የኢሚውኖሞዱላተሪ ሜታቦላይቶች የቲሞር ማይክሮኢንቪሮንመንት (TME) ቁልፍ ባህሪ ናቸው፣ ነገር ግን ከጥቂት ልዩ ሁኔታዎች በስተቀር ማንነታቸው በአብዛኛው አይታወቅም። እዚህ ላይ፣ ከፍተኛ ደረጃ ያለው ሴረስ ካርሲኖማ (HGSC) ባላቸው ታካሚዎች ዕጢዎች እና አሲቶች ላይ ያሉትን እጢዎች እና ቲ ሴሎችን ተንትነናል፣ ይህም የእነዚህን የተለያዩ የTME ክፍሎች ሜታቦሎምን ያሳያል። አስሲቶች እና የቲሞር ሴሎች ሰፊ የሜታቦላይት ልዩነቶች አሏቸው። ከአሲቶች ጋር ሲነጻጸር፣ እጢው የሚሰርቀው ቲ ሴሎች በ1-ሜቲሊኒኮቲናሚድ (MNA) ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ ናቸው። በቲ ሴሎች ውስጥ ያለው የኤምኤንኤ መጠን ከፍ ያለ ቢሆንም፣ የኒኮቲናሚድ ኤን-ሜቲልትራንስፌሬዝ (ከኤስ-አዴኖሲልሜቲዮንይን ወደ ኒኮቲናሚድ የሚዛወር ኢንዛይም) አገላለጽ ለፋይብሮብላስት እና ለቲሞር ሴሎች የተወሰነ ነው። በተግባር፣ ኤምኤንኤ ቲ ሴሎችን ቲሞር የሚያበረታታውን የሳይቶኪን ቲሞር ኒክሮሲስ ፋክተር አልፋ እንዲያወጡ ያነሳሳል። ስለዚህ፣ ከቲኤምኢ የተገኘ MNA የቲ ሴሎችን የበሽታ መከላከያ ቁጥጥር ላይ አስተዋጽኦ ያደርጋል እና ለሰው ልጅ ካንሰር ሕክምና ሊሆን የሚችል የኢሚውኖቴራፒ ኢላማን ይወክላል።
ከቲሞር የተገኙ ሜታቦላይቶች በፀረ-ቲሞር መከላከያ ላይ ጥልቅ የሆነ የመከላከል ተጽእኖ ሊኖራቸው ይችላል፣ እና ቁጥራቸው እየጨመረ የመጣ ማስረጃዎች ለበሽታ እድገት ቁልፍ አንቀሳቃሽ ኃይል ሆነው ሊያገለግሉ እንደሚችሉ ያሳያሉ (1)። ከዋርበርግ ተጽእኖ በተጨማሪ፣ የቅርብ ጊዜ ስራዎች የቲሞር ሴሎችን ሜታቦሊክ ሁኔታ እና ከቲሞር ማይክሮ አካባቢ የበሽታ መከላከያ ሁኔታ (TME) ጋር ያለውን ግንኙነት መለየት ጀምረዋል። ​​በአይጥ ሞዴሎች እና በሰው ቲ ሴሎች ላይ የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የግሉታሚን ሜታቦሊዝም (2)፣ ኦክሲዴቲቭ ሜታቦሊዝም (3) እና የግሉኮስ ሜታቦሊዝም (4) በተለያዩ የበሽታ መከላከያ ሴል ንዑስ ቡድኖች ላይ በተናጥል ሊሰሩ ይችላሉ። በእነዚህ መንገዶች ውስጥ ያሉ በርካታ ሜታቦላይቶች የቲ ሴሎችን ፀረ-ቲሞር ተግባር ይከለክላሉ። የኮኤንዛይም ቴትራሃይድሮባዮፕቴሪን (BH4) እገዳ የቲ ሴሎችን መስፋፋት ሊጎዳ እንደሚችል እና በሰውነት ውስጥ የBH4 መጨመር በሲዲ4 እና ሲዲ8 የሚመራውን ፀረ-ቲሞር የበሽታ መከላከያ ምላሽ ሊያሻሽል ይችላል። በተጨማሪም፣ የኪኑረኒን የበሽታ መከላከያ ውጤት በBH4 (5) አስተዳደር ሊታደግ ይችላል። በኢሶሳይትሬት ዴሃይድሮጂኔዝ (IDH) ሚውቴሽን ግሊዮብላስቶማ ውስጥ፣ የኢናንቲዮሜታቦሊክ (R)-2-ሃይድሮክሲግሉታሬት (R-2-HG) ፈሳሽ የቲ ሴል ማግበርን፣ መባዛትን እና ሳይቶሊሲስን እንቅስቃሴ ይከለክላል (6)። በቅርቡ፣ የግላይኮሊሲስ ተረፈ ምርት የሆነው ሜቲልግሊዮክስል የሚመረተው በማይሎይድ ምንጭ ባላቸው አጭበርባሪ ሴሎች ሲሆን የሜቲልግሊዮክስል ቲ ሴል ዝውውር ደግሞ ውጤታማ የቲ ሴል ተግባርን ሊገታ ይችላል። በሕክምና ውስጥ፣ የሜቲልግሊዮክስል ገለልተኛነት የማይሎይድ-የተገኙ አጭበርባሪ ሴሎችን (MDSC) እንቅስቃሴ ማሸነፍ እና በመዳፊት ሞዴሎች ውስጥ የቼክ ቦክድ ቴራፒን በጋራ ሊያሻሽል ይችላል (7)። እነዚህ ጥናቶች በጋራ የቲ ሴል ተግባርን እና እንቅስቃሴን በመቆጣጠር ረገድ የቲኤምኢ-የተገኙ ሜታቦላይቶች ቁልፍ ሚና አፅንዖት ይሰጣሉ።
የቲ ሴል ችግር በኦቫሪያን ካንሰር ውስጥ በስፋት ተዘግቧል (8)። ይህ በከፊል በሃይፖክሲያ እና ያልተለመደ የቲሞር ቫስኩላቸር (9) ውስጥ ባለው የሜታቦሊክ ባህሪያት ምክንያት ነው፣ ይህም የግሉኮስ እና ትራይፕቶፋን ወደ ተረፈ ምርቶች እንደ ላቲክ አሲድ እና ኪኑረንይን እንዲለወጡ ያደርጋል። ከመጠን በላይ የሆነ የሴል ውጭ ላክቴት የኢንተርፌሮን-γ (IFN-γ) ምርትን ይቀንሳል እና የማይዬሎስፕሬሲቭ ንዑስ ቡድኖችን ልዩነት ያነሳሳል (10፣ 11)። የትራይፕቶፋን ፍጆታ የቲ ሴል እድገትን በቀጥታ ይገታል እና የቲ ሴል ተቀባይ ምልክትን ይከለክላል (12-14)። እነዚህ ምልከታዎች ቢኖሩም፣ የበሽታ መከላከያ ሜታቦሊዝምን የሚመለከቱ ብዙ ስራዎች በብልቃጥ ውስጥ በተመቻቸ ሚዲያ በመጠቀም ወይም በቪቮ ውስጥ ባሉ ተመሳሳይ የአይጥ ሞዴሎች የተገደቡ ናቸው፣ ሁለቱም የሰው ልጅ ካንሰሮችን እና የፊዚዮሎጂካል ማክሮ እና ማይክሮ አካባቢን ሙሉ በሙሉ የሚያንፀባርቁ ናቸው።
የኦቫሪያን ካንሰር የተለመደ ባህሪ የፔሪቶናል ስርጭት እና የአሲትስ ገጽታ ነው። በአሲትስ ውስጥ የሴል ፈሳሽ ክምችት ከከፍተኛ በሽታ እና ደካማ ትንበያ ጋር የተያያዘ ነው (15)። እንደ ሪፖርቶች ገለጻ፣ ይህ ልዩ ክፍል ሃይፖክሲክ ነው፣ ከፍተኛ የደም ሥር ኢንዶቲየል እድገት ፋክተር (VEGF) እና ኢንዶሌሚን 2,3-ዳይኦክሳይድ (IDO) ደረጃዎች ያሉት ሲሆን በቲ ተቆጣጣሪ ሴሎች እና በማይሎይድ መከላከያ ሴሎች (15-18) ውስጥ ይጠመዳል። የአሲትስ ሜታቦሊዝም አካባቢ ከቲሞር ራሱ የተለየ ሊሆን ይችላል፣ ስለዚህ በፔሪቶናል ቦታ ውስጥ የቲ ሴሎችን እንደገና ማረም ግልጽ አይደለም። በተጨማሪም፣ በቲሞር አካባቢ ውስጥ በሚገኙት አሲትስ እና ሜታቦላይቶች መካከል ያሉት ቁልፍ ልዩነቶች እና አለመመጣጠን የበሽታ መከላከያ ሴሎችን ሰርጎ መግባት እና በቲሞር ላይ ያላቸውን ተግባር ሊያደናቅፍ ይችላል፣ እና ተጨማሪ ምርምር ያስፈልጋል።
እነዚህን ችግሮች ለመፍታት፣ የተለያዩ የሕዋስ ዓይነቶችን (CD4 + እና CD8 + T ሴሎችን ጨምሮ) እንዲሁም በዕጢዎች ውስጥ እና መካከል ለማጥናት ስሱ የሕዋስ መለያየት እና ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (LC-MS/MS) ዘዴ ነድፈናል። ሜታቦላይቶቹ በታካሚው ተመሳሳይ አሲሳይት እና የቲዩመር አካባቢ ውስጥ ያሉትን ሴሎች ያሰራጫሉ። የእነዚህን ቁልፍ ህዝቦች የሜታቦሊክ ሁኔታ በከፍተኛ ሁኔታ ለመፍታት ይህንን ዘዴ ከከፍተኛ ልኬት ፍሰት ሳይቶሜትሪ እና ነጠላ-ሴል RNA ቅደም ተከተል (scRNA-seq) ጋር በማጣመር እንጠቀማለን። ይህ ዘዴ በቲዩመር ቲ ሴሎች ውስጥ የ1-ሜቲሊኒኮቲናሚድ (MNA) ደረጃ ላይ ጉልህ ጭማሪ አሳይቷል፣ እና በብልቃጥ ውስጥ የተደረጉ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የMNA በቲ ሴል ተግባር ላይ ያለው የበሽታ መከላከያ ተፅእኖ ቀደም ሲል ያልታወቀ ነበር። በአጠቃላይ፣ ይህ ዘዴ በቲዩመሮች እና በበሽታ የመከላከል ሴሎች መካከል ያለውን የጋራ ሜታቦሊክ መስተጋብር ያሳያል፣ እና በቲ ሴል ላይ የተመሠረተ የኦቫሪያን ካንሰር የበሽታ መከላከያ ህክምና ሕክምናን ለማከም ጠቃሚ ሊሆኑ ስለሚችሉ የበሽታ መከላከያ መቆጣጠሪያ ሜታቦላይቶች ልዩ ግንዛቤዎችን ይሰጣል።
የግሉኮስ ቅበላን በአንድ ጊዜ ለመለካት ከፍተኛ-ልኬት ያለው የፍሰት ሳይቶሜትሪ ተጠቅመናል [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7፣ 19፣ 20) የበሽታ መከላከያ ሴሎችን እና የቲዩመር ሴል ህዝቦችን የሚለዩ የተለመዱ ጠቋሚዎች ጎን ለጎን ናቸው (ሠንጠረዥ S2 እና ምስል S1A)። ይህ ትንተና እንደሚያሳየው ከቲ ሴሎች ጋር ሲነጻጸር፣ አስሲቶች እና የቲዩመር ሴሎች ከፍተኛ የግሉኮስ ቅበላ መጠን ቢኖራቸውም፣ በማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ውስጥ አነስተኛ ልዩነቶች አሏቸው። የቲዩመር ሴሎች አማካይ የግሉኮስ ቅበላ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ከቲ ሴሎች ከሶስት እስከ አራት እጥፍ የሚበልጥ ሲሆን፣ የሲዲ4+ ቲ ሴሎች አማካይ የግሉኮስ ቅበላ ከሲዲ8+ ቲ ሴሎች 1.2 እጥፍ ሲሆን ይህም ቲዩመር ሰርጎ የሚገቡ ሊምፎይቶች (TIL) በተመሳሳይ TME ውስጥ እንኳን የተለያዩ የሜታቦሊክ ፍላጎቶች እንዳሏቸው ያሳያል (ምስል 1A)። በአንፃሩ፣ በቲሞር ሴሎች ውስጥ ያለው የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ከሲዲ4+ ቲ ሴሎች ጋር ተመሳሳይ ነው፣ እና የሁለቱም የሴል ዓይነቶች የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ከሲዲ8+ ቲ ሴሎች የበለጠ ነው (ምስል 1ለ)። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች የሜታቦሊክ ደረጃን ያሳያሉ። የቲሞር ሴሎች የሜታቦሊክ እንቅስቃሴ ከሲዲ4+ ቲ ሴሎች ከፍ ያለ ነው፣ እና የሲዲ4+ ቲ ሴሎች የሜታቦሊክ እንቅስቃሴ ከሲዲ8+ ቲ ሴሎች ከፍ ያለ ነው። እነዚህ በሴል ዓይነቶች ላይ ተጽእኖዎች ቢኖሩም፣ በሲዲ4+ እና ሲዲ8+ ቲ ሴሎች የሜታቦሊክ ሁኔታ ወይም በአሲሲስ ውስጥ ከቲሞር ሴሎች ጋር ሲነጻጸር በአሲሲስ ውስጥ ያለው አንጻራዊ መጠን ወጥ የሆነ ልዩነት የለም (ምስል 1C)። በተቃራኒው፣ በሲዲ45-ሴል ክፍልፋይ ውስጥ፣ በቲሞር ውስጥ ያለው የEpCAM+ ሴሎች ድርሻ ከአሲሲስ ጋር ሲነጻጸር ጨምሯል (ምስል 1D)። እንዲሁም በEpCAM+ እና በEpCAM-ሴል ክፍሎች መካከል ግልጽ የሆነ የሜታቦሊክ ልዩነት አይተናል። የEpCAM+ (ቲሞር) ሴሎች ከEpCAM- ሴሎች የበለጠ የግሉኮስ ቅበላ እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ አላቸው፣ ይህም በTME ውስጥ ባለው የቲሞር ሴሎች ውስጥ ካለው ፋይብሮብላስት ሜታቦሊክ እንቅስቃሴ በጣም ከፍ ያለ ነው (ምስል 1፣ E እና F)።
(A እና B) የግሉኮስ ቅበላ መካከለኛ የፍሎረሰንስ ጥንካሬ (MFI) (A) እና የሲዲ4 + ቲ ሴሎች (MitoTracker ጥቁር ቀይ) ማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ (B) የሚወክሉ ግራፎች (ግራ) እና የታጠረ መረጃ (ቀኝ)፣ የሲዲ8 + ቲ ሴሎች እና የኢፕካም + CD45-ቲሞር ሴሎች ከአሲቲስ እና ከቲሞር። (C) በአሲቲስ እና በቲሞር ውስጥ የCD4 + እና የሲዲ8 + ሴሎች (የሲዲ3 + ቲ ሴሎች) ጥምርታ። (D) በአሲቲስ እና በቲሞር ውስጥ የEpCAM + ቲሞር ሴሎች ድርሻ (CD45−)። (E እና F) የEpCAM + CD45-ቲሞር እና የኢፕካም-ሲዲ45-ማትሪክስ የግሉኮስ ቅበላ (2-NBDG) (E) እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ (MitoTracker ጥቁር ቀይ) (F) የሚወክሉ ግራፎች (ግራ) እና የታጠረ መረጃ (ቀኝ) አስሲስቶች እና የቲሞር ሴሎች። (G) በፍሰት ሳይቶሜትሪ የCD25፣ CD137 እና PD1 አገላለጽ ተወካይ ግራፎች። (H እና I) በሲዲ4 + ቲ ሴሎች (H) እና በሲዲ8 + ቲ ሴሎች (I) ላይ CD25፣ CD137 እና PD1 አገላለጽ። (J እና K) በCCR7 እና CD45RO አገላለጽ ላይ የተመሰረቱ ኔቭ፣ ማዕከላዊ ማህደረ ትውስታ (Tcm)፣ ኢፌክተር (ቴፍ) እና ኢፌክተር ማህደረ ትውስታ (ቴም) ፌኖታይፖች። በአሲትስ እና ዕጢዎች ውስጥ የCD4 + ቲ ሴሎች (J) እና CD8 + ቲ ሴሎች (K) ተወካይ ምስሎች (ግራ) እና የሰንጠረዥ መረጃ (ቀኝ)። በተጣመሩ የቲ-ሙከራ (*P<0.05፣ **P<0.01 እና ***P<0.001) የሚወሰኑ የP እሴቶች። መስመሩ የተጣጣሙ ታካሚዎችን ይወክላል (n = 6)። FMO፣ ፍሎረሰንስ ሲቀነስ አንድ፤ MFI፣ መካከለኛ የፍሎረሰንስ ጥንካሬ።
ተጨማሪ ትንተና በከፍተኛ ሁኔታ በተፈታው የቲ ሴል ፊኖታይፒክ ሁኔታ መካከል ሌሎች ጉልህ ልዩነቶችን አሳይቷል። በዕጢዎች ውስጥ የተነቃቁት (ምስል 1፣ G እስከ I) እና የተዋጣለት ማህደረ ትውስታ (ምስል 1፣ J እና K) ከአሲሲስ (ከሲዲ3 + ቲ ሴሎች ድርሻ) በጣም ብዙ ናቸው። በተመሳሳይ፣ በማግበር ማርከሮች (CD25 እና CD137) እና በመሟጠጥ ማርከሮች [ፕሮግራም የተደረገ የሴል ሞት ፕሮቲን 1 (PD1)] ፌኖታይፕን መተንተን ምንም እንኳን የእነዚህ ህዝቦች ሜታቦሊክ ባህሪያት የተለያዩ ቢሆኑም (ምስል S1፣ B እስከ E)፣ ነገር ግን በኔፊ፣ በተዋጣለት ወይም በማስታወስ ንዑስ ስብስቦች መካከል ምንም ጉልህ የሆነ የሜታቦሊክ ልዩነቶች በተከታታይ አልታዩም (ምስል S1፣ F እስከ I)። እነዚህ ውጤቶች የተረጋገጡት የሴል ፊኖታይፕዎችን በራስ-ሰር ለመመደብ የማሽን መማሪያ ዘዴዎችን በመጠቀም ሲሆን ይህም በታካሚው አስሲስ ውስጥ ብዙ ቁጥር ያላቸው የአጥንት መቅኒ ሴሎች (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) መኖራቸውን የበለጠ አሳይቷል (ምስል S2A)። ከተለዩት የሴል ዓይነቶች ሁሉ መካከል፣ ይህ የማይሎይድ ሴል ብዛት ከፍተኛውን የግሉኮስ ቅበላ እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ አሳይቷል (ምስል S2፣ B እስከ G)። እነዚህ ውጤቶች በአሲትስ እና በHGSC ታካሚዎች ውስጥ በሚገኙ በርካታ የሴል ዓይነቶች መካከል ያለውን ጠንካራ የሜታቦሊክ ልዩነት ያጎላሉ።
የቲኤል ሜታቦኖሚክ ባህሪያትን ለመረዳት ዋናው ፈተና በቂ ንፅህና፣ ጥራት እና ብዛት ያላቸውን የቲ ሴል ናሙናዎች ከዕጢዎች መለየት አስፈላጊ ነው። የቅርብ ጊዜ ጥናቶች እንደሚያሳዩት በፍሰት ሳይቶሜትሪ ላይ የተመሰረቱ የመለየት እና የዶቃ ማበልጸጊያ ዘዴዎች በሴሉላር ሜታቦላይት መገለጫዎች ላይ ለውጦችን ሊያስከትሉ እንደሚችሉ (22-24) አሳይተዋል። ይህንን ችግር ለማሸነፍ፣ በLC-MS/MS ከመተንተን በፊት TILን በቀዶ ጥገና ከተቆረጠ የሰው ኦቫሪያን ካንሰር ለመለየት እና ለመለየት የዶቃ ማበልጸጊያ ዘዴን አመቻችተናል (ቁሳቁሶችን እና ዘዴዎችን ይመልከቱ፤ ምስል 2A)። የዚህ ፕሮቶኮል በሜታቦላይት ለውጦች ላይ ያለውን አጠቃላይ ተጽእኖ ለመገምገም፣ ከላይ ከተጠቀሰው የዶቃ መለያየት ደረጃ በኋላ በጤናማ ለጋሾች የሚንቀሳቀሱትን የቲ ህዋሶችን የሜታቦላይት መገለጫዎችን ከዶቃ ያልተለዩ ነገር ግን በበረዶ ላይ የቀሩ ሴሎችን አነጻጽረናል። ይህ የጥራት ቁጥጥር ትንተና በእነዚህ ሁለት ሁኔታዎች መካከል ከፍተኛ ትስስር እንዳለ አረጋግጧል (r = 0.77)፣ እና የ86 ሜታቦላይቶች ቡድን ቴክኒካዊ ድግግሞሽ ከፍተኛ ተደጋጋሚነት አለው (ምስል 2B)። ስለዚህ፣ እነዚህ ዘዴዎች በሴል አይነት ማበልጸጊያ ውስጥ ባሉ ሴሎች ውስጥ ትክክለኛ የሜታቦላይት ትንተና ሊያከናውኑ ይችላሉ፣ በዚህም በHGSC ውስጥ የተወሰኑ ሜታቦላይቶችን ለመለየት የመጀመሪያው ከፍተኛ ጥራት ያለው መድረክ ይሰጣሉ፣ በዚህም ሰዎች ስለ ሴል ስፔሲፊኬሽን የጾታዊ ሜታቦሊዝም ፕሮግራም ጥልቅ ግንዛቤ እንዲያገኙ ያስችላቸዋል።
(ሀ) የማግኔቲክ ዶቃ ማበልጸጊያ ንድፍ። በLC-MS/MS ከመተንተን በፊት፣ ሴሎቹ ሶስት ተከታታይ የማግኔቲክ ዶቃ ማበልጸጊያ ዙሮችን ያልፋሉ ወይም በበረዶ ላይ ይቆያሉ። (ለ) የማበልጸጊያ ዓይነት በሜታቦላይቶች ብዛት ላይ ያለው ተጽእኖ። ለእያንዳንዱ የማበልጸጊያ ዓይነት ± SE የሶስት መለኪያዎች አማካይ። ግራጫው መስመር የ1:1 ግንኙነትን ይወክላል። በዘንግ መለያው ውስጥ የሚታዩት ተደጋጋሚ መለኪያዎች ውስጣዊ-ክፍል ትስስር (ICC)። NAD፣ ኒኮቲናሚድ አዴኒን ዲኑክሊዮታይድ። (ሐ) የታካሚ ሜታቦላይት ትንተና የስራ ፍሰት ንድፍ ንድፍ። አስሲቶች ወይም ዕጢዎች ከታካሚዎች የተሰበሰቡ እና ክሪዮፕሬዝድ ናቸው። የእያንዳንዱ ናሙና ትንሽ ክፍል በፍሰት ሳይቶሜትሪ ተተነተነ፣ የተቀሩት ናሙናዎች ደግሞ ለCD4+፣ CD8+ እና CD45- ሴሎች ሶስት ዙር የማበልጸጊያ ዙሮችን ወስደዋል። እነዚህ የሴል ክፍልፋዮች በLC-MS/MS በመጠቀም ተተነተኑ። (መ) የመደበኛ ሜታቦላይት ብዛት የሙቀት ካርታ። ዴንድሮግራም የዋርድን በናሙናዎች መካከል ያለውን የዩክሊዲያን ርቀት ስብስብ ይወክላል። (ሠ) የእያንዳንዱን ናሙና ሶስት ቅጂዎች የሚያሳይ የናሙና ሜታቦላይት ካርታ ዋና የክፍል ትንተና (PCA)፣ ከተመሳሳይ ታካሚ የተገኙ ናሙናዎች በመስመር የተገናኙ ናቸው። (ረ) በታካሚው ላይ የተቀመጠው የናሙና ሜታቦላይት መገለጫ PCA (ማለትም፣ ከፊል ድግግሞሽን በመጠቀም)፤ የናሙናው አይነት በኮንቬክስ ቅርፊት የተገደበ ነው። PC1፣ ዋና ክፍል 1፤ PC2፣ ዋና ክፍል 2።
በመቀጠልም፣ ይህንን የማበልጸጊያ ዘዴ በስድስት የHGSC ታካሚዎች ዋና ዋና አስሲቶች እና ዕጢዎች ውስጥ በሲዲ4+፣ CD8+ እና CD45-ሴል ክፍልፋዮች ውስጥ 99 ሜታቦላይቶችን ለመተንተን ተግብረናል (ምስል 2C፣ ምስል S3A እና ሰንጠረዥ S3 እና S4)። የፍላጎት ህዝብ ከመጀመሪያው ትልቅ የሕያዋን ሴሎች ናሙና ከ2% እስከ 70% ይይዛል፣ እና የሕዋሶች ድርሻ በታካሚዎች መካከል በእጅጉ ይለያያል። ዶቃዎችን ከለየን በኋላ፣ የበለፀገው የፍላጎት ክፍልፋይ (CD4+፣ CD8+ ወይም CD45-) በናሙናው ውስጥ ካሉት ሕያዋን ሴሎች በአማካይ ከ85% በላይ ይይዛል። ይህ የማበልጸጊያ ዘዴ ከሰው ቲዩመር ቲሹ ሜታቦሊዝም የሕዋስ ህዝቦችን ለመተንተን ያስችለናል፣ ይህም ከትላልቅ ናሙናዎች ሊከናወን የማይችል ነው። ይህንን ፕሮቶኮል በመጠቀም፣ እነዚህ ሁለት በሚገባ የተገለጹት የበሽታ መከላከያ ሜታቦላይቶች በቲዩመር ቲ ሴሎች ወይም በቲዩመር ሴሎች ውስጥ ከፍ ብለዋል (ምስል S3፣ B እና C)። ስለዚህ፣ እነዚህ ውጤቶች የሕዋስ መለያየት እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ቴክኖሎጂ በታካሚ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ባዮሎጂያዊ ጠቀሜታ ያላቸውን ሜታቦላይቶችን ለማግኘት ያላቸውን ታማኝነት እና ችሎታ ያሳያሉ።
ትንታኔያችን በታካሚዎች ውስጥ እና መካከል የሕዋስ ዓይነቶች ጠንካራ የሜታቦሊክ መለያየትን አሳይቷል (ምስል 2D እና ምስል S4A)። በተለይም ከሌሎች ታካሚዎች ጋር ሲነጻጸር፣ ታካሚ 70 የተለያዩ የሜታቦሊክ ባህሪያትን አሳይቷል (ምስል 2E እና ምስል S4B)፣ ይህም በታካሚዎች መካከል ከፍተኛ የሜታቦሊክ ልዩነት ሊኖር እንደሚችል ያሳያል። ከሌሎች ታካሚዎች ጋር ሲነጻጸር (ከ1.2 እስከ 2 ሊትር፤ ሰንጠረዥ S1)፣ በታካሚ 70 (80 ሚሊ ሊትር) ውስጥ የተሰበሰበው አጠቃላይ የአሲሲስ መጠን አነስተኛ እንደነበር ልብ ሊባል ይገባል። በዋናው የክፍል ትንተና ወቅት (ለምሳሌ፣ ከፊል የድጋሚ ትንተናን በመጠቀም) በታካሚዎች መካከል ያለው ልዩነት ቁጥጥር በሴል ዓይነቶች መካከል ወጥ የሆነ ለውጦችን ያሳያል፣ እና የሴል ዓይነቶች እና/ወይም ማይክሮ አካባቢ በግልጽ በሜታቦላይት መገለጫ መሠረት ይሰባሰባሉ (ምስል 2F)። የነጠላ ሜታቦላይቶች ትንተና እነዚህን ውጤቶች አጉልቶ አጉልቶ ያሳያል እና በሴል ዓይነቶች እና በማይክሮ አካባቢ መካከል ጉልህ ልዩነቶችን አሳይቷል። የሚታየው እጅግ በጣም ከፍተኛ ልዩነት MNA መሆኑን ልብ ማለት ያስፈልጋል፣ እሱም ብዙውን ጊዜ በሲዲ45- ሴሎች እና ዕጢውን በሚሰርቁ በሲዲ4+ እና ሲዲ8+ ሴሎች ውስጥ የበለፀገ ነው (ምስል 3A)። ለሲዲ4+ ሴሎች፣ ይህ ተጽእኖ በጣም ግልፅ ነው፣ እና በሲዲ8+ ሴሎች ውስጥ ያለው MNA በአካባቢ ላይም ከፍተኛ ተጽዕኖ እያሳደረ ይመስላል። ሆኖም፣ ይህ አስፈላጊ አይደለም፣ ምክንያቱም ከስድስቱ ታካሚዎች ውስጥ ሦስቱ ብቻ ለቲዩመር CD8+ ውጤቶች ሊገመገሙ ይችላሉ። ከኤምኤንኤ በተጨማሪ፣ በአሲትስ እና በቲዩመርስ ውስጥ ባሉ የተለያዩ የሕዋስ ዓይነቶች፣ በቲኤል ውስጥ ደካማ ባህሪ ያላቸው ሌሎች ሜታቦላይቶችም እንዲሁ በተለያዩ የበለፀጉ ናቸው (ምስል S3 እና S4)። ስለዚህ፣ እነዚህ መረጃዎች ለተጨማሪ ምርምር ተስፋ ሰጪ የበሽታ መከላከያ ሜታቦላይቶች ስብስብ ያሳያሉ።
(ሀ) ከአሲትስ እና ከቲሞር የሚመጡ በሲዲ4+፣ CD8+ እና CD45- ሴሎች ውስጥ የኤምኤንኤ መደበኛ ይዘት። የሳጥኑ ሴራ መካከለኛ (መስመር)፣ ኢንተርኳርቲል ክልል (የክፈፍ ማጠፊያ) እና የውሂብ ክልልን ያሳያል፣ እስከ 1.5 እጥፍ የኢንተርኳርቲል ክልል (የክፈፍ ዊስክ)። በታካሚ ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ውስጥ እንደተገለጸው፣ የP እሴትን ለመወሰን የታካሚውን ሊማ እሴት ይጠቀሙ (*P<0.05 እና **P<0.01)። (ለ) የኤምኤንኤ ሜታቦሊዝም ንድፍ (60)። ሜታቦላይቶች፡ S-adenosyl-1-methionine፤ SAH፣ S-adenosine-1-homocysteine፤ NA፣ nicotinamide፤ MNA፣ 1-methylnicotinamide፤ 2-PY፣ 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide፤ 4-PY፣ 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide፤ NR፣ nicotinamide ribose፤ NMN፣ nicotinamide mononucleotide። ኢንዛይሞች (አረንጓዴ): NNMT፣ ኒኮቲናሚድ N-ሜቲልትራንስፌሬዝ፤ SIRT፣ sirtuins፤ NAMPT፣ ኒኮቲናሚድ ፎስፈረስቢሶይል ትራንስፌሬዝ፤ AOX1፣ አልዴይድ ኦክሲዳዝ 1፤ NRK፣ ኒኮቲናሚድ ሪቦሳይድ ኪናሴ፤ NMNAT፣ ኒኮቲናሚድ ሞኖ ኑክሊዮታይድ አዴኒሌት ትራንስፌሬዝ፤ Pnp1፣ ፑሪን ኑክሊዮሳይድ ፎስፈረላዝ። (ሐ) የአሲትስ (ግራጫ) እና ዕጢ (ቀይ፤ n = 3 ታካሚዎች) የscRNA-ተከታታይ t-SNE። (መ) በscRNA-ሴክ በመጠቀም በተለዩ የተለያዩ የሴል ህዝቦች ውስጥ የNNMT አገላለጽ። (ሠ) በSK-OV-3፣ በሰው ልጅ ሽል ኩላሊት (HEK) 293T፣ በT ሴሎች እና በMNA የታከሙ ቲ ሴሎች ውስጥ የNNMT እና AOX1 አገላለጽ። የታጠፈው አገላለጽ ከSK-OV-3 ጋር ሲነጻጸር ይታያል። ከSEM ጋር ያለው የአገላለጽ ንድፍ ይታያል (n = 6 ጤናማ ለጋሾች)። ከ35 በላይ የሆኑ የሲቲ እሴቶች ሊታወቁ እንደማይችሉ ይቆጠራሉ (UD)። (ረ) በ8mM MNA የታከሙ የ SK-OV-3፣ HEK293T፣ የቲ ሴሎች እና የቲ ሴሎች ውስጥ የSLC22A1 እና SLC22A2 አገላለጽ። የታጠፈው አገላለጽ ከ SK-OV-3 ጋር ሲነጻጸር ይታያል። ከ SEM ጋር ያለው የአገላለጽ ንድፍ ይታያል (n = 6 ጤናማ ለጋሾች)። ከ 35 በላይ የሆኑ የሲቲ እሴቶች ሊታወቁ የማይችሉ እንደሆኑ ይቆጠራሉ (UD)። (G) ከ MNA ጋር ከተቀነባበሩ 72 ሰዓታት በኋላ በተነቃቁ ጤናማ ለጋሽ ቲ ሴሎች ውስጥ የሴል MNA ይዘት። ከ SEM ጋር ያለው የአገላለጽ ንድፍ ይታያል (n = 4 ጤናማ ለጋሾች)።
MNA የሚመረተው በኒኮቲናሚድ ኤን-ሜቲልትራንስፌዝ (NNMT፤ ምስል 3B) አማካኝነት የሜቲል ቡድኑን ከ S-adenosyl-1-ሜቲዮኒን (SAM) ወደ ኒኮቲናሚድ (NA) በማስተላለፍ ነው። NNMT በተለያዩ የሰው ልጅ ካንሰሮች ውስጥ ከመጠን በላይ የሚገለጽ ሲሆን ከመባዛት፣ ከወረራ እና ከሜታስታሲስ (25-27) ጋር የተያያዘ ነው። በTME ውስጥ በቲ ሴሎች ውስጥ የMNA ምንጭን በተሻለ ለመረዳት፣ በሦስት የHGSC ታካሚዎች ውስጥ በአሲትስ እና ዕጢዎች ውስጥ የNNMT አገላለጽን ለመግለጽ scRNA-seq ተጠቅመናል (ሠንጠረዥ S5)። በግምት 6,500 ሴሎች ላይ የተደረገው ትንተና እንደሚያሳየው በአሲትስ እና በቲዩመር አካባቢዎች ውስጥ የNNMT አገላለጽ ለተገመተው ፋይብሮብላስት እና የቲዩመር ሴል ህዝቦች ብቻ የተወሰነ ነው (ምስል 3፣ C እና D)። PTPRC (CD45 +)ን የሚገልጽ በማንኛውም ህዝብ ውስጥ ግልጽ የሆነ የNNMT አገላለጽ አለመኖሩን ልብ ሊባል ይገባል (ምስል 3D እና ምስል S5A)፣ ይህም በሜታቦላይት ስፔክትረም ውስጥ የተገኘው MNA ወደ ቲ ሴሎች ውስጥ እንደገባ ያሳያል። የአልዴይድ ኦክሲዳዝ 1 (AOX1) አገላለጽ MNAን ወደ 1-ሜቲል-2-ፒሪዶን-5-ካርቦክአሚድ (2-PYR) ወይም 1-ሜቲል-4-ፒሪዶን-5-ካርቦክአሚድ (4-PYR) ይለውጠዋል፤ ምስል 3ለ) እንዲሁም COL1A1ን የሚገልጹ ፋይብሮብላስት (ምስል S5A) ብቻ የተወሰነ ነው፣ ይህም የቲ ሴሎች በተለምዶ የMNA ሜታቦሊዝም ችሎታ እንደሌላቸው ያሳያል። የእነዚህ MNA-ተዛማጅ ጂኖች አገላለጽ ንድፍ የተረጋገጠው ከHGSC ታካሚዎች ከ ascites በተወሰደ ሁለተኛ ገለልተኛ የሴል መረጃ ስብስብ በመጠቀም ነው (ምስል S5B፤ n = 6) (16)። በተጨማሪም፣ በMNA የታከሙ ጤናማ የለጋሽ ቲ ሴሎችን መጠነኛ ፖሊሜራዝ ሰንሰለት ምላሽ (qPCR) ትንተና እንደሚያሳየው ከቁጥጥር SK-OV-3 የኦቫሪያን ቲዩመር ሴሎች ጋር ሲነጻጸር፣ NNMT ወይም AOX1 ከሞላ ጎደል አልተገለጸም (ምስል 3E)። እነዚህ ያልተጠበቁ ውጤቶች MNA ከፋይብሮብላስት ወይም ከቲዩመር ወደ TME ውስጥ ወደሚገኙ ተያያዥ ቲ ሴሎች ሊወጣ እንደሚችል ያመለክታሉ።
ምንም እንኳን እጩዎቹ በሟሟ ተሸካሚ 22 (SLC22) ቤተሰብ (SLC22A1፣ SLC22A2 እና SLC22A3) የተመሰጠሩትን ኦርጋኒክ የካሽን አጓጓዦች ቤተሰብ 1 እስከ 3 (OCT1፣ OCT2 እና OCT3) ቢያካትቱም፣ የMNA ሊሆኑ የሚችሉ አጓጓዦች አሁንም አልተገለጸም (28)። ከጤናማ ለጋሽ ቲ ሴሎች የ mRNA QPCR ዝቅተኛ የ SLC22A1 አገላለጽ ደረጃዎችን አሳይተዋል ነገር ግን የማይታወቁ የ SLC22A2 ደረጃዎችን አሳይተዋል፣ ይህም ቀደም ሲል በጽሑፎቹ ውስጥ ሪፖርት ተደርጓል (ምስል 3F) (29)። በአንጻሩ፣ የSK-OV-3 የኦቫሪያን ቲዩመር ሴል መስመር የሁለቱም አጓጓዦች ከፍተኛ ደረጃዎችን አሳይቷል (ምስል 3F)።
የቲ ሴሎች የውጭ ኤምኤንኤ የመምጠጥ ችሎታ እንዳላቸው ለመፈተሽ፣ ጤናማ የለጋሽ ቲ ሴሎች ለ72 ሰዓታት የተለያዩ የኤምኤንኤ ክምችቶች ባሉበት ተክለዋል። ውጫዊ ኤምኤንኤ በሌለበት፣ የኤምኤንኤ ሴሉላር ይዘት ሊታወቅ አይችልም (ምስል 3ጂ)። ሆኖም፣ በውጫዊ ኤምኤንኤ የታከሙ ንቁ የሆኑ ቲ ሴሎች በሴሎቹ ውስጥ እስከ 6 mM ኤምኤንኤ ድረስ በMNA ይዘት ላይ በመጠን ላይ የተመሰረተ ጭማሪ አሳይተዋል (ምስል 3ጂ)። ይህ ውጤት ዝቅተኛ የማጓጓዣ አገላለጽ እና ለሴሉላር ኤምኤንኤ ሜታቦሊዝም ተጠያቂ የሆነው ዋናው ኢንዛይም እጥረት ቢኖርም፣ TIL አሁንም ኤምኤንኤ መውሰድ እንደሚችል ያሳያል።
በታካሚዎች ቲ ሴሎች እና በብልቃጥ ውስጥ የኤምኤንኤ የመምጠጥ ሙከራዎች ውስጥ ያሉት የሜታቦላይቶች ስፔክትረም ከካንሰር ጋር የተያያዙ ፋይብሮብላስትስ (CAF) MNAን የሚያመነጩ ሲሆን የቲዩመር ሴሎች የቲኤልን phenotype እና ተግባር ሊቆጣጠሩ ይችላሉ። የኤምኤንኤ ተጽእኖ በቲ ሴሎች ላይ ለመወሰን፣ ጤናማ የለጋሽ ቲ ሴሎች MNA ባለበት ወይም በሌለበት በብልቃጥ ውስጥ እንዲነቃቁ ተደርገዋል፣ እና የእነሱ መባዛት እና የሳይቶኪን ምርት ተገምግሟል። ከፍተኛ መጠን ባለው MNA ከጨመሩ 7 ቀናት በኋላ፣ የህዝብ ቁጥር በእጥፍ ጨምሯል፣ በሁሉም መጠኖች ደግሞ ጉልበት ተጠብቆ ቆይቷል (ምስል 4A)። በተጨማሪም፣ የውጭ MNA ሕክምና የቲዩመር ኒክሮሲስ ፋክተር-α (TNFα፤ ምስል 4B) የሚገልጹ የሲዲ4+ እና የሲዲ8+ ቲ ሴሎች መጠን እንዲጨምር አድርጓል። በተቃራኒው፣ የIFN-γ ውስጣዊ ሕዋስ ምርት በሲዲ4+ ቲ ሴሎች ውስጥ በእጅጉ ቀንሷል፣ ነገር ግን በሲዲ8+ ቲ ሴሎች ውስጥ አልነበረም፣ እና በኢንተርሉኪን 2 (IL-2፤ ምስል 4፣ ሲ እና ዲ) ላይ ምንም ጉልህ ለውጥ አልታየም። ስለዚህ፣ ከእነዚህ በMNA የታከሙ የቲ ሴል ባህሎች የተገኙት የሱፐርናታንቶች ኢንዛይም-ሊንክድ ኢሚውኖሰርበንት ምርመራ (ELISA) በTNFα ላይ ከፍተኛ ጭማሪ፣ የIFN-γ መቀነስ እና በIL-2 ላይ ምንም ለውጥ አለመኖሩን ያሳያል (ምስል 4፣ E ወደ G)። የIFN-γ መቀነስ MNA የቲ ሴሎችን ፀረ-ቲሞር እንቅስቃሴ በመግታት ረገድ ሚና ሊጫወት እንደሚችል ያሳያል። የMNAን ተጽእኖ በቲ ሴል-መካከለኛ ሳይቶቶክሲክነት ላይ ለማስመሰል፣ በአረንጓዴ ፍሎረሰንት ፕሮቲን (GFP) -CAR-T) ሴሎች የሚቆጣጠሩትን የፎሌት ተቀባይ α እና CAR-T (GFP) ኢላማ የሚያደርጉ የቺሜሪክ አንቲጂን ተቀባይ T (FRα-CAR-T) ሴሎች የሚመረቱት በጤናማ ለጋሽ ፔሪፈራል የደም ሞኖኑክሌር ሴሎች (PBMC) ነው። የCAR-T ሴሎች ለ24 ሰዓታት በMNA ፊት እንዲዳብሩ ተደርገዋል፣ ከዚያም በ10፡1 በሆነ ውጤት እና ኢላማ ጥምርታ ፎሌት ተቀባይ αን ከሚገልጹ የሰው SK-OV-3 የኦቫሪያን ቲዩመር ሴሎች ጋር በጋራ እንዲዳብሩ ተደርገዋል። የኤምኤንኤ ሕክምና የFRα-CAR-T ሴሎችን የመግደል እንቅስቃሴ በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል፣ ይህም በአዴኖሲን ከታከሙት የFRα-CAR-T ሴሎች ጋር ተመሳሳይ ነበር (ምስል 4H)።
(ሀ) በ7ኛው ቀን በቀጥታ ከባህል የተገኘውን አጠቃላይ የሕዋስ ብዛት እና የህዝብ ቁጥር በእጥፍ (PD) ያሳያል። የአሞሌ ግራፉ የስድስት ጤናማ ለጋሾችን አማካይ + SEM ይወክላል። ቢያንስ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎችን የተገኘ መረጃን ይወክላል። (ከቢ እስከ መ) CD3/CD28 እና IL-2 የቲ ሴሎችን በየራሳቸው የMNA ክምችት ለ7 ቀናት ለማግበር ጥቅም ላይ ውለዋል። ከመተንተን በፊት፣ ሴሎች በPMA/ionomycin ከጎልጊስቶፕ ጋር ለ4 ሰዓታት ተነቃቅተዋል። በT ሴሎች ውስጥ የTNFα (B) አገላለጽ። በሕያዋን ሴሎች ውስጥ የTNFα አገላለጽ ምሳሌ ምስል (ግራ) እና የሰንጠረዥ መረጃ (ቀኝ)። በT ሴሎች ውስጥ የIFN-γ (C) እና IL-2 (D) አገላለጽ። የሳይቶኪኖች አገላለጽ በፍሰት ሳይቶሜትሪ ተለክቷል። የአሞሌ ግራፉ አማካይ (n = 6 ጤናማ ለጋሾች) + SEMን ይወክላል። የP እሴትን ለመወሰን የአንድ አቅጣጫ የልዩነት ትንተና እና የተደጋገሙ መለኪያዎችን (*P<0.05 እና **P<0.01) ይጠቀሙ። ቢያንስ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎችን የተገኘ መረጃን ይወክላል። (ከE እስከ G) CD3/CD28 እና IL-2 የቲ ሴሎችን በየራሳቸው የMNA ክምችት ለ7 ቀናት ለማግበር ጥቅም ላይ ውለዋል። መካከለኛው ክፍል ከ4 ሰዓታት በፊት እና በኋላ PMA/ionomycin ማነቃቂያ ተሰብስቧል። የTNFα (E)፣ IFN-γ (F) እና IL-2 (G) ክምችት በELISA ተለክቷል። የአሞሌ ግራፉ አማካይ (n = 5 ጤናማ ለጋሾች) + SEMን ይወክላል። የP እሴት የሚወሰነው የአንድ አቅጣጫ ልዩነት ትንተና እና ተደጋጋሚ መለኪያዎችን በመጠቀም ነው (*P<0.05)። የነጥብ መስመሩ የምርመራውን የመለየት ገደብ ያሳያል። (H) የሕዋስ lysis ምርመራ። የFRα-CAR-T ወይም GFP-CAR-T ሴሎች ለ24 ሰዓታት በአዴኖሲን (250μM) ወይም MNA (10 mM) ተስተካክለዋል፣ ወይም ሳይታከሙ ቀርተዋል (Ctrl)። የSK-OV-3 ሴሎች መቶኛ ግድያ ተለክቷል። የP እሴት የሚወሰነው በWelch t ሙከራ (*P<0.5 እና **P<0.01) ነው።
በMNA-ጥገኛ TNFα አገላለጽ ደንብ ላይ ሜካኒካል ግንዛቤ ለማግኘት፣ በMNA-ታክመው የT ሴሎች TNFα mRNA ላይ የተደረጉ ለውጦች ተገምግመዋል (ምስል 5A)። በMNA የታከሙ ጤናማ የለጋሽ ቲ ሴሎች በTNFα ግልባጭ ደረጃዎች ላይ ሁለት እጥፍ ጭማሪ አሳይተዋል፣ ይህም MNA በTNFα ግልባጭ ደንብ ላይ ጥገኛ መሆኑን ያሳያል። ይህንን ሊሆን የሚችል የቁጥጥር ዘዴ ለመመርመር፣ TNFαን የሚቆጣጠሩ ሁለት የታወቁ የትራንስክሪፕት ምክንያቶች፣ ማለትም የነቃ የT ሴል ኒውክሌር ፋክተር (NFAT) እና የተወሰነ ፕሮቲን 1 (Sp1)፣ ከፕሮክሲማል TNFα ፕሮሞተር ጋር ባለው ትስስር ምላሽ ተገምግመዋል (30)። የTNFα ፕሮሞተር 6 የተለዩ የNFAT ማያያዣ ጣቢያዎችን እና 2 የSp1 ማያያዣ ጣቢያዎችን ይይዛል፣ ከ5'ካፕ] (30) ጋር ተደራራቢ። የክሮማቲን ኢሚውኖፕሬሲፒቴሽን (ChIP) በMNA ሲታከም፣ የSp1 ከTNFα ፕሮሞተር ጋር ያለው ትስስር ሶስት እጥፍ እንደጨመረ አሳይቷል። የNFAT ውህደትም ጨምሯል እና ወደ አስፈላጊነት ቀርቧል (ምስል 5B)። እነዚህ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት MNA የTNFα አገላለጽን በ Sp1 ግልባጭ እና በተወሰነ ደረጃ የNFAT አገላለጽን ይቆጣጠራል።
(ሀ) ያለ MNA ከተዳቀሉ የቲ ሴሎች ጋር ሲነጻጸር፣ በ MNA በተያዙ የቲ ሴሎች ውስጥ የ TNFα አገላለጽ መታጠፍ ለውጥ። ከ SEM ጋር ያለው የአገላለጽ ንድፍ ይታያል (n = 5 ጤናማ ለጋሾች)። ቢያንስ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎችን የተገኘ መረጃን ይወክላል። (ለ) ከ NFAT እና Sp1 በኋላ በ 8 mM MNA የታከሙ ወይም የሌላቸው የቲ ሴሎች የ TNFα አራማጅ ከ (Ctrl) እና PMA/ionomycin ማነቃቂያ ጋር ለ 4 ሰዓታት ተጣምረዋል። ​​ኢሚውኖግሎቡሊን G (IgG) እና H3 ለ immunoprecipitation እንደ አሉታዊ እና አወንታዊ መቆጣጠሪያዎች በቅደም ተከተል ጥቅም ላይ ውለዋል። የ ChIP መጠን እንደሚያሳየው የ Sp1 እና NFAT ከ TNFα አራማጅ ጋር በ MNA በተያዙ ሴሎች ውስጥ ከቁጥጥር ጋር ሲነጻጸር ብዙ ጊዜ እንደጨመረ ያሳያል። ቢያንስ n = 3 ገለልተኛ ሙከራዎችን ውሂብ ይወክላል። በበርካታ የቲ-ሙከራዎች የሚወሰን የ P እሴት (*** P <0.01)። (ሐ) ከ HGSC አሲቲስ ጋር ሲነጻጸር፣ የ T ሴሎች (ሳይቶቶክሲክ ያልሆኑ) በቲሞር ውስጥ የ TNF አገላለጽ መጨመር አሳይተዋል። ቀለሞቹ የተለያዩ ታካሚዎችን ይወክላሉ። የሚታዩት ሴሎች በዘፈቀደ ወደ 300 ናሙና ተወስደዋል እና ከመጠን በላይ መሳብን ለመገደብ ተንቀሳቅሰዋል (** Padj = 0.0076)። (መ) ለኦቫሪያን ካንሰር የታቀደው የ MNA ሞዴል። MNA የሚመረተው በቲኤምኢ ውስጥ ባሉ የቲሞር ሴሎች እና ፋይብሮብላስት ውስጥ ሲሆን በቲ ሴሎች ይወሰዳል። MNA የ Sp1 ከ TNFα ፕሮሞተር ጋር ያለውን ትስስር ይጨምራል፣ ይህም የ TNFα ግልባጭ እና የ TNFα ሳይቶኪን ምርት እንዲጨምር ያደርጋል። MNA የ IFN-γ ቅነሳንም ያስከትላል። የ T ሴል ተግባር መከልከል የመግደል ችሎታን ይቀንሳል እና የቲሞር እድገትን ያፋጥናል።
እንደ ሪፖርቶች ገለጻ፣ TNFα የፊት እና የኋላ ጥገኛ ፀረ-ቲሞር እና ፀረ-ቲሞር ውጤቶች አሉት፣ ነገር ግን የኦቫሪያን ካንሰር እድገት እና ሜታስታሲስን በማበረታታት ረገድ የታወቀ ሚና አለው (31-33)። እንደ ሪፖርቶች ገለጻ፣ በኦቫሪያን ካንሰር በሽተኞች ውስጥ በአሲትስ እና በቲሞር ቲሹዎች ውስጥ ያለው የTNFα ክምችት ከጤናማ ቲሹዎች (34-36) ከፍ ያለ ነው። በሜካኒዝም ረገድ፣ TNFα የነጭ የደም ሴሎችን ማግበር፣ ተግባር እና መስፋፋትን መቆጣጠር እና የካንሰር ሴሎችን phenotype መለወጥ ይችላል (37፣ 38)። ከእነዚህ ግኝቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ የልዩነት የጂን አገላለጽ ትንተና እንደሚያሳየው TNF ከኤሲትስ ጋር ሲነጻጸር በቲሞር ቲሹዎች ውስጥ በቲሞር ቲሹዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ቁጥጥር ተደርጎበታል (ምስል 5C)። የTNF አገላለጽ መጨመር የሳይቶቶክሲክ ያልሆነ phenotype ባላቸው የቲ ሴል ህዝቦች ላይ ብቻ ታይቷል (ምስል S5A)። ባጭሩ፣ እነዚህ መረጃዎች MNA በHGSC ውስጥ ሁለት የበሽታ መከላከያ እና የቲሞር ማነቃቂያ ውጤቶች እንዳሉት ያለውን አመለካከት ይደግፋሉ።
በፍሰት ሳይቶሜትሪ ላይ የተመሠረተ የፍሎረሰንት መለያ የቲኤል ሜታቦሊዝምን ለማጥናት ዋናው ዘዴ ሆኗል። እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ከሁለተኛ ደረጃ ሊምፎይድ አካላት የሚመጡ የደም ሊምፎይቶች ወይም ቲ ሴሎች ጋር ሲነፃፀሩ፣ ሙሪን እና የሰው ቲኤል ግሉኮስን የመውሰድ ዝንባሌ (4፣ 39) እና ቀስ በቀስ የማይቶኮንድሪያል ተግባር ማጣት (19፣ 40) ከፍተኛ ነው። በዚህ ጥናት ውስጥ ተመሳሳይ ውጤቶችን ብናይም፣ ዋናው እድገት የቲዩመር ሴሎችን እና ቲኤልን ከተመሳሳይ የተቆረጠ የቲዩመር ቲሹ ሜታቦሊዝም ማወዳደር ነው። ከእነዚህ ቀደምት ሪፖርቶች ጋር በሚስማማ መልኩ፣ ከአሲትስ እና ከቲዩመር የሚመጡ ቲዩመር (CD45-EpCAM +) ሴሎች ከሲዲ8 + እና ሲዲ4 + ቲ ሴሎች የበለጠ የግሉኮስ ቅበላ አላቸው፣ ይህም የቲዩመር ሴሎች ከፍተኛ የግሉኮስ ቅበላ ከቲ ሴሎች ጋር ሊወዳደር እንደሚችል ይደግፋል። የቲ ሴል ውድድር ጽንሰ-ሀሳብ። TME። ሆኖም፣ የቲዩመር ሴሎች ሚቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ከሲዲ8 + ቲ ሴሎች ከፍ ያለ ነው፣ ነገር ግን ሚቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ከሲዲ4 + ቲ ሴሎች ጋር ተመሳሳይ ነው። እነዚህ ውጤቶች ለቲዩመር ሴሎች ኦክሲዴቲቭ ሜታቦሊዝም አስፈላጊ ነው የሚለውን ብቅ ያለ ጭብጥ ያጠናክራሉ (41፣ 42)። በተጨማሪም የሲዲ8+ ቲ ሴሎች ከሲዲ4+ ቲ ሴሎች ይልቅ ለኦክሲዴቲቭ ዲስኦርደር የበለጠ ተጋላጭ ሊሆኑ እንደሚችሉ ወይም የሲዲ4+ ቲ ሴሎች የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴን ለመጠበቅ ከግሉኮስ ውጪ ያሉ የካርቦን ምንጮችን ሊጠቀሙ እንደሚችሉ ይጠቁማሉ (43፣ 44)። በአሲትስ ውስጥ በሲዲ4+ ቲ ተፅዕኖ ፈጣሪዎች፣ የቲ ተፅዕኖ ፈጣሪ ማህደረ ትውስታ እና የቲ ማዕከላዊ ማህደረ ትውስታ ሴሎች መካከል በግሉኮስ ቅበላ ወይም በማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ምንም ልዩነት እንዳላየን ልብ ሊባል ይገባል። በተመሳሳይ፣ በቲሞር ውስጥ ያለው የCD8+ ቲ ሴሎች የልዩነት ሁኔታ ከግሉኮስ ቅበላ ለውጦች ጋር ምንም ግንኙነት የለውም፣ ይህም በቪትሮ ውስጥ በሚመረቱ ቲ ሴሎች እና በሰው ልጅ ቲኤል ውስጥ በቪቮ (22) መካከል ያለውን ጉልህ ልዩነት ያጎላል። እነዚህ ምልከታዎችም ገለልተኛ በሆነ አውቶማቲክ የሴል ህዝብ ምደባ በመጠቀም ተረጋግጠዋል፣ ይህም ከቲሞር ሴሎች የበለጠ የግሉኮስ ቅበላ እና የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ያላቸው የሲዲ45+ / CD3- / CD4 + / CD45RO + ሴሎች በብዛት የሚገኙ ቢሆኑም የሜታቦሊክ አክቲቭ ሴል ህዝብ አላቸው። ይህ ህዝብ በscRNA-seq ትንተና ውስጥ የተገለጹትን የማይዮሎይድ አጭበርባሪ ሴሎችን ወይም የፕላዝማሳይቶይድ ዴንድሪቲክ ሴሎችን ሊወክል ይችላል። ምንም እንኳን ሁለቱም በሰው ልጅ የኦቫሪያን ዕጢዎች [45] ውስጥ ሪፖርት የተደረጉ ቢሆኑም፣ አሁንም ያስፈልጋቸዋል። ተጨማሪ ስራ ይህንን የማይሎይድ ንዑስ ህዝብ ለመግለጽ ነው።
ምንም እንኳን የፍሰት ሳይቶሜትሪ-ተኮር ዘዴዎች በሴል ዓይነቶች መካከል ያለውን የግሉኮስ እና የኦክሲዴቲቭ ሜታቦሊዝም አጠቃላይ ልዩነቶችን ግልጽ ማድረግ ቢችሉም፣ በTME ውስጥ ለሚደረገው የማይቶኮንድሪያል ሜታቦሊዝም በግሉኮስ ወይም በሌሎች የካርቦን ምንጮች የሚመረቱት ትክክለኛ ሜታቦላይቶች እስካሁን አልተወሰኑም። የሜታቦላይቶችን መኖር ወይም አለመኖር ለተሰጠ የቲኤል ንዑስ ስብስብ መመደብ ከተወጣው ሕብረ ሕዋስ የሕዋስ ብዛት ማጽዳትን ይጠይቃል። ስለዚህ፣ የሕዋስ ማበልጸጊያ ዘዴያችን ከጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ጋር ተዳምሮ በቲ ሴሎች እና በቲሞር ሴል ህዝቦች ውስጥ በተዛማጅ የታካሚ ናሙናዎች ውስጥ በተለያዩ የበለፀጉ ሜታቦላይቶች ላይ ግንዛቤዎችን ሊሰጥ ይችላል። ምንም እንኳን ይህ ዘዴ በፍሎረሰንስ-አክቲቭ የሕዋስ ምደባ ላይ ጥቅሞች ቢኖሩትም፣ የተወሰኑ የሜታቦላይት ቤተ-መጻሕፍት በተፈጥሮ መረጋጋት እና/ወይም ፈጣን የለውጥ መጠን ምክንያት ሊጎዱ ይችላሉ (22)። ሆኖም፣ ዘዴያችን ሁለት የታወቁ የበሽታ መከላከያ ሜታቦላይቶችን ማለትም አዴኖሲን እና ኪኑረኒንን መለየት ችሏል፣ ምክንያቱም በናሙና ዓይነቶች መካከል በጣም ስለሚለያዩ።
የቲሞር እና የቲኤል ንዑስ ዓይነቶች የሜታቦኖሚክ ትንተናችን በኦቫሪያን ቲኤምኢ ውስጥ ስለሚጫወቱት ሚና የበለጠ ግንዛቤ ይሰጣል። በመጀመሪያ፣ የፍሰት ሳይቶሜትሪ በመጠቀም፣ በቲሞር እና በሲዲ4+ ቲ ሴሎች መካከል ባለው የማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ ላይ ምንም ልዩነት እንደሌለ ወስነናል። ሆኖም፣ የLC-MS/MS ትንተና በእነዚህ ህዝቦች መካከል ባለው የሜታቦላይቶች ብዛት ላይ ጉልህ ለውጦችን አሳይቷል፣ ይህም ስለ TIL ሜታቦሊዝም እና አጠቃላይ የሜታቦሊዝም እንቅስቃሴው መደምደሚያዎች ጥንቃቄ የተሞላበት ትርጓሜ እንደሚያስፈልጋቸው ያሳያል። በሁለተኛ ደረጃ፣ MNA በአሲትስ ውስጥ በሲዲ45-ሴሎች እና በቲ ሴሎች መካከል ትልቁ ልዩነት ያለው ሜታቦላይት ነው፣ ዕጢዎች አይደሉም። ስለዚህ፣ ክፍፍል እና የቲሞር አቀማመጥ በቲኤል ሜታቦሊዝም ላይ የተለያዩ ተፅእኖዎች ሊኖራቸው ይችላል፣ ይህም በተወሰነ ማይክሮ አካባቢ ውስጥ ሊኖር የሚችለውን ልዩነት ያሳያል። በሶስተኛ ደረጃ፣ የኤምኤንኤ የሚያመነጭ ኢንዛይም NNMT አገላለጽ በዋናነት በCAF የተወሰነ ነው፣ ይህም በተወሰነ ደረጃ የቲሞር ሴሎች ነው፣ ነገር ግን ሊታወቁ የሚችሉ የኤምኤንኤ ደረጃዎች በቲሞር የተገኙ ቲ ሴሎች ውስጥ ይታያሉ። በኦቫሪያን CAF ውስጥ የNNMT ከመጠን በላይ መገለጥ የታወቀ የካንሰር-ማበረታቻ ውጤት አለው፣ በከፊል የCAF ሜታቦሊዝም፣ የቲሞር ወረራ እና ሜታስታሲስ እድገት ምክንያት (27)። የTIL አጠቃላይ ደረጃ መካከለኛ ቢሆንም፣ በCAF ውስጥ ያለው የNNMT አገላለጽ ከካንሰር ጂኖም አትላስ (TCGA) ሜሴንቺማል ንዑስ ዓይነት ጋር በቅርበት የተቆራኘ ነው፣ ይህም ከደካማ ትንበያ ጋር የተያያዘ ነው (27፣ 46፣ 47)። በመጨረሻም፣ ለኤምኤንኤ መበላሸት ተጠያቂ የሆነው የኢንዛይም AOX1 አገላለጽ በCAF ህዝብ ላይ ብቻ የተወሰነ ነው፣ ይህም የቲ ሴሎች MNAን የመቀነስ ችሎታ እንደሌላቸው ያሳያል። እነዚህ ውጤቶች ይህንን ግኝት ለማረጋገጥ ተጨማሪ ስራ ቢያስፈልግም፣ በቲ ሴሎች ውስጥ ከፍተኛ የMNA መጠን የበሽታ መከላከያ CAF ማይክሮ አካባቢ መኖሩን ሊያመለክት እንደሚችል ሀሳቡን ይደግፋሉ።
የኤምኤንኤ አጓጓዦች ዝቅተኛ የመግለፅ ደረጃ እና በኤምኤንኤ ሜታቦሊዝም ውስጥ የተሳተፉ ቁልፍ ፕሮቲኖች የማይታወቁ ደረጃዎችን ከግምት ውስጥ በማስገባት፣ የኤምኤንኤ መኖር በቲ ሴሎች ውስጥ ያልተጠበቀ ነው። NNMT ወይም AOX1 በ scRNA-seq ትንተና እና በሁለት ገለልተኛ ቡድኖች ኢላማ በሆነ qPCR ሊገኙ አይችሉም። እነዚህ ውጤቶች MNA በቲ ሴሎች የተዋሃደ ሳይሆን ከአካባቢው TME የተዋጠ መሆኑን ያመለክታሉ። በብልቃጥ ውስጥ የተደረጉ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የቲ ሴሎች ውጫዊ MNA የመሰብሰብ አዝማሚያ አላቸው።
በብልቃጥ ውስጥ ያደረግናቸው ጥናቶች እንደሚያሳዩት ውጫዊ MNA በቲ ሴሎች ውስጥ የቲኤንኤፍኤ አገላለጽን እንደሚያነቃቃ እና የSp1ን ከቲኤንኤፍኤ ፕሮሞተር ጋር እንደሚያስተሳስር ያሳያል። TNFα ፀረ-ዕጢ እና ፀረ-ዕጢ ተግባራት ቢኖሩትም፣ በኦቫሪያን ካንሰር ውስጥ፣ TNFα የእንቁላል ካንሰር እድገትን ሊያበረታታ ይችላል (31-33)። የቲኤንኤፍኤ ገለልተኛነት በኦቫሪያን ቲዩመር ሴል ባህል ውስጥ ወይም የቲኤንኤፍኤ ምልክትን በአይጥ ሞዴሎች ውስጥ ማስወገድ በቲኤንኤፍኤ-መካከለኛ የሆነ የኢንፍላማቶሪ ሳይቶኪን ምርትን ሊያሻሽል እና የቲዩመር እድገትን ሊገታ ይችላል (32፣ 35)። ስለዚህ፣ በዚህ ሁኔታ፣ ከቲኤምኢ የተገኘ MNA በራስ-ሰር ዑደት በኩል በቲኤንኤፍኤ-ጥገኛ ዘዴ በኩል እንደ ፕሮ-ኢንፍላማቶሪ ሜታቦላይት ሆኖ ሊያገለግል ይችላል፣ በዚህም የኦቫሪያን ካንሰር መከሰት እና መስፋፋትን ያበረታታል (31)። በዚህ አጋጣሚ ላይ በመመስረት፣ የቲኤንኤፍኤ እገዳ ለኦቫሪያን ካንሰር እምቅ የሕክምና ወኪል ሆኖ እየተጠና ነው (37፣ 48፣ 49)። በተጨማሪም፣ MNA የCAR-T ሴሎችን ከኦቫሪያን ቲዩመር ሴሎች ጋር ሳይቶቶክሲዝምን ያዛባል፣ ይህም ለኤምኤንኤ-መካከለኛ የበሽታ መከላከያ መገደብ ተጨማሪ ማስረጃ ይሰጣል። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች ዕጢዎች እና የCAF ሴሎች MNAን ወደ ከሴል ውጭ ወደሚገኝ TME የሚያመነጩበትን ሞዴል ይጠቁማሉ። በ (i) በTNF ምክንያት የሚመጣው የእንቁላል ካንሰር እድገት ማነቃቂያ እና (ii) በMNA ምክንያት የሚመጣው የቲ ሴል ሳይቶቶክሲክ እንቅስቃሴ መከልከል፣ ይህ ሁለት የቲሞር ተጽእኖ ሊኖረው ይችላል (ምስል 5D)።
ለማጠቃለል ያህል፣ ፈጣን የሴል ማበልጸጊያ፣ የአንድ-ሴል ቅደም ተከተል እና የሜታቦሊክ ፕሮፋይሊንግ ጥምረት በመጠቀም፣ ይህ ጥናት በHGSC ታካሚዎች ውስጥ በቲሞር እና በአሲትስ ሴሎች መካከል ያለውን ከፍተኛ የኢሚውኖሜታቦሎሚክ ልዩነቶችን አሳይቷል። ይህ ሁሉን አቀፍ ትንተና በቲ ሴሎች መካከል በግሉኮስ ቅበላ እና በማይቶኮንድሪያል እንቅስቃሴ መካከል ልዩነቶች እንዳሉ እና ኤምኤንኤ እንደ ሴል ያልሆነ ራስን የመከላከል ተቆጣጣሪ ሜታቦላይት ለይቶ አውቋል። እነዚህ መረጃዎች TME በሰው ካንሰር ውስጥ የቲ ሴል ሜታቦሊዝምን እንዴት እንደሚጎዳ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ። በቲ ሴሎች እና በካንሰር ሴሎች መካከል ለሚኖሩ ንጥረ ነገሮች ቀጥተኛ ውድድር ቢዘገብም፣ ሜታቦላይቶች የቲሞር እድገትን ለማሳደግ እና ምናልባትም ውስጣዊ የበሽታ መከላከያ ምላሾችን ለመግታት እንደ ቀጥተኛ ያልሆኑ ተቆጣጣሪዎች ሆነው ሊያገለግሉ ይችላሉ። የእነዚህ ተቆጣጣሪ ሜታቦላይቶች ተግባራዊ ሚና ተጨማሪ መግለጫ የፀረ-ቲሞር የበሽታ መከላከያ ምላሽን ለማሻሻል አማራጭ ስልቶችን ሊከፍት ይችላል።
የታካሚ ናሙናዎች እና ክሊኒካዊ መረጃዎች የተገኙት በካናዳ የቲሹ ማከማቻ ኔትወርክ የተረጋገጠውን የቢሲ የካንሰር ቲሹ ማከማቻ በኩል ነው። በቢሲ የካንሰር ምርምር የሥነ ምግባር ኮሚቴ እና በብሪቲሽ ኮሎምቢያ ዩኒቨርሲቲ (H07-00463) በፀደቀው ፕሮቶኮል መሠረት፣ የሁሉም ታካሚዎች ናሙናዎች እና ክሊኒካዊ መረጃዎች በመረጃ ላይ የተመሠረተ የጽሑፍ ፈቃድ አግኝተዋል ወይም በይፋ ፈቃዳቸውን አንስተዋል። ናሙናዎቹ በተረጋገጠው ባዮባንክ (BRC-00290) ውስጥ ይቀመጣሉ። ዝርዝር የታካሚ ባህሪያት በሰንጠረዥ S1 እና S5 ውስጥ ይታያሉ። ለክሪዮፕሬዜሽን፣ የታካሚውን የቲሙ ናሙና በሜካኒካል ለማበላሸት እና ከዚያም በ100-ማይክሮን ማጣሪያ ውስጥ በመግፋት አንድ ነጠላ የሴል እገዳ ለማግኘት ስካሌል ጥቅም ላይ ይውላል። የታካሚው አስሲትስ ሴሎችን ለመበከል እና ሱፐርናታንቱን ለማስወገድ በ4°ሴ ለ10 ደቂቃዎች በሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። ከቲሞር እና አስቺት የተገኙ ሴሎች በ50% ሙቀት-አልባ የሰው ኤቢ ሴረም (ሲግማ-አልድሪች)፣ 40% RPMI-1640 (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) እና 10% ዲሜቲል ሰልፋይድ ውስጥ በክሪዮፕሬዝድ ተጠብቀዋል። እነዚህ የተጠበቁ ነጠላ ሴል እገዳዎች ቀለጡ እና ከዚህ በታች ለተገለጸው ሜታቦሎሚክስ እና ሜታቦላይት ውሳኔ ጥቅም ላይ ውለዋል።
ሙሉው መካከለኛ 0.22 μm የተጣራ 50:50 የተጨመረ RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) በ10% ሙቀት-የማይነቃነቅ የሰው AB ሴረም (ሲግማ-አልድሪች)፣ 12.5 mM ሄፕስ (Thermo Fisher Scientific)፣ 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific)፣ 1 x ፔኒሲሊን ስትሬፕቶማይሲን (PenStrep) መፍትሄ (Thermo Fisher Scientific) እና 50 μMB-mercaptoethanol ያካትታል። AimV (Invitrogen) በ20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) እና 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ተጨምሯል። የፍሰት ሳይቶሜትር የእድፍ ቋት በ3% ሙቀት-የማይነቃነቅ AB የሰው ሴረም (Sigma) የተጨመረ 0.22 μm የተጣራ ፎስፌት የተጨመረበት ሳላይን (PBS፤ Invitrogen) ያካትታል። የሴል ማበልጸጊያ ቋት 0.22μm የተጣራ PBS እና 0.5% በሙቀት-ያልተነቃ የሰው ኤቢ ሴረም (ሲግማ-አልድሪች) የተጨመረ ነው።
በ37°ሴ ሙሉ መካከለኛ ክፍል ውስጥ፣ ህዋሶቹ በ10 nM MT DR እና በ100 μM 2-NBDG ለ30 ደቂቃዎች ቀለም ተቀባ። በመቀጠል፣ ህዋሶቹ በ4°ሴ ለ15 ደቂቃዎች በቪታቢሊቲ ቀለም eF506 ቀለም ተቀባ። ህዋሶቹን በFC Block (eBioscience) እና በብሪሊያንት ስቴይን ባፈር (BD Biosciences) ውስጥ እንደገና ያቆዩ፣ በፍሰት ሳይቶሜትር ስቴይን ባፈር ውስጥ (እንደ አምራቹ መመሪያ) ያቀልጡ እና ለ10 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ያቀዘቅዙ። ህዋሶቹን በ4°ሴ በፍሰት ሳይቶሜትሪ ስቴይን ባፈር ውስጥ በፀረ እንግዳ አካላት ስብስብ (ሰንጠረዥ S2) ያቀቡ። ከመተንተንዎ በፊት ህዋሶቹን በፍሰት ሳይቶሜትሪ ስቴይን ባፈር (Cytek Aurora፤ 3L-16V-14B-8R ውቅር) ውስጥ እንደገና ያቆዩ። የሕዋስ ብዛት መረጃን ለመተንተን SpectroFlo እና FlowJo V10 ይጠቀሙ፣ እና ውሂቡን ለመፍጠር GraphPad Prism 8 ይጠቀሙ። የ2-NBDG እና የMT DR አማካይ የፍሎረሰንስ ጥንካሬ (MFI) በምዝግብ ማስታወሻ ደረጃ ተስተካክሏል፣ ከዚያም የተዛማጅ ታካሚዎችን ግምት ውስጥ ለማስገባት የተጣመረ የቲ ምርመራ ለስታቲስቲክስ ትንተና ጥቅም ላይ ውሏል። ከትንታኔው ውስጥ ከ40 ያነሱ ክስተቶች ያሏቸውን ሁሉንም ህዝቦች ያስወግዱ፤ የስታቲስቲክስ ትንተና እና የውሂብ ምስላዊነትን ከማከናወንዎ በፊት ለማንኛውም አሉታዊ እሴቶች 1 የሆነ የMFI እሴት ያስገቡ።
ከላይ የተጠቀሰውን የሂደት ፓነል የእጅ ጌት ስትራቴጂ ለማሟላት፣ በFlowJo ውስጥ የሞቱ ሴሎችን ካስወገድን በኋላ ሴሎችን በራስ-ሰር ለሕዝብ ለመመደብ የቅርጽ ገደብ ዛፍ (FAUST) (21) ሙሉ ማብራሪያ ተጠቅመናል። በተሳሳተ መንገድ የተመደቡ የሚመስሉ ህዝቦችን (PD1+ን ከPD1-ዕጢ ሴሎች ጋር በማጣመር) እና የተጠበቁ ህዝቦችን ለማዋሃድ ውጤቱን በእጅ እናስተዳድራለን። እያንዳንዱ ናሙና በአማካይ ከ2% በላይ ሴሎችን ይይዛል፣ ይህም በአጠቃላይ 11 ህዝቦችን ያካትታል።
የፊኮል ግራዲየንት ጥግግት ሴንትሪፉጌሽን PBMCን ከሉኮሳይት መለየት ምርቶች (STEMCELL Technologies) ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል። የሲዲ8 + ቲ ሴሎች ከPBMC CD8 MicroBeads (Miltenyi) በመጠቀም ተነጥለው በአምራቹ መመሪያ መሰረት TransAct (Miltenyi) በመጠቀም ለ2 ሳምንታት ሙሉ መካከለኛ ሆነው ተዘርግተዋል። ሴሎቹ IL-7 (10 ng/ml፤ ፔፕሮቴክ) በያዘ ሙሉ መካከለኛ ውስጥ ለ5 ቀናት እንዲቆዩ ተፈቅዶላቸዋል፣ ከዚያም በTransAct እንደገና እንዲነቃቁ ተደርገዋል። በ7ኛው ቀን፣ በአምራቹ መመሪያ መሠረት፣ የሰው CD45 MicroBeads (Miltenyi) በሦስት ተከታታይ ዙሮች ሴሎችን ለማበልጸግ ጥቅም ላይ ውለዋል። ሴሎቹ ለፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና (ከላይ እንደተገለጸው) ተመድበዋል፣ እና አንድ ሚሊዮን ሴሎች ለLC-MS/MS ትንተና ሦስት ጊዜ ተመድበዋል። ናሙናዎቹ ከዚህ በታች እንደተገለጸው በLC-MS/MS ተሰርተዋል። የጎደለውን የሜታቦላይት እሴት በ1,000 የአዮን ቁጥር ገምተናል። እያንዳንዱ ናሙና በጠቅላላው የአዮን ቁጥር (TIC) መደበኛ ነው፣ ከመተንተን በፊት በሎጋሪዝም ተቀይሮ በሜታቦአናሊስትር ውስጥ በራስ-ሰር መደበኛ ይሆናል።
የእያንዳንዱ ታካሚ ነጠላ ሴል እገዳ በ40 μm ማጣሪያ በኩል ቀለጠ እና ወደ ሙሉ መካከለኛ (ከላይ እንደተገለጸው) ተጣርቶ ተጣርቷል። በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት፣ ለሲዲ8+፣ ለሲዲ4+ እና ለሲዲ45- ሴሎች (በበረዶ ላይ) ናሙናዎችን ለማበልጸግ ማይክሮቤድስ (ሚልቴንዪ) በመጠቀም በማግኔቲክ ዶቃ መለያየት ሶስት ተከታታይ የአዎንታዊ ምርጫ ዙሮች ጥቅም ላይ ውለዋል። ባጭሩ፣ ሴሎቹ በሴል ማበልጸጊያ ቋት ውስጥ እንደገና ተዘግተው (ከላይ እንደተገለጸው) ይቆጠራሉ። ሴሎቹ በ4°ሴ ሙቀት በሰው CD8 ዶቃዎች፣ በሰው CD4 ዶቃዎች ወይም በሰው CD45 ዶቃዎች (ሚልቴንዪ) ታጥበዋል፣ ከዚያም በሴል ማበልጸጊያ ቋት ታጥበዋል። ናሙናው በLS አምድ (ሚልቴንዪ) በኩል ያልፋል፣ እና አወንታዊ እና አሉታዊ ክፍልፋዮች ይሰበሰባሉ። የቆይታ ጊዜውን ለመቀነስ እና የሴል ማገገሚያ ደረጃን ከፍ ለማድረግ፣ የሲዲ8-ክፍልፋይ ለሁለተኛው የሲዲ4+ ማበልጸጊያ ዙር ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና የሲዲ4-ክፍልፋይ ለቀጣዩ የሲዲ45-ማበልጸጊያ ጥቅም ላይ ይውላል። መፍትሄውን በመለያየት ሂደቱ በሙሉ በበረዶ ላይ ያስቀምጡት።
ለሜታቦላይት ትንተና ናሙናዎችን ለማዘጋጀት፣ ሴሎቹ አንድ ጊዜ በበረዶ ቀዝቃዛ የጨው መፍትሄ ታጥበው 1 ሚሊ ሊትር 80% ሜታኖል በእያንዳንዱ ናሙና ላይ ተጨምሮ ከዚያም በፈሳሽ ናይትሮጅን ውስጥ እንዲቀዘቅዝ ተደርጓል። ናሙናዎቹ ለሶስት የማቀዝቀዣ-ማቅለጫ ዑደቶች ተዳርገው በ14,000 ሩብ ሰዓት ለ15 ደቂቃዎች በ4°ሴ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል። ሜታቦላይቱን የያዘው የላይኛው ክፍል እስኪደርቅ ድረስ ይተናል። ሜታቦላይቶቹ በ50 μl 0.03% ፎርሚክ አሲድ ውስጥ እንደገና ተቀልጠው፣ እንዲደባለቁ ተደርገዋል፣ ከዚያም ፍርስራሾችን ለማስወገድ ሴንትሪፉጅ ተደርገዋል።
ከላይ እንደተገለጸው ሜታቦላይቶችን ማውጣት። ለሜታቦሎሚክስ ምርምር ሱፐርናታንቱን ወደ ከፍተኛ አፈጻጸም ያለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ ጠርሙስ ያስተላልፉ። የባች ተፅእኖዎችን ለመከላከል እያንዳንዱን ናሙና በተመሳሳይ የሕዋስ ብዛት ለማከም የዘፈቀደ የሕክምና ፕሮቶኮል ይጠቀሙ። ቀደም ሲል በ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ላይ የታተሙትን ዓለም አቀፍ ሜታቦላይቶችን በጥራት ግምገማ አድርገናል። የክሮማቶግራፊክ ትንተና እና የፒክ አካባቢ ውህደት የተከናወኑት ባለብዙQuant ስሪት 2.1 ሶፍትዌር (Applied Biosystems SCIEX) በመጠቀም ነው።
የ1000 የአዮን ብዛት የጎደለውን የሜታቦላይት እሴት ለመገመት ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና የእያንዳንዱ ናሙና TIC ከናሙና ማቀነባበሪያ በመሳሪያ ትንተና የቀረቡ ለውጦችን ለማስተካከል የእያንዳንዱን የተገኘውን ሜታቦላይት መደበኛውን የጫፍ ቦታ ለማስላት ጥቅም ላይ ውሏል። TIC መደበኛ ከሆነ በኋላ፣ MetaboAnalystR(51) (ነባሪ መለኪያ) ለሎጋሪዝሚክ ልወጣ እና አውቶማቲክ የመደበኛ መስመር ልኬት ጥቅም ላይ ይውላል። በናሙና ዓይነቶች መካከል ያለውን የሜታቦሎሜ ልዩነቶችን ለመመርመር የቪጋን R ጥቅል ያለው PCA ተጠቅመን ታካሚዎችን ለመተንተን ከፊል የድጋሚ ትንተና ተጠቅመናል። በናሙናዎች መካከል ያለውን የዩክሊዲያን ርቀት ለማሰባሰብ የሙቀት ካርታ ዴንድሮግራም ለመገንባት የዋርድ ዘዴን ይጠቀሙ። በመላው የሴል አይነት እና ማይክሮ አካባቢ ውስጥ የተለያዩ የበለፀጉ ሜታቦላይቶችን ለመለየት በመደበኛ የሜታቦላይት ብዛት ላይ ሊማ (52) ተጠቅመናል። ማብራሪያውን ለማቃለል፣ ሞዴሉን ለመግለጽ የቡድን አማካኝ መለኪያን እንጠቀማለን፣ እና በማይክሮ አካባቢ ውስጥ ያሉትን የሴል ዓይነቶች እንደ እያንዳንዱ ቡድን (n = 6 ቡድኖች) እንመለከታቸዋለን፤ ለአስፈላጊነቱ ምርመራ፣ ለእያንዳንዱ ሜታቦላይት ሶስት ተደጋጋሚ መለኪያዎችን አድርገናል። የተሳሳተ መባዛትን ለማስወገድ፣ ታካሚው በሊማ ዲዛይን ውስጥ እንደ እንቅፋት ተካትቷል። በተለያዩ ታካሚዎች መካከል ያለውን የሜታቦላይት ልዩነት ለመፈተሽ፣ የሊማ ሞዴሉን ታካሚዎችን ጨምሮ በተወሰነ መንገድ አስተካክለናል። በሴል አይነት እና በፓድጅ <0.05 ማይክሮ አካባቢ መካከል ያለውን አስቀድሞ የተገለጸውን ንፅፅር አስፈላጊነት (ቤንጃሚኒ-ሆችበርግ ማስተካከያ) እናሳያለን።
የሚልቴንዪ የሞተ ሴል ማስወገጃ ኪት (>80% ሕያውነት) በመጠቀም የኃይል ማበልጸጊያ ከተደረገ በኋላ፣ በጠቅላላ በሕይወት በተቀዘቀዙ አስሲቶች እና በቲሞር ናሙናዎች ላይ ባለ 10x 5′ጂን አገላለጽ ፕሮቶኮል በመጠቀም ነጠላ-ሴል ትራንስክሪፕቶሜ ቅደም ተከተል ተካሂዷል። ከአንድ የቲሞር ናሙና ዝቅተኛ የመኖር አቅም እንዳይካተት ቢከለክልም ተመሳሳይ ዕጢዎች እና አስሲቶች ያሏቸው አምስት ጉዳዮች ተተነተኑ። በርካታ የታካሚዎችን ምርጫ ለማሳካት፣ የእያንዳንዱን ታካሚ ናሙናዎች በ10x የክሮሚየም መቆጣጠሪያ መስመሮች ላይ አጣምረን አስሲቶችን እና የቲሞር ቦታዎችን ለየብቻ ተንትነናል። ቅደም ተከተል [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE)፣ የኩቤክ ጂኖም፤ በአማካይ ለቲሞር እና አስሲትስ በቅደም ተከተል በአንድ ሕዋስ 73,488 እና 41,378 ንባቦች]]፣ CellSNP እና Vireo (53) ተጠቅመናል (በ CellSNP ላይ በመመስረት)። በGRCh38 የቀረበው የተለመደው የሰው ልጅ SNP (VCF) የለጋሽ ማንነት ይመደባል። የታካሚውን የጂኖታይፕ ሁኔታ (IBS) የቅርብ ማንነት (IBS) ለመገመት SNPRelate እንጠቀማለን፣ እንደ ዱፕሌክስ የተለዩ ሴሎችን እና በአሲትስ እና በቲሞር ናሙናዎች መካከል የሚዛመዱ ለጋሾችን ሳያካትት (54)። በዚህ ተግባር መሠረት፣ በቲሞር እና በአሲትስ ውስጥ በብዛት የሴል ውክልና ያላቸው ሶስት ጉዳዮችን ለታችኛው ትንተና አድርገናል። በስካተር (55) እና በስክራን (56) ባዮኮንዳክተር ማሸጊያ ውስጥ የጅምላ ማጣሪያ ደረጃ ካደረግን በኋላ፣ ይህ 6975 ሴሎችን (2792 እና 4183 ሴሎችን ከቲሞር እና ከአሲትስ በቅደም ተከተል) አስገኝቷል። በጃካርድ ርቀት ላይ በመመስረት የተጋሩ የቅርብ ጎረቤት አውታረ መረብ (SNN) የአይግራፍ (57) ሉቫይን ክላስተር እንጠቀማለን በክላስተር ሴሎች በአገላለጽ። ክላስተሮቹ በእጅ በማርከር ጂን አገላለጽ ላይ ተመስርተው ወደ ተተኪ የሴል ዓይነቶች ተገልጸዋል እና በ t-SNE ታይተዋል። ሳይቶቶክሲክ ቲ ሴሎች የሚገለጹት በCD8A እና GZMA አገላለጽ ነው፣ ዝቅተኛ የራይቦሶም ፕሮቲን አገላለጽ ያላቸውን ንዑስ ክላስተሮች ሳይጨምር። የታተመውን የኢዛር እና ሌሎች (16) መረጃ አግኝተናል፣ ይህም የt-SNE መክተቻን ጨምሮ፣ የበሽታ መከላከያ ሴል ማርከሮች እና የNNMT አገላለጽ መካከል ያለውን አገላለጽ መደራረብ ሊቆጣጠር ይችላል።
ፒቢኤምሲ ከሉኮሳይት መለየት ምርቶች (STEMCELL Technologies) በፊኮል ግራዲየንት ጥግግት ሴንትሪፉጌሽን ተለይቷል። የሲዲ3+ ሴሎች ከፒቢኤምሲ ሲዲ3 ዶቃዎችን (ሚልቴንዪን) በመጠቀም ተለይተዋል። ኤምኤንኤ በሚኖርበት ወይም በሌለበት ጊዜ፣ የሲዲ3+ ሴሎች በፕሌት-ታሰረ CD3 (5μg/ml)፣ በሚሟሟ CD28 (3μg/ml) እና IL-2 (300 U/ml፤ ፕሮሉኪን) ገብተዋል። በማስፋፋት የመጨረሻ ቀን፣ ሕያውነት (Fixable Viability Dye eFluor450፣ eBioscience) እና ፕሮብሌሽን (123count eBeads፣ Thermo Fisher Scientific) በፍሰት ሳይቶሜትሪ ተገምግመዋል። የPMA (20 ng/ml) እና ionomycin (1 μg/ml) ሴሎችን ከጎልጊስቶፕ ጋር ለ4 ሰዓታት በማነቃቃት የኢንፌክተር ተግባርን ይገምግሙ፣ እና CD8-PerCP (RPA-T8፣ BioLegend)፣ CD4-AF700 (RPA-T4)፣ BioLegend) እና TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11፣ BD) ይከታተሉ። የqPCR እና የChiIP ሴሎችን በPMA (20 ng/ml) እና ionomycin (1 μg/ml) ለ4 ሰዓታት ያነቃቁ። የELISA ሱፐርናታንት ከማነቃቂያው በፊት እና በኋላ በPMA (20 ng/ml) እና ionomycin (1 μg/ml) ለ4 ሰዓታት ተሰብስቧል።
አር ኤን ኤይ ፕላስ ሚኒ ኪት (QIAGEN) በመጠቀም አር ኤን ኤ ለመለየት የአምራቹን ፕሮቶኮል ይከተሉ። ናሙናውን ለማዋሃድ QIAshredder (QIAGEN) ይጠቀሙ። ከፍተኛ አቅም ያለው አር ኤን ኤ ወደ cDNA ኪት (Thermo Fisher Scientific) በመጠቀም ኮምፓኒቲቭ ዲ ኤን ኤ (cDNA) ለማዋሃድ ይጠቀሙ። የጂን አገላለጽን (እንደ አምራቹ ፕሮቶኮል) ለመለካት TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ከሚከተሉት መመርመሪያዎች ጋር ለመለካት ይጠቀሙ፡ Hs00196287_m1 (NNMT)፣ Hs00154079_m1 (AOX1)፣ Hs00427552_m1 (SLC22A1)፣ Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] እና Hs01010726_m1 (SLC22A2)። ናሙናዎቹ በStepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ላይ በማይክሮአምፕ ፈጣን የኦፕቲካል 96-well reaction ፕሌት (Applied Biosystems) ከማይክሮአምፕ ኦፕቲካል ፊልም ጋር ተካሂደዋል። ከ35 በላይ የሆነ ማንኛውም የሲቲ እሴት ከመለኪያ ገደቡ በላይ እንደሆነ ተደርጎ ይቆጠራል እና የማይታወቅ ምልክት ተደርጎበታል።
ቀደም ሲል እንደተገለጸው (58) ChIPን ያከናውኑ። ባጭሩ፣ ሴሎቹ በፎርማልዴይድ (የመጨረሻው ክምችት 1.42%) ታክመዋል እና በክፍል ሙቀት ለ10 ደቂቃዎች ታክመዋል። ተጨማሪ የማበጥ ቋት (25 mM Hepes፣ 1.5 mM MgCl2፣ 10 mM KCl እና 0.1% NP-40) በበረዶ ላይ ለ10 ደቂቃዎች ይጠቀሙ፣ ከዚያም እንደተገለጸው (58) በ immunoprecipitation buffer ውስጥ እንደገና ያቆዩ። ከዚያም ናሙናው በሚከተሉት ዑደቶች ተለጠፈ፡ 10 ዑደቶች (20 1-ሰከንድ ምቶች) እና የ40 ሰከንዶች የማይንቀሳቀስ ጊዜ። የቺአይፒ-ደረጃ ኢሚውኖግሎቡሊን G (የሴል ምልክት ቴክኖሎጂ፤ 1μl)፣ ሂስቶን H3 (የሴል ምልክት ቴክኖሎጂ፤ 3μl)፣ NFAT (Invitrogen፤ 3μl) እና SP1 (የሴል ምልክት ቴክኖሎጂ፤ 3μl) ፀረ እንግዳ አካላትን በአንድ ሌሊት በ4°CC በማወዛወዝ ያመነጫሉ። ፕሮቲን ኤ ዶቃዎችን (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) በ4°ሴ የሙቀት መጠን ለ1 ሰዓት በቀስታ በማወዛወዝ ያብስሉት፣ ከዚያም ዲ ኤን ኤውን ለማበልጸግ የቼሌክስ ዶቃዎችን (ባዮ-ራድ) ይጠቀሙ እና ፕሮቲን ለመፈጨት ፕሮቲንሴዝ ኬ (ቴርሞ ፊሸር) ይጠቀሙ። የTNFα ፕሮሞተር በPCR ተገኝቷል፡ ወደፊት፣ GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT፤ በተቃራኒው፣ GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ምርት)። ምስሎቹ በImage Lab (Bio-Rad) የተመረቱ እና ImageJ ሶፍትዌርን በመጠቀም የተለኩ ናቸው።
የሴል ባህል ሱፐርናታንት ከላይ እንደተገለጸው ተሰብስቧል። ውሳኔው የተከናወነው በአምራቹ የሰው TNFα ELISA ኪት (Invitrogen)፣ የሰው IL-2 ELISA ኪት (Invitrogen) እና የሰው IFN-γ ELISA ኪት (Abcam) ሂደቶች መሠረት ነው። በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት ሱፐርናታንቱ TNFα እና IL-2ን ለመለየት 1:100 እና IFN-γን ለመለየት 1:3 ተቀልጧል። በ450 nm ውስጥ የመምጠጥ መጠንን ለመለካት EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ይጠቀሙ።
ፒቢኤምሲ ከሉኮሳይት መለየት ምርቶች (STEMCELL Technologies) በፊኮል ግራዲየንት ጥግግት ሴንትሪፉጌሽን ተለይቷል። የሲዲ3+ ሴሎች ከፒቢኤምሲ ሲዲ3 ዶቃዎችን (ሚልቴንዪን) በመጠቀም ተለይተዋል። ኤምኤንኤ በሚኖርበት ወይም በሌለበት ጊዜ፣ የሲዲ3+ ሴሎች በፕሌት-ታሰረ CD3 (5μg/ml)፣ በሚሟሟ CD28 (3μg/ml) እና IL-2 (300 U/ml፤ ፕሮሉኪን) ለ3 ቀናት ገቢር ተደርገዋል። ከ3 ቀናት በኋላ፣ ሴሎቹ ተሰብስበው በ0.9% ሳላይን ታጥበው፣ እና ፔሌቱ ቀዝቅዟል። የሴል ብዛት በ123 count eBeads በመጠቀም በፍሰት ሳይቶሜትሪ (ሳይቴክ አውሮራ፤ 3L-16V-14B-8R ውቅር) ተከናውኗል።
ከላይ እንደተገለጸው የማውጣት ሜታቦላይቶች። የደረቀው ማውጣት በ4000 የሴል ተመጣጣኝ/μl ክምችት እንደገና ተቀላቅሏል። ናሙናውን በተገላቢጦሽ ደረጃ ክሮማቶግራፊ (1290 Infinity II፣ Agilent Technologies፣ Santa Clara፣ CA) እና CORTECS T3 አምድ (2.1×150 ሚሜ፣ የቅንጣት መጠን 1.6-μm፣ የቀዳዳ መጠን 120-Å፤ #186008500፣ ዋተርስ) ይተንትኑ። የዋልታ ብዛት ስፔክትሮሜትር (6470፣ Agilent)፣ በዚህ ውስጥ ኤሌክትሮስፕሬይ አዮኔዜሽን በአዎንታዊ ሁነታ ይሰራል። የሞባይል ደረጃ A 0.1% ፎርሚክ አሲድ (በH2O) ነው፣ የሞባይል ደረጃ B 90% አሴቶኒትሪል፣ 0.1% ፎርሚክ አሲድ ነው። የLC ቅልመት ለ100% A ከ0 እስከ 2 ደቂቃዎች፣ ለ99% B ከ2 እስከ 7.1 ደቂቃዎች እና ለ99% B ከ7.1 እስከ 8 ደቂቃዎች ነው። ከዚያም አምዱን ከሞባይል ምዕራፍ A ጋር ለ3 ደቂቃዎች በ0.6 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ የፍሰት መጠን እንደገና ያስተካክሉት። የፍሰት መጠኑ 0.4 ሚሊ ሊትር/ደቂቃ ሲሆን የአምድ ክፍሉ ደግሞ እስከ 50°ሴ ይሞቃል። የMNA ንፁህ የኬሚካል ደረጃ (M320995፣ የቶሮንቶ ሪሰርች ኬሚካል ኩባንያ፣ ሰሜን ዮርክ፣ ኦንታሪዮ፣ ካናዳ) በመጠቀም የማቆያ ጊዜ (RT) እና ትራንስፎርሜሽን (RT = 0.882 ደቂቃዎች፣ ትራንስፎርሜሽን 1 = 137→94.1፣ ትራንስፎርሜሽን 2 = 137→92፣ ልወጣ 3 = 137→78) ይጠቀሙ። ሦስቱም ሽግግሮች በትክክለኛው የማቆያ ጊዜ ሲከሰቱ፣ ሽግግር 1 ልዩነቱን ለማረጋገጥ ለቁጥር ጥቅም ላይ ይውላል። የኤምኤንኤ (የቶሮንቶ ምርምር ኬሚካል ኩባንያ) መደበኛ ኩርባ የተፈጠረው በስድስት ተከታታይ የአክሲዮን መፍትሄ (1 ሚ.ግ/ሚሊ) በመሟሟት ሲሆን በቅደም ተከተል 0.1፣ 1.0፣ 10 እና 100 ng/ሚሊ እና 1.0 እና 10 μg/ሚሊ ፈሳሽ ደረጃዎችን ለማግኘት ነው። የመለየት ገደቡ 1 ng/ሚሊ ሲሆን መስመራዊ ምላሹም በ10 ng/ሚሊ እና 10 μg/ሚሊ መካከል ነው። እያንዳንዱ ሁለት ማይክሮሊተር የናሙና እና የስታንዳርድ መርፌ ለኤልሲ/ኤምኤስ ትንተና ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና የትንታኔ መድረኩን መረጋጋት ለማረጋገጥ በየስምንት መርፌዎች የተደባለቀ የጥራት ቁጥጥር ናሙና ይካሄዳል። የሁሉም በኤምኤንኤ የታከሙ የሴል ናሙናዎች የኤምኤንኤ ምላሾች በሙከራው መስመራዊ ክልል ውስጥ ነበሩ። የውሂብ ትንተና የተከናወነው በማሳያ ሀንተር የቁጥር ትንተና ሶፍትዌር (v9.0፣ Agilent) በመጠቀም ነው።
ሁለተኛው ትውልድ αFR-CAR ግንባታ የተወሰደው ከሶንግ እና ሌሎች (59) ነው። ባጭሩ፣ ግንባታው የሚከተሉትን ይዘቶች ይዟል፡- CD8a መሪ ቅደም ተከተል፣ የሰው αFR-ተኮር ነጠላ-ሰንሰለት ተለዋዋጭ ቁራጭ፣ CD8a መገጣጠሚያ እና ትራንስሜምብራን ክልል፣ CD27 ውስጠ-ህዋስ ጎራ እና CD3z ውስጠ-ህዋስ ጎራ። የተሟላው የCAR ቅደም ተከተል በGenScript የተዋሃደ ሲሆን ከዚያም የትራንስዱክሽን ቅልጥፍናን ለመገምገም ጥቅም ላይ የዋለውን የGFP አገላለጽ ካሴት ወደ ሁለተኛው ትውልድ የሌንቲቫይራል አገላለጽ ቬክተር ተቀድቷል።
ሌንቲቫይረስ የሚመረተው በHEK293T ሴሎች ትራንስፌክሽን [የአሜሪካ ዓይነት ባህል ስብስብ (ATCC)) ነው፤ 10% የፅንስ የከብት ሴረም (FBS) እና 1% PenStrep የያዘውን በዱልቤኮ የተሻሻለው የኢግል መካከለኛ ውስጥ ይበቅላል፣ እና ጥቅም ላይ የዋለው የCAR-GFP ቬክተር እና የማሸጊያ ፕላዝሚዶች (psPAX2 እና pMD2.G፣ Adgene) የሊፕፌክሽን አሚን (ሲግማ-አልድሪች) ይጠቀማሉ። ቫይረሱን የያዘው ሱፐርናታንት ከትራንስፌክሽን በኋላ ከ48 እና 72 ሰዓታት በኋላ ተሰብስቦ፣ ተጣርቶ እና በአልትራ ሴንትሪፉጌሽን ተጠናክሯል። የተከማቸውን የቫይረስ ሱፐርናታንት በ-80°ሴ እስኪተላለፍ ድረስ ያስቀምጡ።
ፒቢኤምሲ ከጤናማ የለጋሽ ሉኮሳይት መለያያ ምርቶች (STEMCELL Technologies) በFicoll gradient density centrifugation ይለያሉ። የሲዲ8+ ሴሎችን ከPBMC ለመለየት ፖዘቲቭ ምርጫ CD8 ማይክሮቤድስ (ሚልቴንዪ) ይጠቀሙ። በTransAct (ሚልቴንዪ) እና በTexMACS መካከለኛ [ሚልቴንዪ፤ በ3% ሙቀት-የማይነቃነቅ የሰው ሴረም፣ 1% PenStrep እና IL-2 (300 U/ml) የተጨመረ ቲ ሴሎችን ያነቃቁ። ከተነቃነቀ ከሃያ አራት ሰዓታት በኋላ፣ ቲ ሴሎች በሌንቲቫይረስ (በ106 ሴሎች 10 μl የተጠናከረ የቫይረስ ሱፐርናታንት) ተወስደዋል። በሳይቴክ አውሮራ ላይ ከተተላለፈ ከ1 እስከ 3 ቀናት በኋላ (በFSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter)፣ Singlet፣ GFP+ ላይ)፣ የሴሎቹን የGFP አገላለጽ ይገመግማሉ፣ ቢያንስ 30% የሆነ የትራንስዱክሽን ውጤታማነትን ያሳያሉ።
የCAR-T ሴሎች ለ24 ሰዓታት በኢሚውኖኩልት (STEMCELL Technologies፤ በ1% PenStrep የተጨመሩ) በሚከተሉት ሁኔታዎች ስር ተክለዋል፡- ያልታከሙ፣ በ250 μM አዴኖሲን ወይም በ10 mM MNA የታከሙ። ከቅድመ ህክምና በኋላ፣ የCAR-T ሴሎች በPBS ታጥበው ከ20,000 SK-OV-3 ሴሎች ጋር ተጣምረዋል [ATCC፤ በማኮይ 5A መካከለኛ (ሲግማ-አልድሪች) በ10% FBS እና 1% PenStrep ተጨምረዋል፡ የ1 ተፅዕኖ ፈጣሪ እስከ ኢላማ ጥምርታ በተጨመረው የኢሚውኖኩልት መካከለኛ በሦስት እጥፍ ጨምሯል። የSK-OV-3 ሴሎች እና በዲጂታል ሳፖኒን (0.5mg/ml፤ ሲግማ-አልድሪች) የተለበጡ የSK-OV-3 ሴሎች በቅደም ተከተል እንደ አሉታዊ እና አወንታዊ መቆጣጠሪያዎች ጥቅም ላይ ውለዋል። ከ24 ሰዓታት የጋራ እርባታ በኋላ፣ የላይኛው ክፍል ተሰብስቦ የላክቶስ ዴሃይድሮጅኔዝ (LDH) በአምራቹ መመሪያ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) መሰረት ተለክቷል። የLDH ሱፐርናታንት በLDH ቋት ውስጥ 1:50 ተበረዘ። የግድያ መቶኛ በሚከተለው ቀመር ተለክቷል፡ የመግደል መቶኛ = የማስተካከያ መቶኛ / ከፍተኛ የግድያ መጠን x 100%፣ የማስተካከያ መቶኛ = የጋራ ባህል-ቲ ሴሎች ብቻ፣ እና ከፍተኛ የግድያ መጠን = አዎንታዊ ቁጥጥር-አሉታዊ ቁጥጥር።
በጽሑፉ ወይም በቁሳቁሶች እና ዘዴዎች ላይ እንደተገለጸው፣ ለስታቲስቲክስ ትንተና GraphPad Prism 8፣ Microsoft Excel ወይም R v3.6.0 ይጠቀሙ። ከአንድ ታካሚ (እንደ አስሲስ እና ቲሞር ያሉ) በርካታ ናሙናዎች ከተሰበሰቡ፣ የተጣመረ የቲ ምርመራ እንጠቀማለን ወይም ታካሚውን እንደ አስፈላጊነቱ በመስመር ወይም በአጠቃላይ ሞዴል ውስጥ እንደ የዘፈቀደ ውጤት እናካትታለን። ለሜታቦሎሚክስ ትንተና፣ የአስፈላጊነት ምርመራው በሦስት እጥፍ ይከናወናል።
ለዚህ ጽሑፍ ተጨማሪ ቁሳቁሶችን ለማግኘት እባክዎ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ን ይመልከቱ።
ይህ በCreative Commons Attribution-Non-Commercial License ውል መሠረት የተሰራጨ ክፍት መዳረሻ ያለው ጽሑፍ ሲሆን የመጨረሻው አጠቃቀም ለንግድ ጥቅም ካልሆነ እና የመጀመሪያው ስራ ትክክል ከሆነ በማንኛውም ሚዲያ ውስጥ መጠቀም፣ ማሰራጨት እና ማባዛት ያስችላል። ማጣቀሻ።
ማሳሰቢያ፡ የኢሜይል አድራሻዎን እንዲያቀርቡ የምንጠይቅዎት እርስዎ ለገጹ የሚመክሩት ሰው ኢሜይሉን እንዲያዩት እንደሚፈልጉ እና አይፈለጌ መልዕክት እንዳልሆነ እንዲያውቅ ብቻ ነው። ምንም አይነት የኢሜይል አድራሻዎችን አንይዝም።
ይህ ጥያቄ ጎብኚ መሆንዎን ለመፈተሽ እና በራስ-ሰር የአይፈለጌ መልዕክት ማስገባትን ለመከላከል ይጠቅማል።
ማሪሳ ኬ. ኪልጎር (ማሪሳ ኬ. ኪልጎር)፣ ሳራ ማክፐርሰን (ሳራ ማክፐርሰን)፣ ሎረን ጂ ዘካርያስ (ሎረን ጂ. ዘካርያስ)፣ አቢግያ ኢሊ አሪስ ጂ ዋትሰን (ኤች. ዋትሰን)፣ ጆን ስታግ (ጆን ስታግ)፣ ብራድ ኤች ኔልሰን (ብራድ ኤች. ኔልሰን)፣ ራልፍ ጄ. ደ ቤልርድኒ ግራር ጆንስ ዴርዲኒ ግራር ጆንስ ጂ. ጆንስ)፣ ፊንያስ ቲ.ሃሚልተን (ፊኒያስ ቲ.
ኤምኤንኤ የቲ ሴሎችን የመከላከል አቅም ለማዳከም አስተዋጽኦ ያደርጋል እንዲሁም ለሰው ልጅ ካንሰር ሕክምና ሊሆን የሚችል የበሽታ መከላከያ ኢላማን ይወክላል።
ማሪሳ ኬ. ኪልጎር (ማሪሳ ኬ. ኪልጎር)፣ ሳራ ማክፐርሰን (ሳራ ማክፐርሰን)፣ ሎረን ጂ ዘካርያስ (ሎረን ጂ. ዘካርያስ)፣ አቢግያ ኢሊ አሪስ ጂ ዋትሰን (ኤች. ዋትሰን)፣ ጆን ስታግ (ጆን ስታግ)፣ ብራድ ኤች ኔልሰን (ብራድ ኤች. ኔልሰን)፣ ራልፍ ጄ. ደ ቤልርድኒ ግራር ጆንስ ዴርዲኒ ግራር ጆንስ ጂ. ጆንስ)፣ ፊንያስ ቲ.ሃሚልተን (ፊኒያስ ቲ.
ኤምኤንኤ የቲ ሴሎችን የመከላከል አቅም ለማዳከም አስተዋጽኦ ያደርጋል እንዲሁም ለሰው ልጅ ካንሰር ሕክምና ሊሆን የሚችል የበሽታ መከላከያ ኢላማን ይወክላል።
©2021 የአሜሪካ የሳይንስ እድገት ማህበር። ሁሉም መብቶች የተጠበቁ ናቸው. AAAS የHINARI፣ AGORA፣ OARE፣ CHORUS፣ CLOCKSS፣ CrossRef እና COUNTER አጋር ነው። ScienceAdvances ISSN 2375-2548.