቅት ይተላለፋሉ ወይ የሚለውን ለመመርመር፣ ከተጋቡ በኋላ በተለያዩ የጊዜ ነጥቦች ላይ የሴት LRTዎችን ቆርጠናል። ምንም እንኳን ኤክዲሲን በቨርጅኖች ውስጥ ባይገኝም፣ ከተጋቡ በኋላ ወዲያውኑ በLRT ውስጥ ከፍተኛ መጠን ያለው 3D20E22P ተመልክተናል (ከጋብቻ በኋላ 0.5 ሰዓት፣ hpm)፣ ከጊዜ በኋላ እየቀነሰ ሲሄድ፣ 3D20E ደረጃዎች በከፍተኛ ሁኔታ ጨምረዋል (ምስል 1)። በኬሚካል የተዋሃደ 3D20Eን እንደ መደበኛ በመጠቀም፣ በማጋባት LRTዎች ውስጥ ያለው የዚህ ስቴሮይድ ሆርሞን መጠን ቢያንስ ከ20E በ100 እጥፍ ከፍ ያለ መሆኑን ወስነናል (የተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 1)። ስለዚህ፣ 3D20E22P በማጋባት ጊዜ ወደ ሴት LRT የሚተላለፈው ዋና የወንድ ኤክዲሲን ሲሆን፣ ዲፎስፈረስ የተገኘበት ቅርፁ፣ 3D20E፣ ከተጋቡ በኋላ ብዙም ሳይቆይ በጣም የበዛ ይሆናል። ይህ ለኋለኛው ኤክዲሲን በሴት ከጋብቻ በኋላ ባዮሎጂ ውስጥ አስፈላጊ ሚና እንዳለው ይጠቁማል።
አዲስ የRNA ቅደም ተከተል (RNA-seq) የውሂብ ስብስብ (ምስል 2a) ካመነጨን በኋላ፣ ብጁ የተገነባ የባዮኢንፎርማቲክስ ቧንቧን በመጠቀም፣ ኤክዲሲሶን ኪናሴ (EcK)፣ ኤክዲሲሶን ኦክሲዳሴ (EO) እና ኤክዲሲሶን ኢንኮዲንግ 20E-የተሻሻለ ፎስፋታሴ ጂን ፈልገናል።EPP) በመራቢያ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ይገለጻል። አንድ እጩ የEPP ጂን እና ሁለት ሊሆኑ የሚችሉ የECK ጂኖችን (EcK1 እና EcK2) ለይተናል፣ ነገር ግን ጥሩ እጩ የEO ጂን ማግኘት አልቻልንም። በተለይም፣ የግለሰብ የEPP ጂኖች በጋምቢያ MAGs ውስጥ በከፍተኛ ደረጃ (98.9ኛ ፐርሰንታይል) ተገልጸዋል ነገር ግን በሴት LRTs ውስጥ አልተገለጹም (ምስል 2ለ)፣ ይህም የ3D20E22P ዲፎስፈረስሽን በዚህ የሴት ቲሹ ውስጥ ከተከሰተበት ጊዜ ጀምሮ ከጠበቅነው በተቃራኒ ነው። ስለዚህ፣ የወንድ EPP በሚጋቡበት ጊዜ ሊተላለፍ እንደሚችል እናምናለን። በእርግጥም፣ ከተጋቡ በኋላ የሴት ፕሮቲንን ለመሸፈን በቪቮ የተረጋጋ አይሶቶፕ መለያ ተጠቅመናል፣ ይህም በሴት አትሪየም ውስጥ በኤምኤስ የተገለጸ ኢንዛይም ነው (ምስል 2ሐ እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 1)። በMAG ውስጥ የ EPP መኖር እና የተጣመሩ (ግን ድንግል ያልሆኑ) ሴት LRT መኖራቸውም በተወሰኑ ፀረ እንግዳ አካላት (ምስል 2d) ተረጋግጧል።
ሀ፣ የእያንዳንዱን ጾታ የመራቢያ ሕብረ ሕዋሳት Ecks፣ EOs እና EPPs የሚያካትቱ ጂኖችን ለመፈለግ ብጁ የተገነባ የባዮኢንፎርማቲክስ ቧንቧ። ከቀስቶቹ አጠገብ ያሉት ቁጥሮች በእያንዳንዱ ደረጃ የወንድ እና የሴት እጩዎችን ቁጥር ያመለክታሉ። ይህ ትንተና በወንዶች ውስጥ የሚገለጹ አንድ EPP ጂን (EPP) እና አንድ Eck ጂን (EcK1) እና በሁለቱም ፆታዎች ውስጥ የሚገለጽ ነገር ግን እጩ EO የማያመጣ አንድ Eck ጂን (EcK2) ለይቷል። b፣ የእጩ ጂን አገላለጽን በድንግል (V) እና በማጣመር (M) አኖፌልስ ጋምቢያ እና አኖፌልስ አልቢካንስ ቲሹዎች። ስፓካ፣ ማዳበሪያ፤ MAGs፣ በወንዶች ውስጥ ተጨማሪ እጢዎች፤ ሌሎች የሰውነት ክፍሎች፣ ጡቶች፣ ክንፎች፣ እግሮች፣ የስብ አካላት እና የውስጥ አካላት በሁለቱም ፆታዎች እና በሴቶች ላይ ያሉ ኦቫሪዎችን ጨምሮ። EcK2 በጋምቢያ MAG እና Atria ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ይገለጻል፣ EPP ደግሞ በMAG.c ውስጥ ብቻ ይገኛል፣ የወንድ የዘር ፈሳሽ ቡድን ወደ ሴት አትሪያ ትራንስሎኬሽን ፕሮቲዮሚክ ትንተና በ3፣ 12 እና 24 hpm ሲሆን ይህም 67ቱን በጣም የበለፀጉ ፕሮቲኖችን ያሳያል። ሴቶች ሁሉንም ፕሮቲኖች ለመሰየም (እና ለመሸፈን) 15N በያዘ አመጋገብ ላይ ያድጋሉ። መለያ ያልተሰጣቸው ወንዶች ከታጌጡ ሴቶች ጋር ተጣምረዋል፣ እና ሴት LRTዎች ለፕሮቲዮሚክ ትንተና በ3፣ 12 እና 24 hpm ተቆርጠዋል (ሙሉ የወንድ የዘር ፈሳሽ ፕሮቲኖችን ዝርዝር ለማግኘት ተጨማሪ ሰንጠረዥ 1ን ይመልከቱ)። ኢንሴት፣ EPP፣ Eck1 እና Eck2 በድንግል ወንዶች MAG ውስጥ በእነዚህ ቲሹዎች ፕሮቲዮሚክ ትንተና ተገኝተዋል። EPP በዌስተርን ብሎት በ MAG እና LRT በተጣመሩ ሴቶች ተገኝቷል፣ ነገር ግን በድንግል ሴቶች ወይም በወንዶች ወይም በቀሪው የሴት አካል ውስጥ አይደለም። ሽፋኖች በአንድ ጊዜ ተፈትሸዋል በፀረ-አክቲን (የመጫኛ መቆጣጠሪያ) እና በፀረ-ኢፒፒ ፀረ እንግዳ አካላት። ሁሉም ወንዶች ድንግል ናቸው። ለጄል ምንጭ መረጃ ተጨማሪ ምስል 1ን ይመልከቱ። የዌስተርን ብሎትስ ሁለት ጊዜ ተከናውነዋል እና ተመሳሳይ ውጤቶች አሏቸው።
የኢፒፒ ኤክዳይስቴሮይድ ፎስፎስፋታሴ እንቅስቃሴ በHPLC-MS/MS ከተበተነ በኋላ ከMAG ተለይቷል (የተራዘመ መረጃ ምስል 2a)። በተጨማሪም፣ ኢፒፒን በRNA-መካከለኛ ጣልቃ ገብነት (RNAi) ጸጥ ስናደርግ፣ በእነዚህ ወንዶች የመራቢያ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የፎስፋታሴ እንቅስቃሴ ከፍተኛ ቅነሳ አግኝተናል (ምስል 3a)፣ እና ከኢፒፒ-ዝምታ ከተሞሉ ወንዶች ጋር የተጣመሩ ሴቶች ጉልህ አሳይተዋል። በከፊል የጂን ዝምታ ቢኖርም ዝቅተኛ የዲፎስፎሪሌትድ 3D20E መጠን (ምስል 3ለ) (የተራዘመ መረጃ ምስል 2ለ፣ሐ)። በአንጻሩ፣ በተመሳሳይ ትንኞች ውስጥ በ20E22P/20E ጥምርታ ላይ ጉልህ ለውጦችን አላስተዋልንም፣ ይህም ኢንዛይሙ ለ3D20E22P የተወሰነ መሆኑን ሊያመለክት ይችላል (ምስል 3ለ)።
a, በ MAG ውስጥ ባለ ሁለት ድርብ ድርብ EPP RNA (dsEPP) ወይም ባለ ሁለት ድርብ ድርብ GFP RNA (dsGFP) መቆጣጠሪያዎችን በመጠቀም በ EPP ዝምታ ምክንያት የተፈጠረ የፎስፋታሴ እንቅስቃሴ ቀንሷል። በእያንዳንዱ ቅጂ ውስጥ ሃያ የ MAG ገንዳዎች ጥቅም ላይ ውለዋል (P = 0.0046፣ የተጣመሩ የቲ-ሙከራ፣ ባለ ሁለት ጎን)፣ በተለያዩ ነጥቦች የተወከሉ።b፣ ከ EPP ጸጥታ ከተሞሉ ወንዶች ጋር የተጣመሩ ሴቶች በ3 hpm (P = 0.0043፣ ያልተጣመሩ የቲ-ሙከራ፣ ባለ ሁለት ጎን)፣ የ20E ደረጃዎች ግን አልተነኩም (P = 0.063፣ ያልተጣመሩ)። t-test፣ ባለ ሁለት ጎን)። መረጃው እያንዳንዳቸው 13፣ 16 እና 19 ሴቶችን ከያዙ ሶስት ገንዳዎች እንደ አማካይ ± ሴም ቀርቧል። c፣ ከ EPP-ዝምታ ካላቸው ወንዶች ጋር የተጋቡ ሴቶች በከፍተኛ ሁኔታ ከፍተኛ የሆነ የዳግም ጓደኝነት መጠን ነበራቸው (P = 0.0002፣ የፊሸር ትክክለኛ ሙከራ፣ ባለ ሁለት ጎን)። ሴቶች በመጀመሪያ የመጋባት ሁኔታቸውን ለማረጋገጥ እንዲጋቡ ተገድደዋል፤ ከሁለት ቀናት በኋላ፣ የትራንስጂን ጂን በመጠን PCR በመለየት የዳግም ማጣመር መጠንን ለመገምገም ከሌሎች ትራንስጀንሲክ የወንድ የዘር ፍሬ ተሸካሚ ወንዶች ጋር ተገናኝተዋል። ከ EPP-ዝምታ ካላቸው ወንዶች ጋር የተጋቡ ደም የሚጠቡ ሴቶች የመራባት መጠን በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (P < 0.0001፤ የማን-ዊትኒ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን) እና በትንሹ የቀነሰ የእንቁላል ቁጥር (P = 0.088፣ የማን-ዊትኒ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን)፣ የመራባት መጠን ግን አልተነካም (P = 0.94፣ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን)። በሁሉም ፓነሎች፣ n ባዮሎጂያዊ ገለልተኛ የሆኑ የወባ ትንኝ ናሙናዎችን ቁጥር ይወክላል።NS፣ ጉልህ አይደለም።*P < 0.05፣ **P < 0.01፣ ***P < 0.001፣ ****P < 0.001።
ቀጥሎ፣ ኤክዲስዮን ዲፎስፎሪሌሽን በሴቶች ላይ የመተሳሰር መቋቋምን ለማነሳሳት አስፈላጊ መሆኑን ገምግመናል። በተለይም፣ ከኢፒፒ የተሟሉ ወንዶች ጋር የተጣመሩ ሴቶች ከቁጥጥር ሴቶች (10.4%) ጋር ሲጋለጡ በከፍተኛ ድግግሞሽ (44.9%) እንደገና ተገናኝተዋል (ምስል 3ሐ)። በተጨማሪም የመራባት መጠን በከፍተኛ ሁኔታ መቀነስ (ምስል 3d፣ ግራ) እና በእነዚህ ሴቶች የተጣበቁ እንቁላሎች ብዛት ላይ ትንሽ መቀነስ አስተውለናል (ምስል 3d፣ መካከለኛ)፣ በሴቶች የተጣበቁ እንቁላሎች መቶኛ (በሴቶች መካከል በመተሳሰር የተከሰተ ሌላ ምላሽ)) አልተጎዳም (ምስል 3d፣ ቀኝ)። ለ3D20E22P የታየውን የEPP ልዩነት ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ እነዚህ ውጤቶች በጋብቻ ወቅት በሚተላለፈው EPP የ3D20E ማግበር የሴቶችን ተቀባይነት ወደ ተጨማሪ ጋብቻ በማጥፋት ረገድ ትልቅ ሚና ሊጫወት እንደሚችል ይጠቁማሉ፣ ይህም ቀደም ሲል ለ20E የግብረ ሥጋ ግንኙነት ዝውውር የተነገረ ባህሪ ነው። ስለዚህ፣ ይህ የወንድ-ተኮር ሆርሞን በሴቶች የመራባት ችሎታ ላይም ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራል።
ቀጥሎ፣ በኬሚካል የተዋሃደ 3D20E (ምስል 4a–c) እና ለንግድ አገልግሎት የሚውሉ 20Eን በመጠቀም በጾታዊ የጎለመሱ ድንግልናዎች ላይ የ20E እና 3D20E እንቅስቃሴዎችን በመርፌ ሙከራዎች አነጻጽረናል። 3D20E በሁለቱም ክምችቶች ላይ የሴቶችን ስሜታዊነት በመቀነስ ከ20E በእጅጉ የበለጠ ውጤታማ መሆኑን አስተውለናል (ምስል 4መ)። በተለይም፣ በLRT ውስጥ ያለው የ3D20E ግማሽ የፊዚዮሎጂ ደረጃ (1,066 pg ከመርፌ በኋላ ከ2,022 pg ከመርፌ በኋላ ከተደረገ) ከ24 ሰዓታት በኋላ ከፍተኛውን ክምችት ከመርፌ በኋላ ከነበረው የ20E (361 pg ከመርፌ በኋላ) ከፊዚዮሎጂ ደረጃ በ20 እጥፍ ከፍ ያለ የመቃወም ሴቶችን መጠን አስከትሏል። የተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 1)። ይህ ውጤት የ20E የወሲብ ዝውውር የወንድና የሴት ግንኙነትን የማያስተጓጉል ወቅቶችን እንደማያስከትል ከሚገልጸው አስተሳሰብ ጋር የሚጣጣም ሲሆን በተጨማሪም 3D20E የወላጅና የልጅ ግንኙነትን ለማረጋገጥ እንደ ዋና ምክንያት ይጠቁማል። 3D20E በድንግል ሴቶች ላይ በእንቁላል መጣል ምርመራዎች ውስጥ ከ20E የበለጠ ንቁ ነበር (ምስል 4e)፣ ይህም ከፊል የEPP ጸጥታ ከተፈጠረ በኋላ የተመለከትነው መደበኛ የእንቁላል መጣል መጠን አሁንም በማጅንግ ምክንያት በሚፈጠሩ የሴቶች ምክንያቶች የሚመነጨው የ3D20E እንቅስቃሴ በመኖሩ ምክንያት እንደሆነ ይጠቁማል።
(a,b) ከ20E በኬሚካል የተዋሃደ 3D20E (a) በጣም ከፍተኛ ልወጣ/ቅልጥፍና ያለው (ከሶስት ገለልተኛ የውህደት ምላሾች አማካይ ± ሴም ሆኖ የቀረበ መረጃ) (b).c፣ የጅምላ ስፔክትረም (የታችኛው ግማሽ) በተጋቡ ሴት LRT (የላይኛው ግማሽ) ውስጥ የሚገኘውን ኤክዲሲሶን በትክክል ይዛመዳል።d፣ ከ20E (0.63 µg፣ P = 0.02፤ 0.21 µg፣ P < 0.0001፤ የፊሸር ትክክለኛ ሙከራ፣ ባለ ሁለት ጎን) እና 10% ኤታኖል (0.63 µg፣ P < 0.0001፤ 0.21 µg፣ P < 0.0001፤ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን) ጋር ሲነጻጸር፣ 20E ከቁጥጥር በእጅጉ ከፍ ያለ ሲሆን በከፍተኛ መጠን ብቻ (0.63 µg፣ P = 0.0002፤ 0.21 µg፣ P = 0.54፤ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ ሙከራ፣ ባለ 2-ጎን)።e፣ የ3D20E መርፌ በድንግል ሴቶች ላይ ከ10% የኢታኖል መቆጣጠሪያዎች ይልቅ በከፍተኛ ሁኔታ ከፍ ያለ የመራቢያ መጠን አስከትሏል (0.21 µg፣ P < 0.0001፤ 0.13 µg፣ P = 0.0003፤ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን)፣ 20E ደግሞ ከመቆጣጠሪያዎች ጋር ሲነጻጸር። በከፍተኛ መጠን ብቻ (0.21 µg፣ P = 0.022፤ 0.13 µg፣ P = 0.0823፤ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን)።3D20E በከፍተኛ መጠን ከ20E በላይ በከፍተኛ መጠን ከፍ ያለ የመራቢያ መጠን አስከትሏል (0.21 µg፣ P = 0.0019፤ 0.13 µg፣ P = 0.075፤ የፊሸር ትክክለኛ ምርመራ፣ ባለ ሁለት ጎን)። በሁሉም ፓነሎች ውስጥ፣ n የባዮሎጂያዊ ገለልተኛ የወባ ትንኝ ናሙናዎችን ቁጥር ይወክላል።NS፣ ጉልህ አይደለም።*P < 0.05፣ **P < 0.01፣ ***P < 0.001፣ ****P < 0.001.መረጃው ከሶስት ቅጂዎች የተወሰደ ነው።
ቀደም ባሉት ጥናቶች፣ የስቴሮይድ ሆርሞኖች የግብረ ሥጋ ግንኙነት ዝውውር MISO (የማጣመር-ኢንዱሴንትድ አነቃቂ ኦፍ Oogenesis 11) እንዲገለጽ እንደሚያደርግ ወስነናል። የኤ. ጋምቢያ ሴቶችን ከፒ. ፋልሲፓረም ኢንፌክሽን የሚከላከል የሴት የመራቢያ ጂን ነው። በ13 የሚመጣ የጤና ወጪ፣ ገዳይ የሆነው የሰው ወባ ፓራሳይት። MISO በወባ በሽታ በተያዙ አካባቢዎች ለአኖፌሎች የመራቢያ ብቃት ያለውን ጠቀሜታ ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የትኛው ሆርሞን 3D20E ወይም 20E የዚህን ጂን አገላለጽ እንደሚያነቃቃ ለመወሰን ወስነናል። 20E መርፌ በተለይ ወይም የበለጠ ኃይለኛ እንደ HR3 እና HR4 ያሉ አንዳንድ የኑክሌር ሆርሞን ተቀባዮች (HR) እና እንደ yolkogenic ጂኖች Vg14፣ 15፣ 16 ያሉ የተለመዱ የታችኛው የስቴሮይድ ኢላማዎችን ሲያነሳሳ፣ MISO በ3D20E የበለጠ ጠንካራ ሆኖ ተገኝቷል (የተራዘመ የውሂብ ምስል 3)። ስለዚህ፣ የዚህ አንድሮጅኒክ ስቴሮይድ ሆርሞን የግብረ ሥጋ ግንኙነት ዝውውር ሴቶችን ከፓራሳይቲክ ኢንፌክሽን ከሚመጡ ወጪዎች የሚከላከሉ ዘዴዎችን የሚያነሳሳ ይመስላል። በተጨማሪም፣ 3D20E በሁለቱም የአይሶፎርሞች ላይ ልዩነት ይነካል። የኢ ተቀባይ ኢክአር (EcR-A)፣ EcR-Aን በማነሳሳት እና EcR-Bን በመጨቆን እና በሴቶች የመራባት ችሎታ ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድር HPX15ን ጨምሮ ሌሎች የትዳር ጓደኛን የሚያነቃቁ ጂኖችን በብርቱ ያስነሳል። ይህ ከEPP-ዝምታ ባላቸው ወንዶች ጋር በተጣመሩ ሴቶች ላይ የሚታየውን ጉልህ የሆነ የመሃንነት መጓደል ሊያብራራ ይችላል (የተራዘመ የውሂብ ምስል 3)። እነዚህ መረጃዎች በጾታዊ ተኮር ተግባር ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድሩ የሚችሉ ሁለት የኤክዲሲዞን ሆርሞኖች የሚንቀሳቀሱ የታችኛው መንገዶች መኖራቸውን ያመለክታሉ።
ቀጥሎም፣ በባዮኢንፎርማቲክስ ቧንቧችን ውስጥ የተለዩትን ሁለቱን የEck ጂኖች ተግባር ሞክረናል። EcK1 ወይም EcK2ን ዝም ማለት በወንዶች ላይ ከፍተኛ ሞት አስከትሏል (የተራዘመ የውሂብ ምስል 4a)፣ ይህም ኤክዲሲን ፎስፈረስሌሽን እና በዚህም ምክንያት እንቅስቃሴ አለማድረግ ለመትረፍ አስፈላጊ መሆኑን ይጠቁማል። EcK2 ከEcK1 በላይ በሆኑ ደረጃዎች የተገለጠ እና በፕሮቲዮሚክስ ውስጥ በMAGs ውስጥ የተገኘ ስለሆነ (ምስል 2b፣c እና ተጨማሪ ሰንጠረዥ 2)፣ የecdysteroid kinase እንቅስቃሴውን በ20E በማሳደግ አረጋግጠናል፣ ይህም ፎስፈረስሌሽን 20E22P አስከትሏል (የተራዘመ የውሂብ ምስል 2)።4b። 3D20Eን እንደ ንጣፍ ስንጠቀም፣ ፎስፈረስሌሽን የተደረገበትን ምርት 3D20E22P (የተራዘመ የውሂብ ምስል 4c) ማግኘት አልቻልንም፣ ይህም ከ3D20E ይልቅ 20E የEck2 ተመራጭ ኢላማ ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማል።
በRNA-seq ትንታኔያችን መሠረት፣ EcK2 በድንግል ሴቶች LRT ውስጥም በከፍተኛ ሁኔታ ተገልጿል፣ ከተጋቡ በኋላም ጠፍቷል (ምስል 2ለ)። እነዚህን መረጃዎች አረጋግጠናል እና የEcK2 አገላለጽ በደም መመገብ እንደማይጎዳ ደርሰንበታል (የተራዘመ የውሂብ ምስል 5a)። የመጀመሪያዎቹን የMS ሙከራዎችን በማራዘም፣ የ20E22P ጫፍ ከ20E ጫፍ (ከደም ምግብ በኋላ ከ22-26 ሰዓታት በኋላ፤ የተራዘመ መረጃ ምስል 5ለ) ጋር በቅርበት የተያያዘ መሆኑን ደርሰንበታል። በድንግል ሴቶች ላይ የEcK2 ዝምታ ከደም ምግብ በኋላ በ26 ሰዓታት ውስጥ ከ20E እስከ 20E22P አንጻራዊ ጥምርታ በ3 እጥፍ እንዲጨምር አድርጓል (የተራዘመ የውሂብ ምስሎች 2c እና 5c)፣ ይህም EcK2 በሴቶች ላይ 20E ፎስፈረስንም እንደሚያመጣ ያረጋግጣል። በተለይም፣ EcK2-የተሟጠጡ ድንግል ሴቶች ሙሉ የወሲብ ተቀባይነት ነበራቸው (የተራዘመ መረጃ ምስል 5d,e)፣ ይህም የ20E የሴት ምርት የማርባት መቃወሚያ ጊዜዎችን እንደማያመጣ ይጠቁማል። ሆኖም፣ እነዚህ ሴቶች ከቁጥጥር ጋር ሲነፃፀሩ የእንቁላል መጣል መጠን በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል፣ ከ30% በላይ የሚሆኑት ድንግል እንቁላሎችን ይጥላሉ (የተራዘመ መረጃ ምስል 5f)። ደም ከተመገቡ በኋላ ድርብ-ክር ያለው Eck2 RNA (dsEcK2) መርፌዎች ከተደረጉ፣ መራባት አልተከሰተም፣ በዚህ ጊዜ በደም መምጠጥ ምክንያት የ20E ጫፍ ቀንሷል። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች ደም ከመምጠጥ በኋላ የሚፈጠረው 20E መራባትን ሊያመጣ የሚችል ሞዴልን ይደግፋሉ፣ ነገር ግን የመራባት እገዳ (EcK2 እና ምናልባትም ሌሎች ምክንያቶች) በማጣመር ሲጠፉ ብቻ። 20E ወይም 3D20E መርፌዎች በድንግልናዎች ውስጥ የEck2 አገላለጽን አልከለከሉም (የተራዘመ መረጃ ምስል 5g)፣ ይህም ሌሎች ምክንያቶች የዚህን ኪናሴ መከልከል እንደሚያስችሉ ይጠቁማል። ሆኖም፣ ደም ከተመገቡ በኋላ የ20E ደረጃዎች የመራባት ምቾት ማጣትን ለማነሳሳት በቂ አልነበሩም፣ ነገር ግን በጾታዊ ግንኙነት በሚተላለፉ 3D20E ከፍተኛ ደረጃዎች ውጤታማ በሆነ መንገድ ተነሳስተው ነበር።
ውጤቶቻችን የኤ. ጋምቢያe የመራቢያ ስኬትን የሚቆጣጠሩትን ዘዴዎች በተመለከተ ጠቃሚ ግንዛቤዎችን ይሰጣሉ። ወንዶች ከፍተኛ መጠን ያለው 3D20E እንዲዋሃዱ ያደረጉበት ሞዴል ብቅ ብሏል፣ ይህም ወንዶች ሴቶችን ለተጨማሪ ወሲብ በመተው የወላጅነት ስሜትን በማዳከም የወላጅነት ዋስትና የሚሰጥ ወንድ-ተኮር ኤክዲሲን ነው። በተመሳሳይ ጊዜ፣ እነዚህ የወባ ቬክተሮች ለወንዶች-ተኮር EPP የግብረ ሥጋ ግንኙነት ምላሽ ለመስጠት በሴቶች ላይ 3D20Eን ለማግበር ውጤታማ ስርዓት አዘጋጅተዋል። እስከምናውቀው ድረስ፣ ይህ በነፍሳት ውስጥ ልዩ እና ወሳኝ ተግባር የሚያከናውን ወንድ እና ሴት የሚመራ የስቴሮይድ ሆርሞን ስርዓት የመጀመሪያው ምሳሌ ነው። ወንድ-ተኮር ኤክዲሲን ተግባር ተዘርዝሯል ነገር ግን በእርግጠኝነት አልተረጋገጠም። ለምሳሌ፣ በአብዛኛው ያልተካተተ መላምት 18 እነዚህ ተግባራት በ20E ቅድመ ሁኔታ E1 ሊከናወኑ እንደሚችሉ ነው። በድሮሶፊላ ውስጥ፣ ሞናንድሪ የሚቀሰቀሰው ከነርቮች ጋር በሚገናኙ ትናንሽ የወሲብ ፔፕታይዶች19፣20 የወሲብ ዝውውር ሲሆን ይህም በተወሰኑ የጾታ ፔፕታይድ ተቀባዮች በኩል የሴትን የመራቢያ ትራክት የሚያነቃቁ ነርቮች 21፣22 ነው። የታችኛውን ምልክት ለመወሰን ተጨማሪ ስራ ያስፈልጋል። በኤ. ጋምቢያ ሴቶች ውስጥ በ3D20E የሚቆጣጠሩት ቋጥኞች እና እነዚህ ቋጥኞች በትንኞች እና በድሮሶፊላ መካከል ሊጠበቁ ይችሉ እንደሆነ ለማወቅ።
በጥናታችን ውስጥ በተለዩት የሴቶች የመራባት እና ባህሪ ላይ የ3D20E ውህደት እና ማግበርን የሚያመጡ መንገዶች ለወደፊቱ የትንኝ መቆጣጠሪያ ስልቶች አዳዲስ እድሎችን ይሰጣሉ፣ ለምሳሌ በጸዳ የነፍሳት ቴክኖሎጂ ስልቶች ውስጥ ተወዳዳሪ የጸዳ ወንዶችን ማመንጨት። ለዱር ልቀት ይጠቀሙ ወይም በድንግል ጨዋታ ውስጥ 3D20Eን ለመምሰል ይጠቀሙ። የ3D20E ወንድ-ተኮር ተግባር የኤ. ጋምቢያ እና ሌሎች የሴሊያ ዝርያዎች የወንድ የዘር ፍሬያቸውን ወደ ማጣመር መሰኪያዎች የመቀላቀል ችሎታ ሲያገኙ ሊሆን ይችላል፣ ምክንያቱም ይህ ብዙ ቁጥር ያላቸውን ሆርሞኖች እና ሆርሞን-አነቃቂ ኢንዛይሞችን በብቃት ለማስተላለፍ ያስችላል። በተራው፣ የ3D20E ዝግመተ ለውጥ ተግባራዊ የሆነው ሞናንድሪ ለሴቶች (በከፍተኛ የMISO መግለጫ) የመራቢያ ብቃትን በከፍተኛ የወባ ስርጭት አካባቢዎች እንዲደግፉ የሚያስችል ዘዴ ይሰጣል፣ ይህም በተዘዋዋሪ ለፕላዝሞዲየም ስርጭት አስተዋጽኦ ያደርጋል። የሴት 20E በሴት አኖፌልስ ትንኞች ውስጥ የፒ. ፋልሲፓረም ህልውና እና እድገት ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ከተረጋገጠ፣24 የወንድ እና የሴት የስቴሮይድ ሆርሞን መንገዶች አሁን የወባ-ጥገኛ ግንኙነቶች ቁልፍ ገጽታዎች ናቸው።
ኤ. ጋምቢያe G3 ዝርያዎች በመደበኛ የነፍሳት ሁኔታዎች (26-28 °C፣ 65-80% አንጻራዊ እርጥበት፣ 12:12 ሰዓት የብርሃን/ጥቁር ፎቶፔሪዮይድ) ስር ያድጋሉ። እጭዎቹ በዱቄት የዓሳ ምግብ (ቴትራሚን ትሮፒካል ፍሌክስ፣ ኮይ ፔሌትስ እና ቴትራ ፖንድ ስቲኮች በ7:7:2 ጥምርታ) ተመግበዋል። የአዋቂ ትንኞች 10% የዴክስትሮዝ መፍትሄ እና ሳምንታዊ የሰው ደም ተመግበዋል (የደም ክፍሎችን ያጠኑ)። ድንግል ትንኞች የተገኙት ጫፎቹን በማይክሮስኮፒ ከመረመሩ በኋላ በፑል ደረጃ ላይ ያሉትን ፆታዎች በመለየት ነው። የዲኤስሬድ ትራንስጂን የያዙ ወንዶች ቀደም ሲል ተገልጸዋል።
ቀደም ሲል በተገለጹት ፕሮቶኮሎች መሠረት የግዳጅ የማጣመር ሙከራዎች ተከናውነዋል። ለተፈጥሮ ማጣመር፣ የ4 ቀን ድንግል ሴቶች ከጾታዊ የጎለመሱ ድንግል ወንዶች ጋር ለሁለት ምሽቶች በ1፡3 ጥምርታ ውስጥ ተጠብቀዋል። ወንዶች በ dsEPP መርፌ የተወጉባቸው ሙከራዎች፣ አብሮ ማጣመር ከመርፌ በኋላ ባሉት 3-4 ቀናት ውስጥ የፎስፌትዝ እንቅስቃሴ በከፍተኛ ሁኔታ ጸጥ እንዲል ከተደረገበት ጊዜ ጋር ይገጣጠማል (የተራዘመ መረጃ ምስል 2ለ)።
የትንኝ ሕብረ ሕዋሳት፣ የቀሩት ሬሳዎች (የሰውነት ቀሪው ክፍል) ወይም መላው አካል ወደ 100% ሜታኖል ተበታትነው በቢደር (2 ሚሜ የመስታወት ዶቃዎች፣ 2,400 rpm፣ 90 ሰከንድ) ተቀላቅለዋል። የቲሹ መጠን እና የሜታኖል መጠኖች እንደሚከተለው ነበሩ፡ የሰውነት ቀሪው ክፍል፣ 50 በ1,000 µl፤ MAG፣ 50–100 80 µl፤ ሴት LRT፣ 25–50 80 µl። ዝናብ በተመሳሳይ የሜታኖል መጠን ለሁለተኛ ጊዜ ሜታኖል እንዲወጣ ተደርጓል። የሕዋስ ፍርስራሾች በሴንትሪፉጌሽን ተወግደዋል። ከሁለቱም ማውጣት የተገኘው ሜታኖል በናይትሮጅን ፍሰት ስር ተጣምሮ ደርቋል፣ ከዚያም በውሃ ውስጥ በሚከተሉት 80% ሜታኖል መጠኖች እንደገና ተዘግቷል፡ የሰውነት ቀሪው ክፍል፣ 50 µl፤ MAGs እና ሴት LRT፣ 30 µl።
ናሙናዎቹ ከኤልሲ መሳሪያ (ቫንኪሽ፣ ቴርሞ ፊሸር) ጋር በተጣመረ የጅምላ ስፔክትሮሜትር (ID-X፣ Thermo Fisher) ላይ ተተነተኑ። 5 µl ናሙና በ25 °ሴ በተጠበቀ 3 µm፣ 100 × 4.6 ሚሜ አምድ (Inspire C8፣ Dikma) ላይ ተወግቷል። የኤልሲ ተንቀሳቃሽ ደረጃዎች A (ውሃ፣ 0.1% ፎርሚክ አሲድ) እና B (አሴቶኒትሪል፣ 0.1% ፎርሚክ አሲድ) ነበሩ። የኤልሲ ቅልመት እንደሚከተለው ነበር፡ 5% B ለ1 ደቂቃ፣ ከዚያም በ11 ደቂቃዎች ውስጥ ወደ 100% B ጨምሯል። ከ8 ደቂቃዎች በ100% ከቆዩ በኋላ፣ አምዱን በ5% B ለ4 ደቂቃዎች እንደገና ያስተካክሉት። የፍሰት መጠኑ 0.3 ሚሊ ሊትር ደቂቃ-1 ነበር። በኤምኤስ ምንጭ ውስጥ ያለው አዮኔዜሽን የሚከናወነው በአዎንታዊ እና አሉታዊ ሁነታዎች በሚሞቅ ኤሌክትሮስፕሬይ አዮኔዜሽን ነው።
የጅምላ ስፔክትሮሜትር በ m/z ክልል ውስጥ ያለውን መረጃ የሚለካው በ 60,000 ጥራት በ 60,000 ጥራት በ MS ሁነታ ነው። የ MS/MS መረጃ በ [M + H]+ (ሁሉም ኢላማዎች)፣ [M - H2O + H]+ (ሁሉም ኢላማዎች) እና [M - H]- (ፎስፈረስ የተገጠመላቸው ኢላማዎች) ላይ ነው። የ MS/MS መረጃ ምንም መስፈርት ያልነበረባቸው ኢላማዎች የኢክዳይሶን ባህሪያትን ለማረጋገጥ ጥቅም ላይ ውሏል። ኢላማ ያልሆኑ ኢክዳይስቴሮይድዎችን ለመለየት፣ ከ15% አንጻራዊ ብዛት ያላቸው ሁሉም የ HPLC ጫፎች የ MS/MS መረጃ ተተነተነ። ከንጹህ ደረጃዎች (20E፣ 3D20E) የተፈጠሩ መደበኛ ኩርባዎችን በመጠቀም ይለካሉ፣ ይህም የአንድ የተወሰነ ናሙና (ሌሎች ኢላማዎች) ፍፁም መጠኖችን ወይም ዲሉሽንዎችን ለማስላት በአንድ ወንድ ውስጥ ከሚገኙት መጠኖች ጋር ያላቸውን እኩልነት ለማስላት ነው። ለ 3D20E፣ መጠኑ የተከናወነው የሚከተሉትን ተጨማሪዎች ድምር በመጠቀም ነው፡ [M + TFA]-፣ [M + COOH]-፣ [M + Na]+፣ [M + Cl]-፣ [M + NO3]-.መረጃው የተወሰደው እና የተለካው በትሬሲፋይንደር (ስሪት 4.1) በመጠቀም ነው። የMS/MS መረጃ የተተነተነው Xcalibur (ስሪት 4.4) በመጠቀም ነው። የE፣ 20E እና 3D20E የMS ስፔክትራ ከየራሳቸው ደረጃዎች ጋር ተነጻጽሯል። 3D20E22P በጂራርድ ሪአጀንት በዲሪቫታይዜሽን ተተነተነ።20E22P በ m/z ጥምርታ ተተነተነ።
3D20E22P ከMAG ተጠርጓል። ማጣሪያው የተከናወነው እጅግ በጣም ጥሩ በሆነ ፈሳሽ ክሮማቶግራፍ (Acquity፣ Waters) በመጠቀም ከHPLC-MS/MS ትንተና ጋር ተመሳሳይ በሆነ የLC ሁኔታዎች ስር ባለአራት ፖል ጅምላ-ተኮር መመርመሪያ (QDa፣ Acquity፣ Waters) በመጠቀም በትንታኔ ደረጃ ነው። የክፍልፋይ ስብስብ የተነቃቃው ከ3D20E22P ጋር የሚዛመደው m/z ቀደም ሲል እንደተወሰነው በተመሳሳይ የማቆያ ጊዜ ሲገኝ ነው። የተወጡት ውህዶች ንፅህና ከላይ እንደተገለጸው በHPLC-MS/MS ተረጋግጧል።
ጠቅላላ አር ኤን ኤ ከ10-12 የመራቢያ ሕብረ ሕዋሳት ወይም ሌሎች የሰውነት ክፍሎች (ራስ አልባ) የTRI reagent (Thermo Fisher) በመጠቀም የተገኘ ሲሆን የአምራቹን መመሪያ ተከትሎ ነው። አር ኤን ኤ በTURBO DNase (Thermo Fisher) ታክሟል። cDNA የተመረተው በአምራቹ መመሪያ መሠረት በሞሎኒ ሙሪን ሉኪሚያ ቫይረስ ተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕሴዝ (M-MLV RT፤ Thermo Fisher) በመጠቀም ነው። የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕሽን ኳንቲዩቲካል PCR (RT-qPCR፤ የተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2) ፕሪመሮች ቀደም ሲል ታትመዋል24 ወይም በPrimer-BLAST26 በመጠቀም የተነደፉ ነበሩ፣ ከ70-150 bp መጠን እና የኤክሶን-ኤክሶን መጋጠሚያዎች ወይም የፕራይመር ጥንድ ፕሪመሮች ላይ ቅድሚያ ተሰጥቷቸዋል። ከሶስት እስከ አራት ባዮሎጂካል ቅጂዎች የተወሰዱ የcDNA ናሙናዎች ለRT-qPCR በውሃ ውስጥ አራት እጥፍ ተቀልጠዋል። መጠኑ 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher)፣ ፕሪመሮች እና 5 µl የተደባለቀ cDNA በያዙ 15 µl የተባዙ ምላሾች ላይ ተካሂዷል። ግብረመልሶች በ የQuantStudio 6 Pro real-time PCR ስርዓት (Thermo Fisher) እና መረጃዎች የተሰበሰቡ እና ዲዛይን እና ትንተና (ስሪት 2.4.3) በመጠቀም ተተነተኑ። በዚህ ጥናት ላይ እንደታየው፣ አንጻራዊ መጠኖች ከሪቦሶማል ጂን RpL19 (AGAP004422) ጋር መደበኛ ሆነዋል፣ ይህም አገላለጹ በደም መመገብ 27 ወይም በማጣመር 3 ጉልህ በሆነ መልኩ አልተለወጠም።
የአር ኤን ኤ ጥራት በAgilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) በመጠቀም ተረጋግጧል። የኢሉሚና ጥንድ-ጫፍ ቤተ-መጻሕፍት ተዘጋጅተው በብሮድ ኢንስቲትዩት ኦፍ MIT እና ሃርቫርድ ተዘጋጅተዋል። የቅደም ተከተል ንባቦች ከኤ. ጋምቢያ ጂኖም (PEST ዝርያ፣ ስሪት 4.12) ጋር በነባሪ መለኪያዎች HISAT2 (ስሪት 2.0.5) በመጠቀም ተስተካክለዋል። የካርታ ጥራት (MAPQ) ውጤቶች <30 ያላቸው ንባቦች በሳምቱልስ (ስሪት 1.3.1) በመጠቀም ተወግደዋል። ከጂኖች ጋር የተነደፉት የንባቦች ብዛት በነባሪ መለኪያዎች htseq-count (ስሪት 0.9.1) በመጠቀም ተቆጥሯል። መደበኛ የንባቦች ብዛት ተሰልቶ በR (ስሪት 4.0.3) ውስጥ ባለው የDESeq2 ጥቅል (ስሪት 1.28.1) በመጠቀም ተተነተነ።
የኤክሳይዞን-ማሻሻያ ጂን እጩዎች በመጀመሪያ የ PSI-BLAST ስልተ ቀመር (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) በመጠቀም የኤ. ጋምቢያe ጂኖምን በመፈለግ ተለይተዋል፣ ነባሪ እሴቶች የሚከተሉት የጥያቄ ፕሮቲን ቅደም ተከተሎች ያላቸው መለኪያዎች፡ ከቦምቢክስ ሞሪ (የመዳረሻ ቁጥር NP_001038956.1)፣ ሙስካ ዶሜትሪክ (የመዳረሻ ቁጥር XP_005182020.1፣ XP_005175332.1 እና XP_011294434.1) እና ማይክሮፕላቲስ ዲሞሊተር (የመዳረሻ ቁጥር XP_008552646.1 እና XP_008552645.1) ከቢ. ሞሪ (የመዳረሻ ቁጥር NP_001036900)፣ ድሮሶፊላ ሜላኖጋስተር (የመዳረሻ ቁጥር NP_651202)፣ አፒስ ሜልፊራ (የመዳረሻ ቁጥር XP_394838) እና አሲርቶሲፎን ፒሱም (የመዳረሻ ቁጥር XP_001947166)፤ እና ከቢ. ሞሪ (የመዳረሻ ቁጥር XP_001947166) NP_001177919.1 እና NP_001243996.1) እና ዲ. ሜላኖጋስተር (የመዳረሻ ቁጥር NP_572986.1) (ደረጃ 1) የተገኙ EPP። በመቀጠል፣ በጋምቢያ ውስጥ በመራቢያ ቲሹ (የሴት LRT ወይም MAG) ውስጥ ከፍተኛ mRNA አገላለጽ (>100 ቁርጥራጮች/ኪሎቤዝ ኤክሶኖች በሚሊዮን ካርታ ንባቦች (FPKM) ወይም >85%) ላይ ተመስርተው የማጣሪያ ውጤቶች (ደረጃ 2)። ልዩነቱን ለማሻሻል፣ በኤ. አልቢማነስ የመራቢያ ቲሹ ውስጥ የሚገለጹ እጩ ኢንዛይሞችን መርጠናል፣ ይህም አኖፌልስ ዝርያ ሲሆን ይህም በጋብቻ ወቅት ኤክዲሲን የማያመነጭ ወይም የማያስተላልፍ ነው። የእጩ ጂኖች በኤ. አልቢማነስ የመራቢያ ቲሹ (ደረጃ 3) ውስጥ በዝቅተኛ አገላለጽ (<100 FPKM ወይም <85ኛ ፐርሰንታይል) ላይ ተመስርተው ተጣርተዋል። እንደ የመጨረሻ ማጣሪያ (ደረጃ 4)፣ እጩ ጂኖች ቢያንስ ከሚከተሉት ውስጥ አንዱን ማሟላት አለባቸው፡ (1) ከተጋቡ በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ የተሻሻለ (P < 0.05) እና (2) በመራቢያ ቲሹዎች ውስጥ (< 85% ወይም <100 FPKM) ትንተና መሠረት።
ቀደም ሲል የተገለጹትን ዘዴዎች 28,29,30 ሙሉ ኦርጋኒክ ኢሶቶፒክ መለያ ለማግኘት ቀይረናል። በአጭሩ፣ የዱር አይነት ሳክቻሮሚሴስ ሴሬቪሲያኢ ዓይነት II (YSC2፣ ሲግማ) በእርሾ ናይትሮጅን ቤዝ (BD Difco፣ DF0335) ውስጥ (wt/vol) 2% ግሉኮስ (G7528፣ ሲግማ)፣ 1.7% አሚኖ አሲድ የሌለው እና አሞኒየም ሰልፌት፣ ባህል መካከለኛ) እና 5% 15N አሞኒየም ሰልፌት (NLM-713፣ >99%፣ የካምብሪጅ ኢሶቶፕ ላቦራቶሪዎች) እንደ ብቸኛ የናይትሮጅን ምንጭ ተፈትኗል። እርሾ በሴንትሪፉጌሽን ተገኝቶ የትንኝ እጮች እስኪበቅሉ ድረስ በሊቢተም ተመግበዋል። የአራተኛው የእንቁላል ሞትን ለመከላከል የዓሳ ዱቄት (0.5 mg በ300 እጭ) ተጨማሪ። ከዚያም በማጣመር ወቅት የተላለፈውን የወንድ ፕሮቲን ለመተንተን ያልተሰየሙ ወንዶችን በማጣመር ሴቶች ብቻ ጥቅም ላይ ውለዋል።
ከ4-6 ቀን እድሜ ያላቸው 15N-መለያ የተደረገላቸው ድንግል ሴቶች ከእድሜ ጋር ተመሳሳይነት ካላቸው ድንግል ወንዶች ጋር እንዲገናኙ ተገድደዋል። የተሳካው ውህደት የተጣመሩ መሰኪያዎችን በኤፒፍሎረሰንስ ማይክሮስኮፒ በማግኘት ተረጋግጧል። በ3፣ 12 እና 24 hpm፣ የ45-55 የተጣመሩ ሴቶች አትሪያ ወደ 50 µl የአሞኒየም ባይካርቦኔት ቋት (pH 7.8) ተበታትነው በፔስቲል ተቀላቅለዋል። ሆሞጋኔት ሴንትሪፉጅ ተደርጎ ከ50 µl 0.1% RapiGest (186001860፣ ዋተርስ) ጋር በ50 mM አሞኒየም ባይካርቦኔት ተቀላቅሏል። ከእያንዳንዱ ናሙና የተገኘው ሱፐርናታንት እና ፔሌት በደረቅ በረዶ ላይ ተስተካክለው ሌሊቱን ሙሉ በዋሽንግተን ዩኒቨርሲቲ ወደሚገኘው ማክኮስ ላቦራቶሪ ተልከዋል፣ እዚያም ለLC-MS/MS የናሙና ዝግጅት ተጠናቋል። ፔሊቱን በ50 µl 0.1% RapiGest በ50 mM አሞኒየም እንደገና ያቁሙት። ባይካርቦኔት እና ሶኒኬት በውሃ መታጠቢያ ገንዳ ውስጥ። የፔሌት እና የሱፐርናታንት የፕሮቲን ክምችት በቢሲኤኤ ምርመራ ተለክቷል፣ ናሙናዎቹ በ5 mM ዲቲዮትሬይቶል (DTT፤ ሲግማ) ቀንሰዋል፣ ከ15 mM iodoacetamide (ሲግማ) ጋር አልኪላይድ እና በ37 °C (1:0 50) ለ1 ሰዓት በትራይፕሲኔሽን፡ ትራይፕሲን፡ሰብስቴት ጥምርታ ተጨምረዋል። ​​RapiGest 200 mM HCl በመጨመር ተለሰ፣ ከዚያም በ37 °C ለ45 ደቂቃዎች መቆጠብ እና በ4 °C ለ10 ደቂቃዎች በ14,000 rpm ሴንትሪፉጌሽን ፍርስራሾችን ለማስወገድ ተለሰ። ናሙናዎቹ በሁለት-ሁነታ ጠንካራ-ደረጃ ማውጣት (Oasis MCX cartridges፣ Waters) ታጥበው በ0.1% ፎርሚክ አሲድ እንደገና ተዘግተው የመጨረሻው የፕሮቲን ክምችት 0.33 µg µl-1 ነበር። ያልተሰየሙ የMAG ፕሮቲዮሞች ከድንግል ወንዶች በተመሳሳይ ተተነተኑ። ሁለት ለእያንዳንዱ ናሙና የትንታኔ ቅጂዎች ተተነተኑ። በመቀጠልም፣ ከእያንዳንዱ 1 µg በ25 ሴ.ሜ የተዋሃደ ሲሊካ 75-μm አምድ እና በጁፒተር C12 የተገላቢጦሽ-ደረጃ ሙጫ (Phenomenex) እና በ180 ደቂቃ ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ የተሞላ 4 ሴ.ሜ የተዋሃደ ሲሊካ ካሲል1 (PQ) ፍሪት ወጥመድ በመጠቀም ተተነተነ። የናሙና ማጠቃለያዎች - MS/MS በ Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) ላይ በ nanoACQUITY UPLC ሲስተም (Waters) ተካሂዷል። ለእያንዳንዱ ሩጫ የመነጨው ከውሂብ ጋር የተያያዘ የግኝት መረጃ Proteowzard (ስሪት 3.0.20287) በመጠቀም ወደ mzML ቅርጸት ተቀይሯል እና Comet31 (ስሪት 3.2) ከአኖፌልስ ጋምቢያ (VectorBase ስሪት 54)፣ አኖፌልስ ኮሉዚ የፕሮቲን ቅደም ተከተሎችን የያዘውን የFASTA የውሂብ ጎታ ላይ ተቀይሯል። በማሊ-NIH (VectorBase ስሪት 54)፣ Saccharomyces cerevisiae (Uniprot፣ መጋቢት 2021)፣ A. gambiae RNA-seq እና የታወቁ የሰው ብክለቶች ትርጉሞች ላይ ፍለጋ ተካሂዷል። የፔፕታይድ ካርታ-ተዛማጅ FDRዎች በ0.01 ገደብ በፐርኮሌተር32 (ስሪት 3.05) በመጠቀም ተወስነዋል፣ እና ፔፕታይዶች በLimelight33 ውስጥ የፕሮቲን ፓርሲሞኒ በመጠቀም ወደ ፕሮቲን መለያዎች ተሰብስበዋል። (ስሪት 2.2.0)። አንጻራዊ የፕሮቲን ብዛት ቀደም ሲል እንደተገለጸው በእያንዳንዱ ሂደት ውስጥ ለእያንዳንዱ ፕሮቲን በተሰላው መደበኛ የስፔክትራል ብዝሃነት ፋክተር (NSAF) በመጠቀም ተገምቷል። ከእያንዳንዱ ፕሮቲን ጋር ሲነጻጸር NSAF ከሁለት የተለያዩ ባዮሎጂካል ቅጂዎች በተገኙ ናሙናዎች ላይ በአማካይ ተደርገዋል። 15N መለያ ከተዘረዘሩት ድንግልቶች ትንሽ መጠን ያለው ያልተለጠፈ ፕሮቲን ሊገኝ ቢችልም የሴት ፕሮቲንን በተሳካ ሁኔታ ሸፍኗል። በቴክኒካል ሩጫዎች ውስጥ ብቻ በሴት ጥሬ ናሙናዎች ውስጥ የወንድ ፕሮቲን ቅነሳ (1-5 ስፔክትራ) መለየትን መዝግበናል፣ ጥሬ ናሙናዎች ከወንድ/ከማጋባት ናሙናዎች በኋላ የሚካሄዱበት፣ በHPLC "ተሸካሚ" ምክንያት። አልፎ አልፎ ከተሰየሙ ድንግልቶች እንደ 'ብክለት' የሚገኙ ፕሮቲኖች በተጨማሪ ሠንጠረዥ 1 ውስጥ ተዘርዝረዋል።
ሁለት አንቲጂኒክ ፔፕታይዶች፣ QTTDRVAPAPDQQQ (በኢሶታይፕ PA ውስጥ) እና MESDGTTPSGDSEQ (በኢሶታይፕ PA እና PB ውስጥ) በጄንስክሪት። ሁለቱ ፔፕታይዶች ተጣምረው፣ ከዚያም ከተንቀሳቃሽ ፕሮቲን KLH ጋር ተቀላቅለው ወደ ኒውዚላንድ ጥንቸሎች ተወስደዋል። ጥንቸሎቹ ከአራተኛው መርፌ በኋላ ተሠውተዋል፣ እና አጠቃላይ IgG በአፊኒቲ ንጽህና ተለይቷል። ከአብዛኛው EPP-ተኮር ጥንቸል IgG ለተጨማሪ ምዕራባዊ ብሎቲንግ ጥቅም ላይ ውሏል።
ለምዕራባዊ ብልቶች፣ MAG (n = 10፣ n የባዮሎጂያዊ ገለልተኛ የወባ ትንኝ ናሙናዎችን ብዛት የሚወክልበት) እና ከ4 ቀን ዕድሜ ክልል ውስጥ ካሉ ድንግል ወንዶች እና ድንግል ወይም በግዳጅ የተጣመሩ ሴቶች (<10 ድህረ-ተዛማጅ)፣ የፕሮቲን ማውጣት ቋት (50 mM Tris፣ pH 8.0፤ 1% NP-40፤ 0.25% ሶዲየም ዴኦክሲኮሌት፤ 150 mM NaCl፤ 1 mM EDTA፤ 1 × ፕሮቲኤዝ ኢንሂፐር ኮክቴል (Roche)) ለየብቻ ተጨምሯል። ናሙናዎቹ በቢደር (2 ሚሜ የመስታወት ዶቃዎች፣ 2,400 rpm፣ 90 ሰከንድ) ከተቆረጡ በኋላ ወዲያውኑ ተመሳሳይነት ተሰጥቷቸዋል። የማይሟሟ ፍርስራሾች በ4 °ሴ በ20,000 ግራም በሴንትሪፉጌሽን ተወግደዋል። ፕሮቲኖች በብራድፎርድ ምርመራ (ባዮ-ራድ) ተለክተዋል። ከዚያም፣ 20 µg የMAG ፕሮቲን፣ 40 µg የLRT ፕሮቲን እና 20 µg የ የተረፈው የጅምላ ፕሮቲን በMOPS ቋት በመጠቀም በ10% Bis-Tris NuPAGE ተቆርጦ በMOPS ቋት ተለያይቷል። ፕሮቲኖች በiBlot2 የዝውውር ስርዓት (Thermo Fisher) በመጠቀም ወደ ፖሊቪኒሊዲን ፍሎራይድ ሽፋኖች ተላልፈዋል። ሽፋኖች በ1× PBS-T (0.1% Tween-20 በPBS) ሁለት ጊዜ ታጥበው ከዚያም በኦዲሲ የማገጃ ቋት (Li-Cor) ውስጥ ለ1 ሰዓት በ22°ሴ ታግደዋል። ሽፋኖች በ4°ሴ በብጁ የጥንቸል ፀረ-EPP ፖሊክሎናል ፕራይመሪ አንቲቦዲ (1:700 በብሎክ ቋት) እና በአይጥ ፀረ-አክቲን ሞኖክሎናል ፕራይመሪ አንቲቦዲ MAC237 (Abeam፤ 1:4,000) ታጥበው ከዚያ በሁለተኛ ደረጃ ፀረ-አንቲቦዲዎች (አህያ ፀረ-ጥንቸል 800CW እና ፍየል ፀረ-አትር 680LT (Li-Cor)፣ ሁለቱም 1:20,000) በብሎክ ቋት ውስጥ 0.01% SDS እና 0.2% Tween -20 ለ1 ሰዓት በ22°ሴ። ሽፋኑ በPBS-T ታጥቦ በኦዲሲ CLx ስካነር ተቀርጿል። ምስሎቹ በምስል ስቱዲዮ (ስሪት 5.2) ተሰብስበው ተሰርተዋል። ከEPP-RA isoform (82 kDa) ጋር የሚዛመድ የተወሰነ ባንድ አልተገኘም።
የEPP የኮድ ክልሎች (እንደ ሂስቲዲን ፎስፋታሴ ጎራ፣ NCBI የተጠበቀ የጎራ ፍለጋ 34 የያዘው ኢሶፎርም AGAP002463-RB) እና EcK2 (AGAP002181) ወደ pET-21a(+) ፕላዝሚድ (ኖቫገን ሚሊፖሬ ሲግማ) ክሎኒንግ ተደርገዋል፤ ፕሪመሮች በተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2 ውስጥ ተዘርዝረዋል። ስምንት የGS4 ማያያዣዎች (በተከታታይ) ከ pET-21a(+)-EcK2 ግንባታ C-ተርሚናል 6xHis መለያ በፊት ገብተዋል። ሬኮምቢንታንት ፕሮቲኖች የተመረቱት NEBExpress ሴል-ነጻ E. coli protein synthesis reaction (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) በመጠቀም ነው። ሬኮምቢንታንት ፕሮቲኖች በ NEBExpress Ni spin columns (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) በመጠቀም ተጠርገዋል። ዳይሃይድሮፎሌት ሪዳክቴዝ (DHFR) መቆጣጠሪያ ፕሮቲን የተመረተው ከ NEBExpress ሴል-ነጻ E. coli ፕሮቲን ሲንተሲስ ኪት የዲኤንኤ አብነት በመጠቀም ነው። ፕሮቲኖች እስከ 3 ወራት ድረስ በPBS ውስጥ በ50% ግሊሰሮል ውስጥ በ -20 °ሴ ውስጥ ተከማችተዋል።
የEPP እና የቲሹ ማውጣት የፎስፌትሴ እንቅስቃሴ የተለካው በ4-ናይትሮፌኒል ፎስፌት (pNPP፤ ሲግማ-አልድሪች) በመጠቀም ነው። የምላሽ ቋቱ 25 mM ትሪስ፣ 50 mM አሴቲክ አሲድ፣ 25 mM Bis-Tris፣ 150 mM NaCl፣ 0.1 mM EDTA እና 1 mM DTT ይዟል። ህብረ ህዋሱ በምላሽ ቋቱ ውስጥ ተመሳሳይነት ያለው ሲሆን የሴል ፍርስራሾች በሴንትሪፉጌሽን ተወግደዋል። 2.5 mg ml-1 pNPP የያዘውን የኢንዛይም ወይም የቲሹ ማውጣት ወደ ምላሽ ቋቱ በመጨመር ምላሹን ይጀምሩ። የምላሽ ውህዱ በጨለማ ውስጥ በክፍል ሙቀት ውስጥ እንዲተከል ተደርጓል፣ እና ከpNPP የተቀየረው የpNP መጠን በተለያዩ ጊዜያት በ405 nm የመምጠጥ ችሎታን በመለካት ተለካ።
ለኢንቪትሮ ኢኬኬ እንቅስቃሴ፣ ፕሮቲኑ በ200 µl ቋት (pH 7.5) ውስጥ 10 mM HEPES–NaOH፣ 0.1% BSA፣ 2 mM ATP እና 10 mM MgCl2 ለ2 ሰዓታት በ27 °C ውስጥ በ0.2 mg 20E ወይም 3D20E ታፍኗል። ምላሹ 800 µl ሜታኖል በመጨመር ቆሟል፣ ከዚያም በ-20 °C ለ1 ሰዓት ቀዝቅዞ፣ ከዚያም በ20,000 g ለ10 ደቂቃዎች በ4 °C ተቀይሯል። ከዚያም ሱፐርናታንቱ በHPLC-MS/MS ተተነተነ። በቁጥጥር ቡድኑ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉትን ፕሮቲኖች ለማሞቅ፣ ፕሮቲኖቹ በPBS ውስጥ በ50% ግሊሰሮል ውስጥ ለ20 ደቂቃ በ95 °C ታፍነዋል።
ለኢንቪትሮ ኢፒፒ እንቅስቃሴ፣ ፕሮቲኑ በ100 µl ቋት (pH 7.5) ውስጥ 25 mM ትሪስ፣ 50 mM አሴቲክ አሲድ፣ 25 mM Bis-Tris፣ 150 mM NaCl፣ 0.1 mM EDTA እና 1 mM DTT ለ3 ሰዓታት በ27 °ሴ ባለው የሙቀት መጠን በ3D20E22P (በHPLC-MS/MS የተጣራ 18 ጥንድ MAG ውስጥ ከሚገኘው መጠን ጋር እኩል ነው)። ምላሹ የተቋረጠው በ27 °ሴ ለ3 ሰዓታት ነው። ምላሹ 400 µl ሜታኖል በመጨመር እና በ-20 °ሴ ለ1 ሰዓት በማቀዝቀዝ፣ ከዚያም በ20,000 ግራም ለ10 ደቂቃዎች በ4 °ሴ በማቀዝቀዝ ነው። ሱፐርናታንቱ በHPLC-MS/MS ተተነተነ።
የEPP (362 bp)፣ EcK1 (AGAP004574፣ 365 bp) እና EcK2 (556 bp) የPCR ቁርጥራጮች ከተደባለቀ ወሲብ ጭንቅላት ከሌላቸው የትንኝ ሬሳዎች ከተዘጋጀ cDNA ተሻሽለዋል። የeGFP መቆጣጠሪያ (495 bp) የPCR ክፍል ቀደም ሲል ከተገለጸው pCR2.1-eGFP ተሻሽሏል፤ የPCR ፕሪመሮች በተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2 ውስጥ ተዘርዝረዋል። የPCR ክፍልፋዩ በpL4440 ፕላዝሚድ ላይ በተገለበጠ የT7 ፕሮሞተሮች መካከል ገብቷል። የፕላዝሚድ ግንባታዎች ከ NEB 5-α ብቃት ካለው ኢ. ኮላይ (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) የተገኙ ሲሆን ከመጠቀምዎ በፊት በዲኤንኤ ቅደም ተከተል ተረጋግጠዋል (ለአስገባ ቅደም ተከተል ተጨማሪ መረጃ 1ን ይመልከቱ)። ከT7 ፕሮሞተር ጋር የተጣጣሙ ፕሪመሮች (የተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2) ከpL4440-based plasmid የሚገኘውን ማስገቢያ ለማጉላት ጥቅም ላይ ውለዋል። የPCR የምርት መጠን በአጋሮዝ ጄል electrophoresis ተረጋግጧል።dsRNA ከPCR አብነቶች በ Megascriptpt T7 ትራንስክሪፕሽን ኪት (Thermo Fisher) በመጠቀም ተቀርጾ ቀደም ሲል ከተገለጹት ማሻሻያዎች ጋር ተጣርቷል።
ለ dsRNA መርፌ፣ 1,380 ng የ dsRNA (dsGFP፣ dsEcK1፣ dsEcK2፣ dsEPP) ከክዳኑ በኋላ በ1 ቀን ውስጥ 10 ng nl-1 ክምችት ባለው የአዋቂ ወንዶች ወይም ሴቶች ደረት (ናኖጀክት III፣ ድራምመንድ) ውስጥ በመርፌ ተሰጥቷል። የጂን ውድቀት ደረጃዎች ቢያንስ በሦስት ባዮሎጂያዊ ቅጂዎች በ RNA ማውጣት፣ cDNA ውህደት እና RT-qPCR ተለይተዋል። ለ ecdyson መርፌ፣ የ4 ቀን ድንግል ወይም የ6 ቀን ድንግል ደም የሚመገቡ ሴቶች በቅደም ተከተል 0.13፣ 0.21 ወይም 0.63 µg የ 20E ወይም 3D20E (ናኖጀክት III፣ ድራምመንድ) በ 1.3፣ 2.1 ክምችት፣ እንደ የሙከራ ዲዛይኑ ወይም 6.3 ng nl-1 ላይ በመመስረት። 100 nl የ10% (ቮል/ቮል) ኤታኖል በውሃ ውስጥ ያስገቡ፤ በ10% ኤታኖል ውስጥ 100 ናይል የ3D20E22P (በጥንድ MAGs ውስጥ ከሚገኘው መጠን 75% ጋር እኩል ነው)። ትንኞች በዘፈቀደ ወደ መርፌ ቡድን ተመድበዋል።
ለመውለድ ምርመራዎች፣ የ3 ቀን ሴት ልጆች በሰው ደም ላይ ነፃ የሆነ አመጋገብ ተሰጥቷቸዋል። በከፊል የተመገቡትን ወይም ያልተመገቡትን ትንኞች ያስወግዱ። እንደ ህክምናው፣ ሴቶቹ ደም ከተመገቡ በኋላ ቢያንስ ለ48 ሰዓታት በተለያዩ የመራቢያ ኩባያዎች ውስጥ እንዲቀመጡ ተደርገዋል። እንቁላሎች በስቲሪዮስኮፕ (ስቴሚ 508፣ ዘይስ) ተቆጥረዋል፤ ለተጣመሩ ሴቶች ደግሞ ወደ እጭ የሚፈልቁ እንቁላሎች ለምለም እንደሆኑ ይቆጠራሉ።
ለማጣመር ሙከራዎች፣ ሴቶች እንደ ህክምናው መጠን ቢያንስ ለ2 ቀናት የተፈቀደላቸው ሲሆን ከዕድሜ ጋር የሚዛመዱ የዱር አይነት ወንዶችም በተመሳሳይ ቤት ውስጥ እንዲገቡ ተደርጓል። ከሁለት ሌሊት በኋላ፣ የሴት ማዳበሪያ ቬሲክል ተበታትነው የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ በ10 mM Tris-HCl፣ 1 mM EDTA እና 25 mM NaCl (pH 8.2) በያዘ ቋት ውስጥ በፍሬዝ-ማቅለጥ እና በሶኒኬሽን ተለቋል። ናሙናዎቹ በፕሮቲኔዝ K (0.86 µg µl-1) ለ15 ደቂቃዎች በ55 °ሴ፣ ከዚያም በ95 °ሴ ለ10 ደቂቃዎች ተጨምረዋል። ​​ጥሬ የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ዝግጅቶች 10 እጥፍ ተቀልጠው የ Y ክሮሞዞም ቅደም ተከተሎችን qPCR ለመለየት ተገደዋል፤ ፕሪመሮች በተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2 ውስጥ ተዘርዝረዋል። የ Y ክሮሞዞም ቅደም ተከተል አለመኖር ምንም አይነት ማጣመር እንደሌለ ያሳያል።
ለድጋሚ የፍቺ ምርመራዎች፣ በኃይል የተጣመሩ ሴቶች የመገጣጠሚያ ሁኔታቸውን ለማረጋገጥ የመገጣጠሚያ መሰኪያዎች መኖራቸውን ተፈትሸዋል እና ቀደም ሲል እንደተገለፀው ወንዶች በሌሉበት የመገጣጠሚያ መበላሸት እንዲዳብሩ 2 ቀናት ፈቅደዋል። 36. ከዚያም የDsRed ትራንስጀኒክ ስፐርም የያዙ ወንዶች ወደ ሴት ጎጆዎች ተዋወቁ። ከሁለት ሌሊት በኋላ፣ የማዳበሪያ ቬሲክል ከሴቶቹ ተነቅሏል፣ እና የጂኖሚክ ዲኤንኤ ከላይ እንደተገለጸው ተዘጋጅቶ የDsRed ትራንስጀንን qPCR ለይቶ ማወቅ ተችሏል፤ ፕሪመሮች በተራዘመ የውሂብ ሠንጠረዥ 2 ውስጥ ተዘርዝረዋል። የDsRed ትራንስጀን አለመኖር ምንም አይነት ዳግም መገጣጠም እንዳልተከሰተ ያመለክታል።
3D20E ቀደም ሲል እንደተገለጸው 37 ተፈጥሯል። ባጭሩ፣ 10 ሚ.ግ የ20E (ሲግማ-አልድሪች) በ10 ሚሊ ሊትር ውሃ ውስጥ ተሟጦ፣ ከዚያም 30 ሚ.ግ የፕላቲነም ጥቁር (በዱቄት መልክ ሲግማ-አልድሪች) ተጨምሯል። ረጋ ያለ የO2 ዥረት ወደ ምላሽ ድብልቅ ውስጥ ያለማቋረጥ ተበተነ፣ ይህም በክፍል ሙቀት ውስጥ ተቀላቅሏል። ከ6 ሰዓታት በኋላ ምላሹን ለማስቆም 30 ሚሊ ሊትር ሜታኖል ተጨምሯል። ድብልቁ የማጣሪያ ቅንጣቶችን ለማስወገድ ሴንትሪፉጅ ተደርጓል። የላይኛው ክፍል በክፍል ሙቀት ውስጥ በቫክዩም ውስጥ ወደ ደረቅነት ተተነ። የደረቀው የምላሽ ምርት በ10% ኤታኖል እና ሜታኖል ውስጥ ለHPLC-MS/MS ትንተና መርፌ እንዲገባ ተወስዷል። የልወጣ መጠኑ (ከ20E ወደ 3D20E) በግምት 97% ነበር (ምስል 4ለ)፣ እና የተቀናበረው 3D20E የMS ስፔክትረም ከተጣመሩ ሴቶች ጋር ተዛማጅነት አለው (ምስል 4ሐ)።
አፈ ታሪኩ የተከናወኑትን የስታቲስቲክስ ሙከራዎች ዝርዝር ዝርዝሮችን ይዟል። የግራፍፓድ (ስሪት 9.0) የፊሸርን ትክክለኛ ሙከራ፣ የማንቴል-ኮክስ ሙከራ እና የተማሪውን ቲ-ሙከራ ለማከናወን ጥቅም ላይ ውሏል። የኮክራን-ማንቴል-ሃንስዘል ሙከራዎች የተከናወኑት ብጁ የR ስክሪፕት በመጠቀም ነው (በ https://github.com/duopeng/mantelhaen.test ላይ ይገኛል)። የውሂብ ስርጭቱ ለመደበኛነት የተፈተነው በ0.05 የፍላጎት ገደብ ባለው የሻፒሮ-ዊልክ ሙከራ በመጠቀም ነው። መረጃው የመደበኛነት ሙከራውን ሲያጣ፣ የማን-ዊትኒ ሙከራ ተካሂዷል። የህልውና መረጃው በማንቴል-ኮክስ ሙከራ ተተነተነ። የDESeq2 ጥቅል (ስሪት 1.28.1) የRNA-seq የጂን ደረጃ ልዩነት ትንተና ለማከናወን ጥቅም ላይ ውሏል። በግራፉ ላይ ያለው አግድም አሞሌ መካከለኛውን ይወክላል። የP = 0.05 ጠቀሜታ እሴት ለሁሉም ሙከራዎች እንደ ገደብ ጥቅም ላይ ውሏል።
ስለ ጥናቱ ዲዛይን ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት፣ ከዚህ ጽሑፍ ጋር የተያያዘውን የተፈጥሮ ምርምር ሪፖርት ማጠቃለያ ይመልከቱ።
የMS ፕሮቲዮሚክ መረጃ በPRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) በኩል በProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ውስጥ በውሂብ ስብስቡ መለያ PXD032157 ተቀምጧል።
የRNA-seq የውሂብ ስብስብ በጂን ኤክስፕሬሽን ኮምፕረሲቭ ላይብረሪ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ውስጥ በጂኤንኤ198665 ተከታታይ መዝገብ ስር ተቀምጧል።
በአሁኑ ጥናት ወቅት የተፈጠሩ እና/ወይም የተተነተኑ ተጨማሪ የውሂብ ስብስቦች ከተዛማጅ ደራሲዎች ምክንያታዊ ጥያቄ ሲቀርብ ማግኘት ይቻላል። ይህ ጽሑፍ የምንጭ መረጃውን ያቀርባል።
ደ ሉፍ፣ ኤ. ኤክዳይስቴሮይድ፡ ችላ የተባሉ የነፍሳት የወሲብ ስቴሮይድ? ወንድ፡ ብላክ ቦክስ። የነፍሳት ሳይንስ።13፣ 325–338 (2006)።
ሬድፈርን፣ ሲፒኤፍ 20-ሃይድሮክሲኢክዳይሶን እና የኦቫሪያን እድገት በአኖፌልስ ስቴፈንስ። ጄ. የነፍሳት ፊዚዮሎጂ.28፣ 97–109 (1982)።